Medical Immunology, 2006; 5: 3-3 (más artículos en esta revista)

La estructura de IL2 obligado a las tres cadenas de la IL2 receptor de señalización y cómo se produce

BioMed Central
A Kendall Smith (kasmith@med.cornell.edu) [1]
[1] La División de Inmunología, Facultad de Medicina, Weill Medical College de Cornell University, Nueva York, NY, 10021, EE.UU.

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Resumen

La interleucina-2 y la molécula de receptor fueron los primeros de las interleucinas para ser descubierto y caracterizado a nivel molecular. Ahora después de 20 años de esfuerzo, dos grupos han logrado determinar la estructura de IL2 obligado a los dominios externos de los tres receptores de cadenas en un complejo cuaternario. ¿Qué sabemos ahora que no sabíamos antes de que esta estructura se dispone de información, y cómo estos nuevos datos nos ayudan a desarrollar nuevas terapias?

A principios del decenio de 1980, poco después de que había caracterizado la IL2 molécula como un 15,5 kDa proteína glicosilada de diversas formas [1, 2], ha purificado a homogeneidad [2], y ha descubierto y caracterizado el receptor de IL2 (IL2R) [3], Hemos convertido a tratar de determinar exactamente cómo IL2 vinculante para su receptor conduce a las señales que promueven la proliferación celular. Un enfoque de esta cuestión se referían a la determinación de las 3 dimensiones (3D) de estructuras de la molécula de IL2 y la IL2R a través de cristalografía de rayos X. Sin embargo, se tardó más de una década para nosotros y los demás a descubrir que la IL2R se compone de tres no ligados covalentemente cadenas, denominado alfa (α, CD25) [4], beta (β, CD122) [5 - 7] , Y gamma (γ, CD132) [8]. Posteriormente, como la codificación de cada cDNAs se convirtió en cadena, que comenzó a colaborar con Ian Wilson del Scripps Research Institute para tratar de determinar las estructuras de estas moléculas. Instrumental en estos experimentos fue Tom Ciardelli en Dartmouth, que construye sistemas de expresión para producir grandes cantidades de proteínas para ser utilizadas en la obtención de cristales de las moléculas, que también se utiliza en experimentos rigurosos de reducción vinculantes con los estudios que utilizaron aislado moléculas solubles del receptor.

Cualquier cosa es posible en la ciencia, pero algunas cosas que tomar mucho tiempo. De hecho, los cristales de IL2 obligado a la cadena α IL2R fueron fácilmente alcanzado tan pronto como 1989 [9], pero sigue siendo recalcitrantes a la estructura solución para muchos años. Por otra parte, el hecho de que la IL2R se compone de tres cadenas de la tarea de cristalizar las cuatro proteínas unidas entre sí sumamente difícil. Veinte años después de nuestros experimentos se iniciaron, Chris García en Stanford con su equipo de dos talentosos post doctorales, Xinquan Wang y Mathias Rickert, logró determinar la estructura de IL2 obligado a los dominios externos de las tres cadenas IL2R en un complejo cuaternario [10 ]. Chris es un antiguo postdoctorado de Ian Wilson, y que generosamente compartieron sus refinados coordina con Ian, a fin de que otros dos miembros del talento del grupo de Ian, Deborah postdoctorado Stauber y estudiante graduado Erik Debler, podría terminar la estructura de la determinación IL2/IL2R cuaternario complejas , Que también ha montado y cristalizó [11].

Antes de examinar los nuevos datos, es útil para resumir la información que hemos adquirido durante los últimos 25 años en cuanto a la forma en que el IL2/IL2R ligando / receptor de funciones complejas. IL2 en sí es una glicoproteína globular pequeño de cuatro hélices α antiparallel [12]. IL2 fue la primera citocina encontrado para mediar sus efectos a través de una superficie celular sitio de unión que cumplen todos los requisitos para ser llamado un clásico de receptores hormonales, definido inicialmente por Langely en 1878 y 1905 [13, 14]. Por lo tanto, IL2 se une a la IL2R con alta afinidad, stereospecificity, y saturability. En otras palabras, hay un número finito de sitios expresó en que los linfocitos activados son capaces de unirse sólo IL2, de entre todos los demás citoquinas. Además, IL2 señales de la celda en la misma bajas concentraciones que llevan a unirse a la IL2R en el estado de equilibrio, por lo tanto, cumplir el requisito que la verdadera señal de los receptores debe una respuesta fisiológica después de obligar a la ligando a concentraciones fisiológicas. La cuestión que tenemos ante nosotros es la forma en que estos clásicos del receptor de características se crean a nivel molecular.

La alta afinidad de la IL2R (K d = 10 -11 M) el resultado de una rápida tasa de asociación aportados por la cadena-α (k = a 10 7 M -1 s -1), combinado con una relativamente lenta tasa de disociación (k off = 10 -4 seg -1) aportados por la β y γ cadenas [15, 16]. En consecuencia, a partir de esta información, se llegó a la conclusión de que distintas áreas de la IL2 molécula se unen a cada una de las tres cadenas del receptor. Por otra parte, también se constató que la cadena α no participa en la señalización, mientras que la β y γ cadenas son necesarias para la señalización [17, 18]. Uno de los aspectos desconcertantes de la RAE de IL2/IL2R vinculante fue la contribución de la cadena γ, en la medida en que se descubrió que la cadena γ es un componente de varios otros receptores de citoquinas, incluyendo la IL4R, IL7R, IL9R, IL15R, y la IL21R [19 - 21]. Exactamente cómo cada uno de estos diferentes, aunque similares, citoquinas podría obligar a la misma cadena γ sigue siendo un enigma.

Una serie de informes de la Ciardelli grupo en Dartmouth durante la década de 1990 el uso aislado del receptor de superficie y las cadenas de Plasmon Resonance (SPR) disecados las complejas relaciones entre IL2 y los tres receptores de las cadenas [22 - 27]]. Sus datos apoyaron un modelo en el que la α y β cadenas de pre-asociados en la superficie celular para formar un pseudo-gran afinidad con un sitio más rápido en una tasa más lenta y fuera de ritmo más bien de la persona subunidades. Por lo tanto, la eficiencia del ligando de captura se ve facilitada por la formación de este α y β heterodimer cadena. Por otra parte, estos datos son consistentes con la inducción IL2-α de la cadena de expresión [28], lo que se traduce en un 10-20 veces superiores a cadena vs α β cadena de expresión, lo que favorece la formación de un α y β heterodimer en la la superficie celular a través de la ley de acción de masas.

Además, sus datos se indica que la señalización sólo se produce con posterioridad a la contratación de la cadena γ para el IL2 / α y β trimeric complejo [25, 27]. A pesar de que la cadena γ es sólo débilmente capaz de interactuar con IL2 por sí solo (K d> 700 μ M), cuando reclutados para sumarse al heterotrimer de IL2 obligado a la α y β heterodimer, la cadena γ reduce el fuera de la tasa de obligado ligando sustancialmente de la formación de un estable cuaternario ligando / receptor complejo. De este modo, el modelo predijo que el mecanismo de control de la duración de señalización del receptor es la tasa de ligando / receptor de la internalización (t 1 / 2 = 15 minutos), en lugar de disociación ligando (t 1 / 2 = 45 minutos), tal como lo había propuesto inicialmente [29]. Esto es importante, dado que la célula cuenta el número total de IL2Rs activado, que es responsable de una señalización quantal (todo o nada) la respuesta celular [30 - 32].

Una vista adicional de IL2 cómo interactúa con los receptores de las tres cadenas fue informado por García del grupo de titulación isotérmica mediante calorimetría y Multi-Angulo dispersión de luz [33]. Incluso en ausencia de IL2, se dieron de baja afinidad de unión de la α y β cadenas (K d = 278 nm), apoyando así la Ciardelli SPR estudios. Por otra parte, similar a Ciardelli resultados de la SPR, no era vinculante entre la α y γ o las cadenas β y γ cadenas en ausencia de IL2. Por otra parte, similar a la anterior IL2 vinculante estudios, una clara afinidad de IL2 aislados de las cadenas α (K d = 10 nM) y aisladas cadenas β (K d = 144 nm), pero poca o ninguna afinidad para IL2 vinculante para las cadenas γ aislado fue encuentra el uso de estas técnicas de termodinámica. Estos investigadores interpretarse como sus datos de conformidad con IL2 vinculante rápidamente en primer lugar a las cadenas α aisladas, seguido por la α-IL2 está obligado por estabilizado vinculante para las cadenas β aisladas. Por otra parte, sus datos son también compatibles con IL2 unión a una preformados α y β dimeric complejo en la forma propuesta por Ciardelli. Todos los datos son coherentes con el IL2 / α y β trimeric complejo vinculante para la cadena γ para formar el complejo final de señalización.

La cristalización de IL2 obligado a los dominios externos de los tres receptores de cadenas en un complejo cuaternario [10, 11] reveló que los sitios en IL2 que interactúan con las tres cadenas de la IL2R no se superponen, con la excepción de un pequeño pero significativo región, como predijo antes de la SPR vinculante y estudios. El 4-hélice conjunto de IL2 se fijará entre el codo regiones del β y γ cadenas. La IL2 molécula es decisiva celebrada entre los receptores de estas dos cadenas, que convergen para formar una forma de Y, con IL2 obligado en la bifurcación de la Y. Por el contrario, al otro lado de la IL2 molécula se une a la cadena α, que el equipo de García ha previamente trazada de IL2 binario / α cadena de cristales [34]. También cabe destacar que la cadena α en sí no pueden contactar con el β o γ cadenas en la estructura cristalina.

La estructura cristalina esencialmente no ayuda a discriminar si IL2 se une primero a la cadena α solos o con un pre α y β heterodimer. Sin embargo, el pseudo-alta afinidad de la IL2 / α y β trimeric complejo (es decir, K d ~ 300 horas) indica claramente que la trimeric complejo es más estable que cualquiera de los dos IL2 obligado a la cadena α solo (K d = 10 nM) o β a la cadena de solo (K d = 450 nm), como se indica por Ciardelli de datos. En cualquier caso, el IL2 / α y β trimer entonces contratar la cadena γ en el cuaternario complejas capaces de señalización, que se ve facilitado por el gran sitio de unión compuesto en el IL2 determinada cadena β γ para la cadena. Dado que sólo unos pocos residuos de IL2 interactuar con β y γ cadenas, unión de IL2 puede inducir cambios conformacionales en la cadena β que seguir promoviendo la contratación de la cadena γ. Esta interpretación es coherente con los datos obtenidos por el grupo utilizando Ciardelli SPR [27]. Por otra parte, la superficie de IL2-γ cadena de contacto es la más pequeña de las tres cadenas del receptor (970 Å 2), mientras que la superficie de la β-γ cadena de contacto es mayor (1640 Å 2). En consecuencia, la cadena γ puede servir como una subunidad del receptor para muchos similares pero diferentes citocinas por una citoquina que dependen de unión de otras subunidades del receptor para la cadena γ, en lugar de la unión de citocinas a la cadena γ. Además, estos datos proporcionan apoyo para la búsqueda de inhibidores de la cadena de β-γ cadena de interacción como nuevos inmunosupresores.

Toda esta información estructural es totalmente coherente con lo que sabemos sobre IL2R señalización, en la que frente al citoplasma de dominio de la cadena β es complejo JAK1 con la tirosina quinasa, mientras que la cadena γ dominio citoplásmico es complejo con el JAK3 kinasa [18]. Por lo tanto, sólo cuando IL2 vinculante trae los dominios externos de los receptores de estas dos cadenas en estrecha proximidad, la señalización puede ocurrir transeuropeas de fosforilación de sus dominios frente al citoplasma. Además, como se destacó por Ciardelli datos del REP y de García energética de datos, estos datos estructurales indican que el cuaternario ligando / receptor complejo es muy estable y de señalización se mantendrá hasta el receptor con el ligando es obligado interiorizado y degradados.

En el contexto de todos estos nuevos datos estructurales, un informe anterior de Marrack del grupo [35] es sorprendente, ya que puso de manifiesto que la inyección de ratones con anticuerpos monoclonales (AcM) reacciona con IL2 que bloquean la IL2/IL2R α cadena de interacción , Lo cual inhibe la IL2-T promueve la proliferación celular in vitro, en realidad aumentó el número de la proliferación de linfocitos T CD8 + en vivo, en lugar de disminuir como se esperaba. Estos autores interpretan sus resultados como muestra de que IL2 funcionado realmente matar a linfocitos T CD8 + en vivo. Por supuesto, esta interpretación se basa en el supuesto de que el anti-IL2 debería haber bloqueado IL2-α cadena vinculante y la activación de las células T in vivo, como lo hizo in vitro.

Ahora, un informe más reciente de Sprent del grupo [36] regresó a esta paradoja, es decir, que la proliferación de linfocitos T CD8 + con un fenotipo de memoria (que se define por una alta expresión de la cadena β IL2R, pero de bajo o inexistente nivel de la IL2R α la cadena), se puede aumentar mediante la inyección de IL2, ya sea propio o de un IL2-reactiva, inhibitoria MAB. Puesto que la interpretación de Marrack del grupo fue counterintuitive, Sprent repetido sus experimentos, y también encontró un aumento en los linfocitos T CD8 + utilizando el mismo MAB. Sin embargo, además, usaron IL2 gen suprimido ratones, y encontró que el mayor efecto proliferativo de los anti-IL2 tratamiento fue abolida en esta configuración.

En consecuencia, entonces la hipótesis de que tal vez el IL2-reactiva MAB funcionado realmente a aumentar la actividad biológica de IL2 endógeno a través de la formación de complejos inmunes con IL2, con lo que la preservación y el fomento IL2 actividad. Esto fue en realidad resultan ser el caso, y la administración simultánea de IL2 y IL2-reactiva MAB dado lugar a un aumento espectacular (> 100 veces) en el número total de linfocitos T CD8 + y células NK, lo cual también expresar tanto la cadena β y γ la cadena de la IL2R.

Sobre la base de estos datos y otros, Sprent llegó a la conclusión de que los estimulantes IL2-reactiva MAB se une a un sitio en IL2 que occludes su unión a la cadena α, pero no vinculante perjudicar a la cadena β. En otras palabras, el IL2-reactiva AcMo toma el lugar de la cadena α sobre las células in vivo, y presenta a la IL2 β y γ cadenas, estimulando así la proliferación, en particular la memoria de linfocitos T CD8 + que ya expresar la β / γ cadenas como parte de la IL15R. A la luz de los nuevos datos estructurales, Sprent de la interpretación hace perfecto sentido. Además, como fragmentos Fab 2 de la IL2/mAb complejo eran ineficaces en la promoción en vivo la proliferación de las células T, estas conclusiones son coherentes con IL2/mAb complejos inmunes a la sustitución de vehículos blindados para la célula determinada cadena α sobre las células T que actúa como un ligando transportista y / o capturer, según lo sugerido por Stauber et. al. [11].

Si una investigación más a fondo apoya estas conclusiones, la utilización de complejos inmunes de citocinas como estimulantes inmunes podría muy bien mejorar notablemente immunostimultatory terapia, en que la citoquina complejos inmunes han mejorado mucho en vivo vida media en comparación con citocinas solo. Por ejemplo, la vida media de IL2 administrado por vía intravenosa es sólo ~ 10 minutos debido a la distribución en el cuerpo total de espacio extracelular, que es grande, ~ 15 L en un promedio de tamaño adulto. Posteriormente, IL2 es metabolizada por el riñón con un medio tiempo de ~ 2,5 horas. En comparación in vivo la vida media de Ig administrados se mide en varios días si no semanas [37].

Aún izquierda oscuros en relación con la función del cuaternario IL2/IL2R compleja es la exacta reordenamientos moleculares que se producen en el intracitoplasmática de dominios de la IL2R cadenas, especialmente las β y γ cadenas, que en estos dominios aún no se han cristalizado. Hasta el momento, todos los esfuerzos hasta la fecha para cristalizar estos dominios han sido infructuosos, y puede indicar que las colas frente al citoplasma de no adoptar una permanente bien definida la estructura, que es un requisito previo para la cristalización. Sin embargo, otros dos nuevos informes sobre la señalización de intracitoplasmática de dominios a través de la JAKS a STAT5a / b recientemente han puesto de relieve la importancia de estos dominios intracelulares [38, 39].

Todas las citocinas que utilizan la IL2R común cadena γ (γ c), han resultado ser crítica tanto para su función en la periferia después de la maduración, y para el desarrollo linfoide también. En particular, las mutaciones de la cadena de IL7R α, γ o la cadena c, o sus asociados quinasa, JAK3, son las principales causas de la inmunodeficiencia combinada severa (SCID) [18]. Tres vías de señalización son conocidos por ser activado a través de la cadena γ c, el barrio de Ras / Raf / MAPK vía [40], la vía PI3K/Akt [41], y la vía STAT5 [42]. Todas las pruebas se refirió a la STAT5a / b moléculas como el principal signalers de desarrollo de linfocitos, así como un elemento crítico para promover la progresión del ciclo celular de los linfocitos maduros. Sin embargo, la importancia de STAT5a / b en la transmisión de señales de IL7Rs para el desarrollo de los linfocitos se convirtió en polémica, principalmente porque los ratones que tenían una supresión de la N-terminal del exón STAT5a / b moléculas relativamente normal desarrollo de linfocitos [43]. Sin embargo, estos ratones aún expresado su truncado en parte funcional y STAT5 proteína.

Ahora, utilizando ratones que habían total de supresiones de todo el STAT5a / b loci, John O'Shea del grupo [38] y Veronika Sexl del grupo [39] han informado de que el fenotipo de estos ratones es como se esperaba, inmunodeficiencia combinada severa. Además, Sexl del grupo informa de que estos ratones no son susceptibles de transformación maligna de la kinasa Src familia, Abelson. Este último hallazgo es muy importante, ya que proporciona el eslabón perdido entre la familia de quinasas Src y la transformación que ha eludido a los investigadores desde hace más de 25 años. Además, estos datos son coherentes con las conocidas funciones de STAT5, para activar el programa para la progresión del ciclo celular a través de G 1 a fase S, principalmente mediante la promoción de la expresión y la actividad de la G 1 D 2 y 3 de tipo cyclins [42 ]. En este sentido, cabe destacar que v-src, que phosphorylates STAT3 constitutivamente, recientemente se ha encontrado capaz de transformar las células mediante la activación de la expresión de la ciclina D 1 [44]. Ahora es previsible que la identificación de inhibidores de STAT puede ser muy eficaz contra el cáncer agentes, y tal vez los agentes inmunosupresores como así.