Journal of Occupational Medicine and Toxicology (London, England), 2006; 1: 13-13 (más artículos en esta revista)

Trimellitic anhídrido-conjugado con albúmina sérica activa macrófagos alveolares de rata in vitro

BioMed Central
Dingena L Valstar (ingevalstar@hotmail.com) [1], Marcel Un Schijf (Schijf@voeding.tno.nl) [1], Erietta Stelekati (estelekati@fz-borstel.de) [1], Frans P Nijkamp (FPNijkamp @ pharm.uu.nl) [1], Nanne Bloksma (MABloksma@pharm.uu.nl) [1], Paul AJ Henricks (PAJHenricks@pharm.uu.nl) [1]
[1] Fisiopatología y Farmacología, Utrecht Instituto de Ciencias Farmacéuticas, Facultad de Ciencias, Universidad de Utrecht, Utrecht, Países Bajos
[2] Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Utrecht, Utrecht, Países Bajos

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Resumen
Fondo

La exposición ocupacional a suspensión en el aire de bajo peso molecular productos químicos, como el anhídrido trimellitic (TMA), pueden provocar asma ocupacional. Macrófagos alveolares (AMS) se encuentran entre las primeras células de encuentro para estos compuestos se inhala y se muestra anteriormente para influir en la TMA-asma inducida por síntomas similares a la rata Brown Noruega. TMA es un hapteno que se unen a las proteínas endógenas a la entrada del cuerpo. Por lo tanto, en el presente estudio se determinó si la TMA y TMA conjugado con albúmina sérica inducida por la producción de los macrófagos mediadores de óxido nítrico (NO), factor de necrosis tumoral (TNF), y la interleukina 6 (IL-6) in vitro utilizando la rata AM NR8383 línea celular de acompañamiento y primaria derivados de la TMA-sensibilizado y ingenuo Brown Noruega ratas.

Métodos

Las células fueron incubadas con diferentes concentraciones de TMA, TMA conjugado con albúmina sérica bovina (BSA), y la BSA como control durante 24 h la cultura y el sobrenadante se analizó el contenido de mediador.

Resultados

TMA por sí sola no era capaz de inducir la producción de mediadores de células NR8383 y primaria de acompañamiento de sensibilizado y simulacro de ratas tratadas. TMA-BSA, por el contrario, la relación dosis-dependiente estimulado la producción de NO, TNF y IL-6 por NR8383 células y de NO y TNF, pero no IL-6, de primaria independiente de acompañamiento de sensibilización.

Conclusión

Los resultados sugieren que aunque la TMA es un compuesto muy reactivo, a una conjugación adecuada de proteínas es necesario para inducir la producción de mediador de acompañamiento. Por otra parte, la observación de que los efectos de la TMA-BSA son independientes de sensibilización sugiere la participación de una inmunidad no específica del receptor. En el debate se argumenta que un macrófago scavenger receptor es un candidato probable.

Fondo

Trimellitic anhídrido (TMA) es un reactivo de bajo peso molecular (Lmw) producto químico utilizado en la fabricación de pinturas, agentes de curado epoxi, tintas de imprenta y de vinilo y plastificantes se sabe que causan asma ocupacional se caracteriza por obstrucción al flujo aéreo, inflamación de las vías respiratorias y no específicos bronquial hiperreactividad [1 - 3]. El desarrollo de esta enfermedad requiere alérgica provocada por sensibilización dérmica o respiratoria exposición a la TMA y luego su unión a proteínas [4]. Estos así constituida TMA-conjugados de proteína será considerado por el antígeno de células presentadoras, que se transportan a los ganglios linfáticos regionales, y se presentó a la TMA-células T específicas derivadas de las células T de memoria y la producción de la TMA-anticuerpos específicos IgE. Estos anticuerpos se unen entonces a la alta afinidad del receptor IgE en los mastocitos [5, 6] y una vez reanudado el contacto con la TMA mediar entrecruzamiento de los receptores de IgE, con la consiguiente liberación de mediadores, que a su vez causan broncoconstricción y la atracción de células inflamatorias [7 - 9].

Macrófagos alveolares (AMS) se encuentran entre las primeras células que se encuentran pequeñas partículas inhaladas y los productos químicos en las vías respiratorias, ya que estas células se encuentran en la interfase entre el aire y el tejido pulmonar. Las MC son de larga vida las células pertenecientes a la familia de los fagocitos mononucleares. Representan un no-celulares específicos de acogida mecanismo de defensa y puede hacerlo vinculante a la ingestión y de microorganismos y macromoléculas a través de los receptores de reconocimiento de patrones, y la secreción de un amplio repertorio de mediadores inflamatorios que regulan las reacciones inmunes y en el pulmón [10 -- 14]. Anteriormente, se ha demostrado que el agotamiento de acompañamiento en la TMA-sensibilizados Brown Noruega (BN) las ratas antes de la inhalación reto con TMA, pero no TMA-BSA, se tradujo en mejora la función pulmonar durante el reto [15, 16]. Por otra parte, una mayor afluencia de células inflamatorias en el pulmón lumen se observó 24 horas después del desafío con TMA, así como la TMA-BSA en AM-agotado en comparación con las ratas no agotado el control de ratas [15, 16]. Por lo tanto, estamos investigando los efectos directos de la TMA y TMA-BSA en la producción de óxido nítrico (NO), factor de necrosis tumoral alfa (TNF), y la interleukina 6 (IL-6) de MC utilizando la rata AM línea celular NR8383 y las medidas de acompañamiento derivados de la TMA-sensibilizado y ratas BN ingenuo.

Métodos
Materiales

TMA (97% de pureza) se obtuvo de Aldrich (Bruselas, Bélgica) y acetona (grado HPLC) de Merck (Darmstadt, Alemania). Altamente aceite de oliva refinado, 2,4,6-trinitrobenzene ácido sulfónico, albúmina sérica bovina (BSA; cultivo celular a prueba), sulphanilamide, y naphthyl-ethylenediamide se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO). Pentobarbitone de sodio se obtuvo de Cevasante animale BV (Maassluis, los Países Bajos). K-medio Dulbecco figuran Modificado Eagle's Medium (DMEM; Cambrex BioScience, Verviers, Bélgica), complementado con un 10% de suero de ternera fetal (FCS; Invitrogen BV, Breda, Holanda), 10 mM HEPES (Merck), 4 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sodio, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 0,05 mM β-mercapto-etanol (todos de Sigma) y 100 mg / ml de gentamicina (Invitrogen). Ham's F12 medio se obtuvo de Invitrogen, lipopolisacárido (LPS; E. coli O111: B4) de Sigma, y IFN-γ de Genentech Inc (San Francisco, CA). El TNF e IL-6 baterías de ELISA fueron adquiridos a partir de R & D Systems Inc (Minneapolis, MN).

Animales

Mujeres, puras Brown Noruega / CrlBR ratas (BN; 7-8 semanas de edad) fueron adquiridos de Charles River (Maastricht, Países Bajos). Los animales fueron aclimatados al menos 5 días antes del comienzo del estudio. Ellos se mantuvieron bajo condiciones de laboratorio convencionales y recibieron alimentos (IMC Tecnilab, Helmond, Holanda) y el agua del grifo ad libitum. Todos los animales se llevaron a cabo los procedimientos de conformidad con el Comité de Ética Animal de la Universidad de Utrecht (Utrecht, Países Bajos).

Sensibilización procedimiento

TMA se aplicó a una concentración de 50% (w / v) en un vehículo de solución de 4:1 (v / v) acetona y el aceite de oliva. Los animales recibieron 150 μ l en cada flanco (aproximadamente 12 cm 2 cada uno), que se había afeitado con una maquinilla de afeitar eléctrica 2-3 días antes. Siete días después de la primera sensibilización a los animales recibieron 75 μ l de un 25% TMA solución en el dorso de ambos oídos. Los controles recibieron vehículo solución. El aumento de la TMA-IgE específica los niveles séricos de verificar el estado de sensibilización de la TMA-sensibilizados ratas [15, 16].

Preparación de la TMA-BSA conjugada

La TMA-BSA conjugado se preparó bajo condiciones asépticas mediante la disolución de 10 mg / ml de BSA en 0,1 M de borato de sodio buffer (pH 9.4), añadiendo alrededor de 1,5 mg por ml TMA-BSA solución y agitando a temperatura ambiente. Después de 1 h la misma cantidad de TMA y se añadió la mezcla se agita durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la centrifugación a 390 × g durante 5 min, el sobrenadante fue sucesivamente dializados contra-buffer fosfato salino (PBS) y agua destilada durante 24 horas a 4 ° C. La conjugada liofilizada y se almacenan a 4 ° C hasta su uso. El grado de sustitución de la TMA-BSA fue evaluada por la determinación de permanecer libres de grupos amino reacción con 2,4,6-trinitrobenzene ácido sulfónico, tal como se describe anteriormente [17]. El conjugado de sustitución proporción era de aproximadamente el 40 mol TMA para 1 mol de BSA.

Célula de la cultura y la estimulación

Acompañamiento de la TMA-sensibilizados ingenuo y ratas fueron obtenidos por lavado de pulmón en el día 20 después del tratamiento. Las ratas fueron asesinados con una sobredosis de pentobarbitone de sodio (0,6 g / kg, ip). Una cánula se inserta en la tráquea, los pulmones se lavaged 4 veces con 8 ml de PBS alícuotas calentado a 37 º C y el lavado de líquido inmediatamente después de esa fecha fue puesto en hielo. Las células fueron recolectadas por centrifugación durante 10 min a 390 × g (4 ° C). Después de lavar 3 veces swith PBS, las células fueron resuspendido en K-medio e incubadas a 37 ° C durante 2 h en 100 ml de la cultura frascos (Greiner Bio-One, Alphen a / d Rijn, Holanda). Después de lavar lejos no adheridas las células, las células adherentes (AMS) se raspó en fresco frente a K-el medio suplementado con 1% FCS, ajustado a 1 × 10 6 células / ml, sin semillas y en un volumen total de 100 μ l en estériles plana parte inferior de pozos de 96 placas (Costar, Cambridge, MA). Después de 1 h, 25 μ l medio, los estimulantes (2 μ g LPS admixed con 10 U IFN-γ por ml, 0.1-3 mg / ml de la TMA-BSA, 0.1-3 mg / ml de BSA) en el medio, o 10 y 100 μ M TMA en 0,01 y el 0,1% de etanol se han añadido. Todos los estimulantes fueron filtradas a través de un 0,22 μ m jeringa-filtro (PCC, Trasadingen, Suiza) antes de su uso. Después de 24 h los sobrenadantes se recogieron y se mantiene a -20 ° C hasta su uso. Control de la estimulación de las células, con 0,01 y el 0,1% de etanol en el medio no afecta a las células (datos no presentados).

AM La línea celular, NR8383, derivados de ratas Sprague Dawley, se adquirió de la ATCC (Manassas, VA, EE.UU.) y se mantendrá en Ham's F12 medio suplementado con 15% FCS, 100 U / ml de penicilina y 100 μ g / ml de estreptomicina . Las células fueron subcultured una vez por semana. A tal fin, flotante y raspó-off adheridas las células se recogieron por centrifugación, resuspendido en medio fresco, sin semillas y en frascos nueva cultura. Para los experimentos de estimulación, tanto adherente y flotante células han sido recolectados, resuspendido en Ham's F12 medio suplementado con 1% FCS, la penicilina y estreptomicina, sin semillas y en parte inferior plana de 96 pozos de placas a una densidad de 1 × 10 6 células / ml. Después de 1 h, prueba de los compuestos fueron agregados y las células fueron incubadas durante 24 h, tal como se describe más arriba. Todas las células fueron cultivadas a 37 ° C en un ambiente humidificado contiene 5% de CO 2. Las combinaciones de varias concentraciones de LPS e IFN-γ han sido probadas en experimentos preliminares para encontrar las condiciones óptimas para la máxima producción de NO, IL-6 y TNF por los macrófagos utilizado. Posteriormente, la relación dosis-respuesta efectos de la TMA y TMA-BSA fueron medidos y comparados con la máxima producción de estos mediadores de macrófagos utilizado.

NO mediciones

La cantidad de NO secretada en la cultura sobrenadantes se evaluó mediante la determinación de la concentración de su producto de reacción, nitrito, utilizando la reacción de Griess [18]. En la solución, el óxido nítrico reacciona con el oxígeno para formar nitrito y con el anión superóxido para formar nitratos. Nitrito constituye aproximadamente el 60% del total de macrófagos nitrito y nitrato de producción [19]. Reactivo de Griess (100 μ l de 1% sulphanilamide y el 0,1% naphthyl-ethylenediamide en el 5% de ácido fosfórico) se añadió a 100 μ l de muestra medio. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos la densidad óptica se midió a 550 nm utilizando un lector de microplacas (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Curvas de calibración se hicieron con NaNO 2 disuelto en el medio de cultivo.

Ensayos de citoquinas

Los niveles de TNF e IL-6 en el sobrenadante de la cultura de control y estimulado los cultivos celulares se midió utilizando kits comerciales de ELISA de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La IL-6 y TNF kits de ELISA había límites de detección de 10 pg / ml y 15 pg / ml, respectivamente. Un lector de microplacas se utilizó para medir la densidad óptica a 450 nm.

El análisis estadístico

Todos los datos se expresan como media ± SEM. NO, TNF, y niveles de IL-6 fueron analizados estadísticamente mediante un unpaired t-test. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas si p <0,05. Los análisis se realizaron por el uso de Graphpad Prism (versión 3,0, San Diego, EE.UU.).

Resultados
Efectos de diferentes estímulos a la producción de NO, TNF y IL-6 por las células NR8383

NR8383 células producen niveles muy bajos de NO y TNF y cantidades detectables de IL-6 cuando cultivados durante 24 h en medio (Fig. 1]. Incubación con LPS/IFN- γ inducida por la producción de TNF e IL-6 ya después de 6 h (datos no presentados). Después de 24 h de incubación, LPS/IFN- γ aumentado aún más la producción de NO, TNF e IL-6. TMA no fue capaz de estimular la producción significativa de cualquiera de los mediadores de células NR8383 en cualquier momento, pero TMA-BSA inducida por el TNF e IL-6 en la producción de una operación de concentración que dependen de forma después de 6 h (datos no presentados). Después de 24 h de incubación, la TMA-BSA inducida por la producción de NO y un nuevo aumento de la producción de TNF e IL-6 la producción de células NR8383 en una operación de concentración que dependen de la moda. Sin embargo, las concentraciones más bajas de la TMA-BSA para inducir la producción significativa de los distintos mediadores, y las cantidades producidas en relación con las provocadas por las LPS/IFN- γ divergentes. NO estaba ya inducido por la concentración más baja de la TMA-BSA (0,1 mg / ml) y los niveles de NO inducida por los dos mayores concentraciones fueron similares a las inducidas por el nivel LPS/IFN- γ. TNF se indujo a la TMA-BSA concentraciones de 0,3 mg / ml o superior y el máximo nivel de TNF que fue inducida por la dosis de 3 mg / ml fue de aproximadamente el 65% de los que inducido por LPS/IFN- γ. IL-6 fue inducida a la TMA-BSA concentraciones de 1 mg / ml o superior y el máximo de IL-6 nivel que fue inducida por la dosis de 3 mg / ml fue de aproximadamente el 25% de ese inducida por LPS/IFN- γ.

NR8383 células fueron pre-incubadas con 5, 10 y 15% de suero derivado de la TMA-ya sea sensibilizado o el control de ratas 1 h para estudiar los efectos de sensibilización pasiva con la TMA-IgE específica. Estos tratamientos no afectan la capacidad de LPS/IFN- γ, TMA, TMA-Business Software Alliance, BSA o para inducir la producción de NO, TNF y IL-6 (datos no presentados)

Efecto de diferentes estímulos a la producción de NO, TNF y IL-6 de acompañamiento de la TMA-sensibilizados ingenuo y ratas

Acompañamiento de ingenua y la TMA-ratas sensibilizadas producido niveles muy bajos de NO, TNF y niveles indetectables de IL-6 cuando cultivados durante 24 h en medio. Incubación con LPS/IFN- γ inducida por la igualdad de la producción de mediadores de acompañamiento de los ingenuos y la TMA-sensibilizados ratas (Fig. 2]. El LPS/IFN- γ inducida por la producción de MC es comparable a la de igual modo estimulado NR8383 células. El LPS/IFN- γ inducida por el TNF e IL-6 la producción de MC, sin embargo, fue inferior al de las células NR8383. TMA no inducir la producción de mediadores de acompañamiento después de las 24 h. TMA-BSA, sin embargo, inducida por una concentración aumento dependiente de NO en la producción de TNF y de acompañamiento, pero no indujo la producción de IL-6. Niveles significativos de ambos NO y TNF fueron inducidos por 0,3 mg / ml de la TMA-BSA o más. El máximo nivel que NO fue inducida por la TMA-BSA fue de aproximadamente el 60% de los que inducido por LPS/IFN- γ (Fig. 2a] y el máximo nivel de TNF inducida por la TMA-BSA fue de aproximadamente el 15% de ese inducida por LPS / IFN - γ (Fig. 2b].

Discusión

El presente estudio demostró que la TMA-BSA conjugados, pero no libre o TMA BSA, fueron capaces de inducir la producción de los mediadores NO, TNF y IL-6 por la línea celular NR8383, y, IL-6 exceptuados, de acompañamiento de primaria in vitro. Esta estimulación es, probablemente, no inmunológicamente específico por dos razones. En primer lugar, la preincubación con el suero que contiene TMA-IgE específica no afecta a la capacidad de la TMA-BSA mediador para estimular la producción de células NR8383. En segundo lugar, primaria acompañamiento de la TMA-sensibilizados ingenuo y ratas reaccionaron de manera similar a la TMA-BSA. La falta de efecto de suero de la TMA-BN ratas sensibilizadas que contenía altos niveles de la TMA-IgE específica no se esperaba, ya que el acompañamiento expresar los receptores de IgE, Fc ε RI y CD23. Por otra parte, su expresión se incrementa por la presencia de IgE [20] y en vivo de sensibilización [21, 22]. Al parecer, no existe un entrecruzamiento de IgE en la superficie de acompañamiento de la TMA-BSA o entrecruzamiento no desencadenan la producción de mediadores de la respuesta a la TMA-BSA, aunque igualmente preparados conjugados se han comunicado para activar la degranulación de IgE-priming mastocitos [6].

En cuanto a la naturaleza de la aparente inmunológicos no específicos AM estimulación, las semejanzas estructurales entre TMA-conjugados y maleylated BSA-Business Software Alliance [23] pueden apuntar a la participación de un miembro de la familia de receptores scavenger. Estos receptores pertenecen a la gran familia de receptores de reconocimiento de patrones que presentan especificidad vinculante para los patrones estructurales típicamente está representada por las moléculas de superficie celular de muchos microorganismos [24]. Los macrófagos son conocidos por expresar múltiples receptores scavenger [25 - 27] y una variedad de ligandos, incluyendo maleylated-BSA y LPS, han demostrado inducir la producción de NO, TNF y IL-6 a través de receptores scavenger [23, 28, 29]. Dado que estos mediadores son también inducidos tras la estimulación con acompañamiento de la TMA-BSA, pero no libre BSA, y debido a las similitudes estructurales de la TMA-BSA con maleylated-BSA, es probable que los efectos observados son mediadas a través de receptores scavenger.

En el presente estudio, la estimulación con LPS/IFN- γ inducida por la mayor producción de TNF e IL-6 niveles de las células que NR8383 de primaria de acompañamiento. Dado que los dos NR8383 células y células primarias fueron de acompañamiento, las diferencias en los antecedentes genéticos pueden explicar la variación en la producción de mediador, teniendo en cuenta el hecho de que el NR8383 células se obtuvieron a partir de ratas Sprague Dawley, [30], mientras que la primaria de acompañamiento se obtuvieron a partir de ratas BN. Las diferencias en cantidades de mediadores producidos por MC obtenidos a partir de Sprague Dawley, y de ratas BN se han comunicado [31, 32]. Por otra parte, las diferencias entre las células primarias y inmortalizada células pueden estar implicados, desde Rao et al. [33] demostraron que la estimulación de las células NR8383 con LPS activado tres diferentes mitogen-activated proteínas quinasas, mientras que sólo uno de ellos fue activada en la enseñanza primaria de acompañamiento derivados de ratas Sprague Dawley.

La observación de que la TMA-BSA inducida por cantidades iguales de NO en células NR8383 como LPS/IFN- γ y sólo un 40% menos de acompañamiento en la enseñanza primaria indica que la TMA-BSA es un poderoso agente de la activación de los macrófagos. Probablemente es más potente que la LPS como tal, ya que la cantidad de NO producido por MC en respuesta a LPS se informó de que sólo 0-35% de la respuesta después de LPS/IFN- γ incubación primaria de acompañamiento de derivados de Sprague Dawley, y BN ratas [31]. A pesar de la potente in vitro AM-activar la capacidad de la TMA-BSA y la falta de efecto de TMA en este sentido, la inhalación reto de la TMA-BN ratas sensibilizadas con cualquiera de las dos o TMA TMA-BSA inducido similar reducción inmediata de la ventilación minuto [15, 16 ]. Sin embargo, el agotamiento de acompañamiento antes de desafío de sensibilizar a las ratas mejorado la disminución de la ventilación minuto en caso de TMA desafío [15], pero no en caso de la TMA-BSA desafío [16], aunque ambos compuestos induce una afluencia de células inflamatorias en el las vías respiratorias de estos animales. Las diferencias sustanciales entre los TMA y TMA-BSA en su in vitro AM-son la capacidad de activar al parecer no a jugar a la inhalación reto con estos compuestos. Una posible explicación de esta controversia podría ser que la inhalación de TMA conduce a un rápido conjugación de proteínas endógenas in vivo, mientras que la formación de conjugados de tal no es viable in vitro debido a las condiciones de cultivo estático. La observación de que la TMA reto de ratas BN broncoconstricción causada inmediato [15] es indicativo de la conjugación rápido, ya que la broncoconstricción inmediata es probable que sea debido a los mastocitos degranulación desencadenada por IgE receptor entrecruzamiento con un polivalente TMA ligando como formado a vinculantes de TMA múltiples moléculas a la libre proteínas. Desde la formación de conjugados de TMA con proteínas endógenas se considera necesario para la sensibilización [34] y si estas proteínas-conjugados, como TMA-BSA in vitro, induce la producción de NO y de citocinas proinflamatorias en vivo, entonces TMA puede considerarse como un inductor de las señales de peligro. De este modo, la TMA-proteína-conjugados, como el peligro de señalización de moléculas de bacterias, puede actuar como un adyuvante de sensibilización para TMA. Una cuestión interesante a este respecto es, si los más potentes inductores de Lmw químicas inducidas por la enfermedad profesional respiratoryallergic compartir esta actividad intrínseca adyuvante. En caso afirmativo, identificación de los peligros toxicológicos se pueden beneficiar de las pruebas de detección de la activación de macrófagos-actividad de compuestos reactivos Lmw conjugados con proteínas adecuadas transportista.

Conclusión

En resumen, los resultados del presente estudio demuestran que, si bien la TMA es un producto químico altamente reactivo, tiene que ser conjugado con la proteína adecuada para ejercer un efecto mediador en la producción de acompañamiento, tal como se observó para la TMA-BSA conjugado. Los efectos de la TMA-BSA en MC no se depende de la sensibilización, lo que indica que la interacción de la TMA-BSA con MC es, probablemente, a través de un mediada inmunológicamente no específicas del receptor scavenger.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

DLV llevado a cabo parte del estudio y participó en el diseño del estudio, el análisis de los datos y la redacción del manuscrito. MAS preparado la TMA-BSA y ayudó en el estudio. ES llevado a cabo parte del estudio y participó en el análisis de los datos. FPN ayudó a obtener el apoyo a la investigación y examinó el manuscrito. NB PAJH y obtenido el apoyo a la investigación y ha participado en el diseño del estudio, la interpretación de los datos y la redacción del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores se agradecen a MC Bello y AM Raktoe por sus contribuciones a este estudio.