Kinetoplastid Biology and Disease, 2006; 5: 3-3 (más artículos en esta revista)

In vitro de inhibición del crecimiento de flujo sanguíneo formas de Trypanosoma brucei y Trypanosoma congolense de quelantes del hierro

BioMed Central
Karin Merschjohann (karin.merschjohann @ freenet.de) [1], Dietmar Steverding (dsteverding@hotmail.com) [1]
[1] Departamento de Parasitología, Ruprecht-Karls-University, 69120 Heidelberg, Alemania
[2] Centro de Investigaciones Biomédicas, Facultad de Medicina, las políticas y prácticas sanitarias, de la Universidad de East Anglia, Norwich NR4 7TJ, Reino Unido

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Resumen

Tripanosomas africanos ejercen una significativa morbilidad y mortalidad en el hombre y el ganado. Sólo unos pocos están disponibles los medicamentos para el tratamiento de las infecciones de tripanosoma y por lo tanto, el desarrollo de nuevos anti-trypanosomal agentes es obligatorio. Anteriormente se ha demostrado que el flujo sanguíneo de forma tripanosomas son sensibles a la deferoxamina quelante del hierro. En este estudio el efecto de 13 de quelantes del hierro sobre el crecimiento de Trypanosoma brucei, T. congolense y humana HL-60 se puso a prueba las células in vitro. Con la excepción de 2 compuestos, todos los quelantes expuesto anti-trypanosomal actividades, con el 50% de concentración inhibitoria (IC 50) los valores que van entre el 2,1 - 220 μ M. Sin embargo, los quelantes del hierro también muestra citotoxicidad hacia humanos HL-60 células y por lo tanto, sólo menos favorables índices de selectividad en comparación con los fármacos disponibles comercialmente. Interferir con el metabolismo del hierro puede ser una nueva estrategia en el tratamiento de las infecciones de tripanosoma. Más concretamente, lipofílicas hierro agentes quelantes pueden servir como compuestos de plomo para la novela anti-trypanosomal el desarrollo de medicamentos.

Fondo

Trypanosoma brucei y T. congolense son los agentes causantes de la enfermedad del sueño en los seres humanos y nagana en el ganado bovino, respectivamente. Los protozoos viven extracellularly en la sangre y los fluidos de tejidos de mamíferos y se transmiten por la picadura de infectados por la mosca tsé-tsé (Glossina spp.). Más de 60 millones de personas que viven en 36 países del África subsahariana están amenazadas con la enfermedad del sueño [1] y 48000 muertes se registraron en 2002 [2]. Además, 46 millones de cabezas de ganado están expuestas al riesgo de contraer nagana la enfermedad y los costos se estima que 1340 millones de dólares por año [3]. La quimioterapia de la tripanosomiasis africana todavía se basa en fármacos desarrollados hace décadas y algunos de estos mostrar graves efectos secundarios tóxicos [4, 5]. Además, la resistencia a las drogas en tripanosomas africanos está aumentando [6, 7]. Por lo tanto, nuevas estrategias para el tratamiento de tripanosomas africanos son obligatorios.

En contraste con las células de mamífero, de forma torrente sanguíneo tripanosomas requieren sólo pequeñas cantidades de hierro para el crecimiento [8]. La razón de esto es que la sangre de forma tripanosomas falta citocromos y sólo cuatro contienen hierro dependen de las enzimas: aconitase, oxidasa alternativa, ribonucleotide reductasa y superóxido dismutasa. Recientemente, se ha demostrado que la incubación de T. brucei torrente sanguíneo impresos con el quelante del hierro deferoxamina resultados en la inhibición del crecimiento del parásito [9]. El compuesto no inhibe el hierro que contienen las enzimas directamente, sino actos de quelantes de hierro celular evitando así su incorporación en la recién sintetizadas apoproteins [9].

En este sentido, investigó la actividad tripanocida de 13 de quelantes que se sabe que son capaces de iones complejos de hierro contra la corriente sanguínea formas de T. brucei y T. congolense in vitro. Por comparación, el general de la citotoxicidad de los compuestos fue ensayada con leucemia mieloide humana HL-60 cells.

Resultados

El anti-trypanosomal actividades y el general cytotoxicities de quelantes se evaluaron utilizando el Alamar Blue ® ensayo [10, 11]. Para cada reactivo, el 50% de concentración inhibitoria (IC 50) de valor, es decir, la concentración de un compuesto necesario para reducir la tasa de crecimiento de las células en un 50% de la de los controles, se determinó. Con la excepción del 5-ácido sulfosalicílico y dimethylglyoxime, todos los demás compuestos anti-muestra trypanosomal actividades, con CI 50 valores diferentes de 100 veces (Tabla 1]. En general, T. congolense fue algo menos sensibles a los compuestos que T. brucei. Una observación similar fue hecho recientemente para los grupos anti-trypanosomal actividades de alcaloides [11]. La mayoría de tripanocidas quelantes se deferoxamina (Desferal ®), 1,10-phenanthroline y sus 4,7 difenil-y 2,9-dimethy-4, 7diphenyl (bathocuproine, Cu 1 + quelante) derivados, y 8-hydroxyquinoline con IC 50 valores en el rango micromolar. De este modo, los anti-trypanosomal actividades de estos compuestos se están acercando a los comerciales de los medicamentos utilizados para tratar la enfermedad del sueño (suramin: IC 50 = 0,4 μ m) y nagana (diminazene aceturate (Berenil ®): IC 50 = 0,5 μ M) previamente determinadas para torrente sanguíneo las formas de T. brucei 427-221a y T. congolense STIB910 en idénticas condiciones experimentales [11].

Con excepción de 5-ácido sulfosalicílico, bathocuproine, dimethylglyoxime y quercetina, todos los demás quelantes también se activa contra la HL-60 células, con CI 50 valores que van desde 6,2 μ M a 97 μ M (Tabla 1]. Sin embargo, los coeficientes CI 50 de citotóxica / tripanocidas actividad (índice de selectividad) se encontraron en una modesta gama de todos los compuestos (Tabla 1]. Sólo deferoxamina (Desferal ®) y 4,7-difenil-1 ,10-phenanthroline dio IC 50 ratios entre el 10 y el 30 (Tabla 1]. Por comparación, disponible comercialmente los medicamentos utilizados para el tratamiento de la enfermedad del sueño y nagana tiene peso significativo en los índices más altos de selectividad (suramin: CI 50 = 1944; diminazene aceturate: IC 50 = 692 [11]].

Discusión

Compuestos con una alta afinidad por el hierro son comunes en la naturaleza, especialmente en los microorganismos. Numerosos quelantes del hierro, los llamados sideróforos, han sido aislados de bacterias y hongos [12]. Deferoxamina es un quelante del hierro producido por la bacteria Streptomyces piloso. Se ha convertido en la droga Desferal ® que se utiliza para el tratamiento de la intoxicación aguda de hierro crónica y la sobrecarga de hierro. Además, deferoxamina se ha demostrado que la exposición tripanocidas actividad contra las formas de sangre T. brucei [9]. Aquí hemos demostrado que la deferoxamina está activa, no sólo a T. brucei, sino también a T. congolense formas torrente sanguíneo.

El aislamiento de sideróforos en cantidades suficientes para las aplicaciones clínicas es difícil y costoso. Por lo tanto, otros quelantes del hierro que puede ser producida sintéticamente han sido investigados en este estudio. 2,3-ácido y Dihydroxybenzoic etilendiamina-di-o-hydroxyphenylacetic ácido son tales quelantes del hierro sintéticos que se han utilizado en pacientes con β-talasemia mayor [13] y para inducir la deficiencia de hierro en los microorganismos [14], respectivamente. Sin embargo, ambos compuestos sólo exhiben un débil efecto tripanocida. 5-sulfosalicílico ácido es otro que compuestos complejos de iones de hierro en una amplia gama de pH, pero no mostró ningún efecto tóxico para los tripanosomas y células de mamífero. La baja anti-trypanosomal actividades de estos compuestos puede ser debido a su solubilidad en agua. Del mismo modo, una reducción de la actividad tripanocida fue observado recientemente para soluble en agua derivados del ADN inhibidor de la topoisomerasa camptotecina [15].

En contraste con soluble en agua quelantes, compuestos hidrofóbicas muestra mucho mejor anti-trypanosomal actividades. Tropolone es un agente solubilizing lípidos catiónicos para metales y se ha demostrado que la liberación de hierro de las células [16]. Se exhiben moderada tripanocidas actividades, pero también es muy tóxico para las células de mamífero. Sus 5-metil derivado mostró similar anti-trypanosomal acciones pero con una reducción de la citotoxicidad. 8-Hydroxyquinoline es un conocido lipofílicas quelante del hierro [17] y se utiliza como desinfectante. Es muy eficaz para matar las formas de sangre T. brucei, sin embargo, la predicción no se puede hacer en cuanto a su mecanismo de acción debido a la falta de selectividad de iones metálicos. Quercetina es un flavonoide con propiedades quelantes de metales. Es sólo moderadamente tóxico para los tripanosomas. Esto puede deberse a sus propiedades antioxidantes [18] contrarrestar su efecto tripanocida como un quelante privar a la celda de hierro. 2,2 '-Bipyridine es una membrana-permeant, intracelular Fe 2 + quelante y se ha demostrado que inhiben la replicación del ADN del virus mediante el bloqueo de la incorporación de hierro en apoprotein viral ribonucleotide reductasa [19]. Sin embargo, 2,2 '-bipyridine muestran sólo algunos tripanocidas como actividad relacionada con el compuesto 2,4,6-tris (2-pyridyl) -1,3,5-triazina. Por otra parte, 1,10-phenanthroline, 2,2 '-bipyridine derivados con un aumento de lipofilia y la reducción de libre rotatability, inhibió sustancialmente la tasa de crecimiento de ambos tripanosomas y células de mamífero. El 4,7-difenil derivados de 1,10-phenanthroline mostró una actividad similar tripanocidas como su padre compuestos, pero tuvo menos citotóxico. Sin embargo, los anti-trypanosomal acción de phenanthrolines no parece ser de agotar los parásitos de hierro. Contra esta es la observación de que Fe 2 + y Cu 1 + complejos de 4,7-difenil-1 ,10-phenanthroline pantalla tripanocidas actividades similares (datos no presentados). Además, bathocuproine (2,9-dimetil-4 ,7-difenil-1 ,10-phenanthroline), otro lipofílicas phenanthroline derivado que selectivamente complejos Cu 1 + sin afinidad por el Fe 2 +, también fue igualmente tóxico para tripanosomas. Parece que la lipofilia de los compuestos es el factor crucial. Es posible que phenanthrolines incorporar en las membranas o intercalate en el ADN e inducir los cambios estructurales. En apoyo de esto, se ha demostrado que Fe 2 + complejos que impliquen 1,10-phenanthroline y 4,7-difenil-1 ,10-phenanthroline se unen a ADN [20].

Conclusión

Privación de hierro puede ser una nueva estrategia para el tratamiento de la tripanosomiasis africana. Aunque los compuestos investigados en este estudio no son adecuados para uso clínico, nuestros resultados sugieren que lipofílicas hierro agentes quelantes tienen un potencial como novela anti-trypanosomal drogas. Este hallazgo también puede ser explotado en el futuro mediante la utilización de la riqueza de información que actualmente se generan en el desarrollo de células permeables quelantes del hierro como el cáncer de agentes quimioterapéuticos [21 - 23]. Además, los esfuerzos futuros deben apuntar a mejorar la selectividad de los quelantes del hierro. Por otra parte, quelantes del hierro puede ser de interés para la terapia de combinación con los anti-tripanosoma drogas.

Materiales y métodos
Reactivos

Alamar Blue ® fue de BioSource (Camarillo, CA, EE.UU.); EMEM con L-glutamina y sin rojo fenol y suero fetal bovino fueron de Tecnologías de la Vida (Eggenstein, Alemania); RPMI 1640 sin L-glutamina y sin rojo fenol fue de Bioproducts (Heidelberg, Alemania) y suero de cabra era de Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemania). Desferal se obtuvo de Ciba-Geigy (Wehr, Alemania). Todos los demás eran los quelantes de Sigma (Deisenhofen, Alemania) o Fluka (Buchs, Suiza). La Fe 2 + complejos de 1,10-phenanthroline y 4,7-difenil-1 ,10-phenanthroline, y 5-metil-tropolone fueron amablemente proporcionados por el profesor Michael Wink (Instituto de Farmacia y Biotecnología Molecular, Ruprecht-Karls-University , Heidelberg, Alemania).

Células

Torrente sanguíneo formas de T. brucei TC221 se derivó de la población 427 [24] y se obtuvo de Prof Peter Overath (Max-Planck Institute für Biologie, Tübingen, Alemania). El origen animal de la T. brucei 427 acciones no pueden ser definitivamente aclarado ya. Torrente sanguíneo formas de T. congolense STIB910 fue clonado a partir de T. congolense STIB249 que fue aislado de un león en Tansania en 1971 [25]. T. congolense STIB910 fue proporcionado amablemente por el Prof Reto Brun (Instituto Tropical Suizo, Suiza). Humanos leucemia mieloide HL-60 células se obtuvieron a partir de la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Alemania).

Cultivo celular

Torrente sanguíneo formas de T. brucei y T. congolense fueron cultivados en medio Baltz [26] (EMEM más el 25 mM HEPES, 2,5 mM de glucosa, 1 mM Na-piruvato, hipoxantina 0,05 mm, 0,001 mM timidina, 0,04 mM adenosina, 0,025 mM de ácido bathocuproindisulfonic, pH 7,5, 10 ml / l nonessential amino ácidos (100 ×)), complementado con 16,7% inactivado por calor suero fetal bovino y suero de cabra, respectivamente, y 0,2 mm 2-mercaptoetanol. Humanos leucemia mieloide HL-60 células fueron propagadas en medio RPMI 1640 suplementado con 2 mM L-glutamina y el 10% inactivado por calor suero bovino fetal. Todas las culturas se mantuvieron en un ambiente humidificado contiene 5% de CO 2 a 37 ° C (T. brucei y HL-60 células) o a 34 ° C (T. congolense).

Ensayos de toxicidad

Las células fueron sembradas en 96-y el cultivo de tejidos en placas de 200 μ l soporte de varias concentraciones de quelantes disuelto en H 2 O (deferoxamina, 2,3-ácido dihydroxybenzoic, etilendiamina-di-o-hydroxyphenylacetic ácido, 5-ácido sulfosalicílico, tropolone, 5-metil-tropolone, 2,2 '-bipyridine, 1,10-phenanthroline), el 99% de etanol (2,4,6-tris (2pyridyl) -1,3,5-triazina, 4,7-difenil-1 ,10-Phenanthroline, 8-hydroxyquinoline, dimethylglyoxime, quercetina), o 100% DMSO (bathocuproine). Los controles que figuran las respectivas solvente por sí sola. En todos los experimentos, la concentración final de disolvente fue del 1% que no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento celular. Para garantizar que las células se encuentran en fase logarítmica de crecimiento, durante todo el experimento, fueron sembradas en una densidad inicial de 1 × 10 4 T. brucei / ml, 4 × 10 5 T. congolense / ml, y 1 × 10 5 HL-60/ml, respectivamente. Después de 24 h (tripanosomas) o 43 h (HL-60) de incubación, 20 μ l de la viabilidad indicador colorimétrico Alamar Blue ® se añadió a cada pocillo. Las células fueron incubadas por un nuevo 24 h (tripanosomas) o 5 h (HL-60), de modo que el total de tiempo de incubación fue de 48 h. Luego, las placas se leyeron en un Dynatech MR5000 lector de ELISA (Denkendorf, Alemania), usando una prueba de longitud de onda de 550 nm y una referencia longitud de onda de 630 nm. Cada ensayo se estableció en dos y tres veces repetido. El valor IC 50 se determinó por interpolación lineal de acuerdo con el método descrito en [27].

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

KM llevó a cabo el trabajo experimental como parte de su VMD. DS concibe el estudio, supervisó la ejecución, y preparó el borrador final del manuscrito. Ambos autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias Dr. John Winpenny para lectura crítica del manuscrito. Esta labor fue apoyada por el Bundesministerium für Forschung und Technologie, Schwerpunkt für tropenmedizische Forschung en Heidelberg (01 KA 9301 / 3).