Expresión alterada de genes del reloj circadiano, mPer1, en el cerebro del ratón y el riñón bajo la dependencia de la morfina y la retirada

Los ritmos circadianos están al día sobre las variaciones de las funciones fisiológicas que se encuentran en cada organismo vivo en la tierra que van desde las bacterias hasta los mamíferos. Estos ritmos diarios se generan a través de la integración de la oscilatoria expresión de múltiples genes del reloj circadiano [1 - 3]. En los mamíferos, los ritmos circadianos son regulados por el núcleo suprachiasmatic (SCN) del hipotálamo. Las neuronas en el SNC generar auto-sostenido diario oscilaciones de la expresión génica y actividad eléctrica con un período de cerca de 24 horas [4]. El SNC mantiene el ritmo circadiano de los diferentes órganos periféricos sincronizados entre sí, así como para el medio ambiente de luz oscura ciclo [5]. A pesar de todas las células de mamíferos se cree que el reloj circadiano expresar los genes, las células fuera del SNC no puede mantener la libre oscilación sostenida circadiano en ausencia del SNC [6].

Casi todas las funciones fisiológicas en el cuerpo humano presenta alguna forma de ritmicidad circadiana. Bajo condiciones patológicas, sin embargo, el ritmo circadiano normal puede ser interrumpido. Los pacientes de SIDA o los usuarios habituales de drogas recreativas a menudo sufren de trastornos del sueño y una alteración de los ritmos circadianos. Adictos a las drogas a menudo doze fuera durante el día y pasear por la calle por la noche. Este comportamiento circadiano alterado hace más difícil la rehabilitación ya que éstos dependen de drogas-los pacientes no pueden mantener un constante programa diario. Se informó de que los opiáceos podría modificar la luz de arrastre de los marcapasos circadiano a través de efectos directos sobre el SNC actividad eléctrica y la regulación del período (Per) genes [7]. Una de las primeras estudio encontró que el delta agonistas opiáceos podría modular la luz inducida por los avances en la fase de hámsters [8]. Además, se ha informado de que la morfina podría cambiar el ritmo circadiano de actividad locomotora en ratones [9]. Es bien sabido que la morfina puede inducir cambios adaptativos en el sistema nervioso central conduce a la drogodependencia [10]. Aunque el mecanismo exacto en que la dependencia de la morfina no es plenamente entendido, se ha informado de que la dependencia de la morfina y la morfina son el síndrome de abstinencia asociados con la alteración de los ritmos circadianos. Anteriores estudios en Drosophila se indica que el comportamiento de sensibilización a la cocaína podría estar relacionado con la expresión de los genes Periodo de reloj, despertador, bicicletas, y Doubletime [11]. Recientemente, se informó de que el lugar acondicionado preferencia del aparato locomotor y de sensibilización para la morfina se han alterado en los ratones que carecen de este período-1 (mPer1) de genes [12, 13].

Los mamíferos Period1 (mPer1 mPer1) gen es un importante participante en el circuito de retroalimentación molecular que genera los ritmos circadianos y desempeña un papel en el de restablecer el SCN de las señales de luz [14]. En ovinos, Per1 expresión sigue circadiano, así como los ritmos estacionales, con valores más altos en el verano, cuando el día es más larga duración [15]. En el SCN ratón, el marcapasos circadiano implica un circuito de retroalimentación transcripcional en el que el reloj y BMAL1 funcionan como reguladores positivos, mientras que los tres Período (mPer) genes, mPer1 mPer1, mPer2 mPer2, y mPer3 mPer3, están involucrados en un voto negativo. Por otra parte, mPer1 expresión puede ser inducido en el SNC por un breve pulso de luz durante la fase oscura [16]. La expresión de genes mPer no se limita a la CPN. El mPer genes se expresan en varias otras regiones del cerebro y tejidos periféricos.

Dado que el uso indebido de drogas se sabe que altera el ritmo circadiano de comportamiento, tratamos de investigar si el tratamiento de morfina puede alterar la expresión de genes del reloj circadiano, sobre todo en regiones del cerebro fuera del SNC y en los tejidos periféricos.

Hombre ratones BALB / c, 4-6 semanas de edad, fueron utilizados en los experimentos. Los animales fueron alojados en condiciones normales de temperatura ambiente (22 ± 2 ° C), humedad (55 ± 10%), y la luz (12L: 12D, luces a las 8:00) y fueron alimentados con alimentos y agua ad libitum. Todos se hicieron esfuerzos para reducir al mínimo el número de animales utilizados y su sufrimiento. Todos los experimentos se realizaron en conformidad con las directrices internacionales sobre el uso ético de los animales.

El CPP prueba se llevó a cabo en un período de dos aparatos de cámara (15 cm de ancho x 30 cm × 15 cm de alto) con un deslizamiento de partición que divide la unidad principal en dos del mismo tamaño a las cámaras. Las dos cámaras difieren en planta: uno era blanco con un suelo de textura, y el otro era negro con un buen piso. Cuando el deslizamiento se planteó la partición, los ratones pueden moverse libremente de una cámara a otra. Cuando se mide CPP, la partición se elevó a 7 cm sobre el suelo. Los ratones fueron ensayados por el tiempo gastado en las dos cámaras del aparato en 15 minutos. El tiempo que pasó en ratones la droga en parejas cámara fue usada como el CPP Resultado. Cada ratón tiene tres sesiones diarias seguidas de adaptación de la formación CPP, cuando se recibió una inyección de morfina junto con la moderación en el blanco de piso cámara durante 30 minutos o una inyección de solución salina junto con la moderación en la palabra negro-cámara durante 30 min.

Los animales fueron divididos aleatoriamente en tres grupos de 42 animales: Control (CON), dependientes de morfina (MD), y la retirada de morfina (MW). Durante los tres períodos de sesiones de adaptación, la preferencia natural de los ratones (por el blanco y piso de cámara) ha sido registrada. Desde el 4 ^º día, todos los ratones se dedican a la formación básica CPP durante ocho días. Los ratones recibieron morfina (MD y MW, 10 mg / kg) o solución salina (CON) por vía subcutánea a las 10:00 y luego se limita a el lado blanco del aparato durante 30 min. Al día siguiente, se les dio solución salina a las 10:00 y luego se limita a la sección de negro durante 30 min. Este 2 días procedimiento se repitió cuatro veces. Medición de la CPP se realizó a las 16:00 horas cada día. En el 12 ^º día, los ratones en el grupo y Con el MD grupo fueron sacrificados a las 0:00, 4:00, 8:00, 12:00, 16:00 y 20:00 (7 animales por hora por punto grupo). El cerebro y los riñones de los ratones fueron sacrificados preparado para su posterior análisis mediante Western blot e inmunohistoquímica. Ratones MW en el grupo sufrió la retirada de morfina durante 5 días. En el 6 ^º día de retirada, el CPP se midió, y el 7 de los ratones fueron sacrificados en cada tiempo de 6 puntos (0:00, 4:00, 8:00, 12:00, 16:00 y 20:00) . El cerebro y los riñones de estos ratones fueron preparados para su posterior análisis mediante Western blot e inmunohistoquímica, respectivamente.

Cerebro y los riñones a partir del 5 de los 7 animales en cada grupo fueron utilizados para el Western Blot. De todo el cerebro y el riñón homogeneizado se obtuvieron de la siguiente manera. Muestras de tejidos fueron homogeneizados a 4 ° C en una solución que contenga 0,4 M NaCl, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA, 5 mM NaF, 1 mM dithiothreitol, 0,3% Tritón X-100, el 5% de glicerol, 0,25 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro, 10 mg / ml aprotinina, 5 mg / ml leupeptina, y 1 mg / ml pepstatin A. homogeneizado se liquidaron por centrifugación (en dos ocasiones, cada 12 min, 12000 × g). Las proteínas se separaron por electroforesis a través de un 8% la separación de geles de poliacrilamida con un 5% de apilamiento geles de poliacrilamida y luego transferidos a membranas de nitrocelulosa. Membranas fueron bloqueadas con 5% de albúmina sérica bovina en Tris-buffer salina que contiene 0,05% de Tween 20 y luego incubadas con afinidad de los anticuerpos purificados a mPER1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, EE.UU.). Inmunorreactiva bandas se visualizaron utilizando antigoat inmunoglobulina G antisueros secundaria y una mayor detección de quimioluminiscencia. Las señales fueron escaneados por una tormenta 840 instrumento y analizados por Imagen-Quant 5,0 software.

Cerebro y los riñones a partir del 2 de los 7 animales en cada grupo fueron utilizados para inmunohistoquímica. El cerebro y los riñones preparados a partir de sacrificar ratones fueron fijadas en 10% de paraformaldehído. Posteriormente, fueron bloqueadas y deshidratados en parafina. Serial secciones de 4 nm fueron cortados y procesados para tinción HE e inmunohistoquímica. Las secciones fueron absueltos de parafina, y peroxidasas endógenas fueron bloqueados por la incubación con el 3% de H ₂ O ₂ y lavado.

Las secciones del cerebro fueron incubadas con suero de conejo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las secciones se incubaron durante la noche con una cabra policlonal anti-mPER1 de anticuerpos (Santa Cruz Biotechnology, Inc, EE.UU., 1:100) a 4 ° C, seguido por la adición de biotina conejo cabra anti-IgG anticuerpo secundario (Jinshan, BJ , China).

Secciones de los riñones se incubaron durante la noche con un conejo policlonal anti-mPER1 de anticuerpos (Santa Cruz Biotechnology, Inc, EE.UU., 1:25) a 4 ° C. Luego, las secciones se incubaron con peroxidasa de rábano (HRP) y conjugado con anticuerpo secundario dirigido contra las especies en cuestión (Jinshan, BJ, China).

La tinción inmunohistoquímica se tramitará de acuerdo con las instrucciones del fabricante y visualizar mediante el uso de Diaminobencidina (DAB) tinción. Inmunoreactividad se analizó a través de la imagen más favorable de software (CY Media Company). Por cada sección, la densidad óptica integral (IOD) de cada campo visual se calculó.

Los datos fueron analizados por la t de Student para el grupo de pruebas de diferencias, por ANOVA de un factor de las diferencias de horario y de grupo por separado las diferencias, y por dos vías ANOVA por el tiempo y las diferencias grupo. Las series temporales de datos de expresión proteica mPER1, que fueron obtenidos mediante técnicas de inmunohistoquímica analizados a través de la imagen más favorable de software, se analizó el contenido de ritmicidad circadiana de la cosinor método [17]. Los parámetros del cosinor, es decir, la amplitud (la mitad de la diferencia entre el mínimo y máximo provistos de la función coseno), MESOR (valor medio de la curva de coseno equipados que representan el ritmo ajustado media) y Acrophase (tiempo de pico de valor de la equipado coseno función), se pusieron a prueba entre los dos grupos por separado por el cosinor parámetros de ensayo diseñado por Bingham et al. [18].

Durante los tres días de adaptación, los ratones del grupo que aparece ni una preferencia por el color blanco o negro cámaras. Después de la 8 ^º día de la inyección de morfina, MD MW y ratones mostraron una preferencia por el compartimento de la morfina, mientras que los ratones expuestos Con sin preferencia, ya sea para compartimentos La media de CPP Con MD y ratones fueron significativamente diferentes (Figura 1a]. El CPP MW de ratones en el 6 ^º día de la retirada no fue diferente al que figura en el 8 ^º día de la administración de morfina (Figura 1b].

Western blot de Con, MD MW y cerebros de ratón y los riñones con anti-mPER1 anticuerpo policlonal de cabra puesto de manifiesto una banda distinta a 110 kDa, lo que corresponde a mPER1 (Figura 2]. Prueba de Western blot demostró que la proteína mPER1, lo que refleja la expresión de genes mPer1, exhibió robusto ritmicidad circadiana en todo el cerebro. El mPER1 nivel de expresión de proteínas en ratones MD se incrementó entre las 8:00 y las 20:00. En Con MW y ratones, alto nivel de mPER1 expresión de proteínas en el cerebro se observó a las 0:00. Por lo tanto, la fase del ritmo circadiano de expresión mPer1 se adelantó en ratones de la MD en comparación con el grupo Con el microondas y grupos (figura 2a]. Western blot prueba también demostró que la proteína mPER1 expuesto robusto variación circadiana en los riñones de ratones Con (figura 2b]. Por el contrario, eran débiles expresiones de mPER1 en los riñones de los MD y los ratones MW.

En virtud de alta potencia (200 ×) y vistos con microscopio invertido (Nikon TE 2000-U), mPER1 expresión de proteínas en el cerebro y los riñones fueron claramente observados. Alta expresión de mPER1 se ve como amarillo-marrón, mientras que la baja expresión se ve como azul en las secciones (Figura 3]. Rítmica expresión de mPER1 se analizó de acuerdo con la expresión mPER1 datos determinada por la imagen más favorable de software y se muestra en la Figura 4 y Cuadro 1.

El uso de inmunohistoquímica y análisis de imágenes para la expresión de proteínas mPER1, encontramos que la expresión de proteínas mPER1 en la corteza piriforme, núcleo accumbens y giro dentatus del hipocampo fluctuado a lo largo del 12L: 12D ciclo (Figura 4 bis, cuadro 1]. Ritmicidad circadiana de mPER1 expresión persiste después de la administración de morfina, pero el patrón circadiano de mPER1 expresión en los cerebros se modificó: el MESOR fue elevado y la acrophase (hora punta) fue desplazado por delante MD en ratones como a compated Con MW y ratones. El acrophase de mPER1 expresión no difirió significativamente entre el grupo de Con (22:54) y el grupo MW (23:24). El acrophase fue mucho antes, sin embargo, en el grupo MD (17:04), según lo confirmado por la prueba de cosinor.

Variación circadiana de mPER1 expresión de proteínas también se observó en los riñones de ratones Con grupo, pero no de MW MD y ratones (Figura 4b, Tabla 1]. En Con ratones, mPER1 expresión de proteínas mostró un pico en 3:11, mientras que el valor máximo de mPER1 expresión proteica, evidentemente, no era notado después de la administración de morfina. El circadiano mPER1 expresión de la proteína fue duramente amortiguamiento en el MD MW y ratones en comparación con el Con. La expresión de mPER1 en los riñones de Con, pero no en MD y microondas, mostró estadísticamente significativa ritmicidad circadiana (Figura 4b, Tabla 1].

Ritmicidad circadiana es un muy conservadas función biológica que se encuentra en cada organismo vivo, desde las bacterias hasta los seres humanos. En los mamíferos, los ritmos circadianos son regulados por el marcapasos circadiano central en el SCN. Con el fin de que el organismo a adaptarse al medio ambiente, los ritmos circadianos deben sincronizarse a la luz ambiental-oscuro ciclo. Este proceso de sincronización se conoce como luz de arrastre, que a diario se produce a través de luz inducida por fase avances y retrasos del reloj endógeno [19]. El SNC recibe la retina de entrada directa a través de una subpoblación especializada de sensible a la luz, sino la formación de la imagen independiente de las células ganglionares de la retina que contienen la photopigment melanopsin [20]. Estas células ganglionares proyecto para la SCN y la liberación de glutamato y el neuropéptido adenylyl ciclasa hipofisaria péptido de la activación (PACAP) como los principales neurotransmisores para la luz de arrastre [21].

Con el fin de optimizar la función corporal de los diferentes órganos y sistemas, el SNC mantiene los ritmos circadianos de los diferentes órganos periféricos sincronizados entre sí. Por ejemplo, las catecolaminas y la hormona glucocorticoide los niveles son altos durante el día en que cardiovasculares salida es en gran demanda. Durante el sueño, los linfocitos circulantes alcanzar el nivel máximo para llevar a cabo la vigilancia inmune. Sin embargo, bajo condiciones patológicas, los ritmos circadianos entre los diferentes órganos y sistemas pueden no estar bien sincronizados entre sí, o para el medio ambiente luz-oscuridad ciclo. Los resultados del presente estudio indican que el tratamiento de morfina puede suprimir la oscilación circadiana de mPER1 proteína en el riñón y alterar la fase de la oscilación en el cerebro. Estos resultados sugieren fuertemente que la adicción a la morfina y retirar puede dar lugar a desincronización del ritmo circadiano entre los diferentes órganos.

Además de jugar un papel en la regulación de los ritmos circadianos, el papel de mPer1, en su caso, en el cerebro y los tejidos periféricos es en gran parte desconocido. Nuestro Western blot utilizando todo el cerebro reveló que la fase del ritmo circadiano de mPer1 se adelantó la morfina en ratones retirada en comparación con los ratones control. En futuros estudios, vamos a aislar las estructuras cerebrales que se sabe que están implicados en la adicción a las drogas, incluido el sistema límbico, las neuronas dopaminérgicas en el núcleo accumbens, y creemos el núcleo, etc

La función exacta de los genes del reloj circadiano en los tejidos periféricos sigue siendo desconocido. Nuestros resultados revelaron que el tratamiento de morfina puede suprimir la oscilación circadiana de mPER1 proteína en el riñón y alterar la fase de la oscilación en el cerebro. Un estudio informó de que la morfina y sus metabolitos se secretada por el riñón después de la desintoxicación en el hígado [22]. También se informó de que la adicción a opiáceos podría dar lugar a enfermedades renales, incluyendo nefritis intersticial, glomerular apoptosis de las células epiteliales, síndrome nefrótico o insuficiencia renal aguda [23 - 26]. Chen et al. [27] informó de que la excreción urinaria de agua, la excreción de sodio y potasio excreción exposición ritmos circadianos en las ratas, con pico de actividad se producen durante la noche. Nuestros resultados mostraron que la expresión de mPER1 en los riñones fue mayor por la noche en el control de ratones, coincidiendo con el pico de actividad de la excreción de potasio [27].

El SCN podrá regular el ritmo circadiano de los órganos periféricos a través de diversas vías. Un estudio informó de que los ritmos circadianos de los genes reloj incluyendo mPer1 se mantuvieron en los riñones de SNC-lesionadas ratones [28]. En estudios de alimentación, se comprobó que los horarios de alimentación podría entrain el ritmo circadiano de reloj de la expresión génica en el hígado independiente del SNC [29, 30]. Estos hallazgos sugieren que los ritmos circadianos de los órganos periféricos pueden ser sincronizados de nutrientes o productos metabólicos, además de la SCN.

En resumen, los efectos de la morfina en el reloj circadiano de genes, mPer1, parecen ser órgano específico. En el cerebro, la morfina aumenta el nivel de mPER1 expresión y promueve la fase del ritmo circadiano. En el riñón, la morfina disminuye el nivel de expresión y mPER1 suprime ritmicidad circadiana.

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

XW participado en todos los trabajos y redactó el manuscrito. YW participó en el diseño de experimento. HX participó en el análisis de datos. YL CW y participó en el experimento CPP. YW, HZ y ZJ participó en inmunohistoquímica y Western Blot. JMD ayudado con el Inglés escrito del documento. ZW dirigió el estudio y escribió la versión final del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado la versión final del artículo.