Acta Veterinaria Scandinavica, 2006; 48(1): 14-14 (más artículos en esta revista)

La fecundidad de congelados-descongelados semental esperma no puede predecirse por la que actualmente se utilizan métodos de laboratorio

BioMed Central
P Kuisma (paivi.kuisma @ iki.fi) [1], Andersson M (magnus.andersson @ helsinki.fi) [1], E Koskinen (erkki.koskinen @ mmm.fi) [2], T Katila (terttu. katila@helsinki.fi) [1]
[1] Departamento de Ciencias Clínicas Veterinarias, Universidad de Helsinki, 04920 Saarentaus, Finlandia
[2] Departamento de Ciencias Animales, Universidad de Helsinki, PL 28, 00014 Helsingin yliopisto, Finlandia

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Resumen

El objetivo del proyecto era utilizar actual sencilla y práctica las pruebas de laboratorio y comparar los resultados con las tasas de foaling yeguas inseminadas con producida comercialmente semen congelado. En el Exp. 1, se puso a prueba esperma de 27 y en el Exp. 2 de 23 sementales, 19 sementales participó en ambos experimentos. La media del número de yeguas por semental en ambos experimentos fue de 37 (min. 7, max. 121). La morfología de los espermatozoides fue evaluada y cultivo bacteriano realiza una vez por semental. En el Exp. 1, después de la motilidad progresiva 0, 1, 2, 3 y 4 h de incubación usando microscopía de luz, la motilidad características medirse con un analizador automático de esperma, integridad de membrana plasmática utilizando diacetato de carboxifluoresceína / yoduro de propidio (CFDA / IP) y la tinción de microscopía de luz, membrana plasmática integridad utilizando tinción PI y un fluorometer, integridad de membrana plasmática mediante un resazurin reducción de ensayo, concentración y espermatozoides fueron evaluados. En el Exp. 2, las mismas pruebas que en el Exp. 1 y un hipo-osmótica hinchazón de prueba (HOST) utilizando tanto microscopía de luz y un fluorometer se realizaron inmediatamente después de la descongelación y después de 3 h de incubación. El análisis estadístico se realizó por separado a todos los sementales y para los que tienen ≥ 20 yeguas, además, con sementales foaling tasas de <60 o ≥ 60% fueron comparados. En el Exp. 1, la motilidad progresiva de todos los sementales después de un 2 - 4-h de incubación en correlación con la tasa de foaling (coeficientes de correlación 0,39 - 0,51), (p <0,05). En sementales con> 20 yeguas, la inseminación artificial dosis mostró un coeficiente de correlación de -0.58 (p <0,05). En el Exp. 2, la anfitriona, inmediatamente después de la descongelación mostró una correlación negativa con la tasa de foaling (p <0,05). No existe una prueba única constante es confiable para predecir la capacidad de fertilización del esperma, ya que los 2 experimentos arrojado resultados conflictivos, aunque los mismos sementales a veces participó en ambos. Esto demuestra la dificultad de esperma congelado de control de calidad producidos comercialmente en el semen semental, y por otro lado, la dificultad de llevar a cabo ensayos de fertilidad en equinos.

Fondo

En muchos países, la inseminación artificial (AI) ha reemplazado el apareamiento natural como un método para la cría de yeguas. El uso de semen congelado, sin embargo, no ha ganado amplio uso en los caballos, debido a la baja las tasas de embarazo. Además de la calidad del esperma, muchos otros factores que afectan el resultado de la gripe aviar, incluida la manipulación y los métodos de congelación de semen, AI dosis, el momento de la IA y la gestión y la fertilidad de las yeguas [1]. Existe una considerable variación entre los sementales en la forma en que su esperma sobrevive congelación y descongelación. De lo contrario sementales fértiles puede producir esperma que los resultados en muy malas después de descongelar las tasas de embarazo [2]. Tischner Tischner [3] estima que aprox. El 20% de los sementales son "buenos congeladores", otro 20% son "malos congeladores", y la mayoría de los sementales, el 60%, que producen el esperma se ve afectada negativamente, pero puede ser freezable uso de ciertas técnicas. A diferencia de toros, sementales no se seleccionan para la reproducción sobre la base de la fertilidad o el semen freezability [1]. Por lo tanto, no es mucho el progreso que cabe esperar en el uso de esperma congelado semental. Para la predicción de la fertilidad y para mejorar los métodos de congelación, es importante desarrollar técnicas fiables para evaluar la calidad del esperma in vitro. Muchos métodos existen y se utilizan, pero no muchos estudios han examinado o mostró la relación entre los resultados de las pruebas de laboratorio y la fecundidad de congelados-descongelados semen semental [4], [5]. La relación entre la motilidad, el más frecuentemente utilizado en la prueba de caballos, y la fecundidad está lejos de ser claro, [6] [7], y en particular para semen congelado no es una medida exacta de la fertilización potencial [8]. En Malmgren Malmgren de la revisión [9], en conflicto se informó de correlaciones entre la morfología - otra prueba de uso común - y la fecundidad del esperma fresco semental. A menudo se supone que la condición de los espermatozoides después de sobrevivir a la criopreservación sería similar a la congelación de pre-estado. Hay pruebas de que también los sobrevivientes se han visto afectadas [10]. Por lo tanto, la evaluación y el examen de los métodos aplicados para el semen fresco no puede ser tan útil para semen congelado.

Amann [11] declaró que el establecimiento de una correlación entre los diferentes atributos de esperma y la fertilidad no es suficiente. El objetivo es desarrollar pruebas de laboratorio que son predictivos de la fecundidad, lo que no es una tarea fácil de lograr, particularmente en los caballos. Para determinar si un laboratorio de prueba se correlaciona con la fecundidad, uno debe tener específicos, precisa, completa y precisa las pruebas de laboratorio y precisa y exacta los datos de fecundidad de un número suficiente de mujeres. Las pruebas independientes de varios parámetros debe hacerse [11 - 13, 7]. Graham [14] figuran varios atributos que deben poseer los espermatozoides para fertilizar un ovocito, con inclusión de la motilidad, la morfología normal, suficiente para el metabolismo de la producción de energía, y la integridad de membrana. La medición de un solo atributo, no para detectar los espermatozoides defectuosos en otro atributo, y sobreestimar el número de espermatozoides fértiles en la muestra.

La obtención de buenos datos de fecundidad es difícil en los caballos. El número de yeguas y sementales utilizada es demasiado pequeña, demasiado pocas yeguas son inseminadas en el momento oportuno utilizando dosis adecuadas AI, muy pocas muestras de semen se evalúan de manera apropiada de cada hombre, y los datos de fecundidad de yeguas es inexacta [11] .

Sperm membranas son particularmente vulnerables durante la congelación [10]. Esto sugiere que la evaluación de pruebas de integridad de la membrana espermática deben ser utilizados en la evaluación de semen congelado. Por otra parte, los espermatozoides que han sobrevivido a la congelación y descongelación puede ser una subpoblación seleccionada, que ha excepcionalmente estable membranas. Estas membranas también puede ser que no responde a estímulos fisiológicos. Si este es el caso, entonces proceso de criopreservación puede seleccionar viable, pero es relativamente infértil esperma [10]. Membranas de espermatozoides criopreservados son menos capaces de resistir el estrés osmótico que los espermatozoides frescos [15]. Velocidad (curvilínea y media la velocidad del camino) y la linealidad de los espermatozoides criopreservados son generalmente reducido [10]. Un uso común criterio de selección en semental comercial es la producción de esperma después de deshielo progresivo de la motilidad ≥ 30-35%.

El objetivo del presente estudio fue el uso económicamente viable y sencillo análisis de laboratorio y se correlacionan con la foaling tasas de yeguas. Las tasas de embarazo por ciclo habría reflejado mejor la fertilidad [16], pero no se disponía de todas las yeguas. El objetivo del estudio era también para analizar la calidad general de esperma producida comercialmente dosis.

Materiales y métodos

Resultados de semen congelado y pruebas de evaluación foaling tasas de yeguas fueron comparados en 2 experimentos. En el primer experimento, el semen de sementales 27 se probó y en el segundo experimento de esperma de 23 sementales, 19 sementales participó en ambos experimentos. Sólo sementales foaling tener datos de por lo menos 7 yeguas se incluyeron los datos se analizaron por separado para tener sementales ≥ 20 yeguas.

El esperma congelado
Experimentos

En el primer experimento, el semen evaluaciones se realizaron inmediatamente después, una vez descongelados, pero la evaluación de la motilidad utilizando microscopía de luz fue seguido por 4 h. Desde la incubación parece diferenciar los espermatozoides con mayor facilidad mayor que el examen inmediatamente después de la descongelación, todas las pruebas se llevaron a cabo 0 y 3 h después de la descongelación en el segundo experimento. Cultivo bacteriano se realizó sólo en el primer experimento y la hipo-osmótica hinchazón de prueba (HOST) sólo en el segundo experimento. El anfitrión fue incluido en las herramientas de evaluación debido a resultados prometedores en sementales [17, 18]. La morfología se evaluó de congelados-descongelados los espermatozoides una vez por semental.

Descongelación e incubación

El 0,5 mL pajas fueron descongelados a 37 ° C durante 30 segundos, el 2,5 mL pajas a 50 ° C durante 40 y de 5 ml para pajas 45 seg. La concentración de esperma fue medido en una cámara de Bürker contar, y el número total de espermatozoides por paja calculado. Una dosis de inseminación es una paja cuando los 2,5 o 5 mL se utilizaron pajitas y del 1 º al 10 de la paja de 0,5 mL pajas. El esperma se amplió con una cálida (+30 ° C), leche descremada extensor [19] a una concentración de 20-30 × 10 6 espermatozoides / ml.

La muestra para la prueba de la longevidad ha sido preparado por colocar 0,5 mL de semen en ampliado de 3 ml vial cerrado con una tapa. La muestra se mantuvo en un baño de agua a 37 ° C durante 4 h (Exp. 1) o 3 h (Exp. 2). El total y la motilidad progresiva y la velocidad fueron evaluados por el microscopio de luz cada hora (Exp. 1) o después de 3 h (Exp. 2).

Motilidad

El período posterior a descongelar la motilidad se evaluó con un microscopio de luz para el porcentaje de espermatozoides mótiles progresivamente, el porcentaje total de la motilidad y una velocidad de puntuación (de 1 a 3). Motilidad parámetros se midieron con un analizador automático de esperma (Hamilton Thorn Motilidad Analyzer, HTM-S, la versión 7,2, Hamilton Thorne Research, Beverly, MA, EE.UU.) a través de vídeo grabación [20]. A 7 - μ l de muestra de semen se colocó en una cámara de Makler a una temperatura de 37,1 ° C, 2 cámaras se prepararon de la misma muestra. La cámara fue colocada en la etapa controlada por termostato de la motilidad y analizador de vídeo efectuadas de acuerdo con lo descrito por Varner et al. [20]. Cuando las cintas de vídeo fueron analizados el analizador ajustes fueron: marcos a la velocidad de fotogramas 20 - 25/sec, mínimo 8 contraste, tamaño mínimo 6, baja / alta puertas de tamaño 0,6 - 1,5, baja / alta intensidad puertas 0,6 - 1,5, móviles jefe tamaño 16 , No la intensidad de la movilidad 371 de mediano VAP (velocidad media de camino) el valor 30, bajo VAP valor 10, la lentitud de células no móviles, rectitud y umbral 60. Las cintas de vídeo fueron analizados por el nivel de la demanda total (TMOT) y la motilidad progresiva (PROG), VAP y el porcentaje de espermatozoides rápida (RAP).

Integridad de membrana plasmática

Integridad de membrana plasmática se evaluó después de la descongelación, utilizando métodos de 3 Exp. 1 y 5 métodos en el Exp. 2: 1) diacetato de carboxifluoresceína / yoduro de propidio (CFDA / IP) tinción y recuento de células con un microscopio de fluorescencia, 2) la tinción PI y la medición con un fluorometer (Fluoroscan Ascenso, Thermo Electron Inc, Milford, MA, EE.UU.), 3 ) Resazurin reducción prueba con un fluorometer, 4) HOST y contar las células con un microscopio (sólo en el Exp. 2) y 5) Casa de utilizar un fluorometer (sólo en el Exp. 2). En el Exp. 1, las pruebas se realizaron una vez inmediatamente después de la descongelación, mientras que en el Exp. 2 que se repitieron después de 3 h de incubación.

Para la evaluación de la membrana plasmática con la integridad de CFDA / PI tinción, el semen se amplió con un extensor de leche descremada [19] a una concentración de 50 × 10 6 espermatozoides / ml. Alícuotas de 20 μ l de solución stock de CFDA consistente en 0,46 mg de CFDA en 1 mL de DMSO (dimethylsulpfoxide) y 10 μ l de solución stock de PI (0,5 mg PI en 1 mL de 0,9% solución de NaCl) fueron tomadas, mezclados con 950 μ l de esperma , Y se incubarán durante 8 min a 30 ° C [21]. A 5 - μ L gota se colocó en un portaobjetos y superpuesta con una hoja de cubierta. La proporción de células fluorescentes se contados a partir de 200 células en un microscopio de fluorescencia (Olympus BH2 con epifluorescente óptica, Olympus Optical Co, Tokio, Japón) usando aceite de inmersión, y un filtro de fluoresceína conjunto.

La segunda membrana plasmática viabilidad de prueba se realizó utilizando un fluorometer (Fluoroscan Ascenso, Thermo Electron Inc, Milford, MA, EE.UU.), que dice una de 96 y una micropipeta bandeja y tiene un compartimento de incubación. El filtro de interferencia en el camino de excitación y de que el filtro de emisión mostró máxima de transmisión a 544 nm y 590 nm, respectivamente. Para el ensayo fluorométricos, 20 mg de PI fue disuelto en 1 L de Beltsville Descongelación Solution (BTS) (USDA, Beltsville, MD, EE.UU.) y desarrolla en 3 mL alícuotas. Igualdad de alícuotas (50 μ l) de BTS muestra de semen diluido (80 × 10 6 espermatozoides / mL) y PI solución fueron dispensadas en un pozo y se agita suavemente durante 2 min. Espermatozoides de las mismas muestras fueron asesinados por desprotegidos rápida congelación y descongelación lenta para obtener muestras de control interno que consiste en no sólo de células viables (100% de fluorescencia). La muestra de control fue sumergido en nitrógeno líquido durante 1 minuto y, posteriormente, permitió a reposar a temperatura ambiente durante 30 segundos y luego 3 minutos en un baño de agua (37 ° C). Espacios en blanco que contiene 50 μ l de diluirse y extensor de 50 μ l de PI se analizaron por separado para cada experimento en 4 repeticiones; el tiempo de incubación fue de 8 min. El porcentaje de fluorescencia se calculó a partir de la relación de intensidades de fluorescencia de los congelados rápidamente muestra de control y la muestra a analizar, después de comparar con los valores en blanco [22].

Resazurin reducción de ensayo

Para la prueba de reducción de resazurin, 400 mg de resazurin fue disuelto en 1 L de agua destilada. Una parte de esta solución y 9 partes de NaCl 0,9% fueron mixtos [23]. Un volumen equivalente de esta mezcla diluida de esperma y se combinaron y se agita durante 2 min, luego incubadas durante 30 min a 34 ° C y se midió con el fluorometer, utilizando la misma configuración que fluorometer en la membrana plasmática viabilidad.

ANFITRIÓN

Para el anfitrión, el semen se amplió a 4 × 10 6 espermatozoides / ml. El hipo-osmótica solución fue preparada por la disolución de 1,352 g de fructosa y 0,735 g de Na-citrato de agua destilada (150 mOsm, pH 7.2). Una alícuota de 0,125 ml de espermatozoides se añadió a 0,5 ml de solución y la mezcla se incubó por 30-45 min a 37 ° C. A 5 - μ L gota se colocó en un portaobjetos y superpuesta con una hoja de cubierta. Un total de 200 espermatozoides por muestra fueron evaluados para detectar la presencia de colas dobladas en microscopía de luz [24] y también analizó con un dispositivo automático fluorometer. Por fluorométricos determinación del país de acogida, 0,5 mL de la misma hipo-osmótica solución (100 mOsmol / kg) se mezclaban con 0,125 ml de leche descremada-amplió el semen (concentración de 100 × 10 6 espermatozoides / ml). Fluorométricos El método fue el mismo que para el PI-manchados de semen. La mezcla se incubó a 37 ° C y analizados de nuevo después de 3 h.

Morfología y bacteriología

Los congelados-descongelados semen frotis fueron secadas al aire y teñidos con Giemsa de acuerdo con Watson [25]. Un total de 100 espermatozoides fueron evaluados con microscopía de luz, magnificación × 1250, para las principales anomalías (el subdesarrollo, acrosomal gránulos, otros grandes defectos acrosomal, diadema efectos, colas dobladas bajo la cabeza, Dag efectos, mediados pieza defectos, y proximal gotas) y alteraciones menores (doblada cola, cola retorcido, suelto normal jefes, los grandes jefes, acrosomes sueltas, y anormalidades leves acrosomal), de acuerdo con Blom [26].

El cultivo bacteriano se realizó mediante la difusión de una gota de cada muestra en medio de placas de agar sangre, con un 10 - μ L estéril bucle. Después de una incubación de 24 y 48 horas a 37 ° C, unidades formadoras de colonias (CFUs) fueron contabilizados y especies bacterianas reconocidas. Si más de 100 CFUs fueron detectados por muestra, el número no se calculó con mayor detalle.

Métodos estadísticos

Pearson y los coeficientes de correlación de Spearman se utilizó para estudiar la asociación entre los parámetros. Los resultados se contabilizan, tanto si los coeficientes de correlación fueron congruentes. P-valores <0,05 se consideró significativo. Los resultados se expresaron como media ± el error estándar de la media (SEM). Los sementales se dividieron en 2 grupos: foaling tasa de yeguas <60% o> 60%. La muestra independiente t-test fue usado para probar las diferencias en los parámetros de prueba de laboratorio entre los 2 grupos de sementales. El análisis estadístico fue realizado también por separado del material restringido a los sementales que tengan> 20 yeguas (19 sementales en el Exp. 1 y 16 en el Exp. 2).

Resultados
Experimento 1

El porcentaje de espermatozoides normales varían de un 51% a 89%. Las principales anomalías representaron el 9,5%, incluida la cabeza anomalías en 4,1% (1-12%), cola doblada bajo la cabeza 2,5% (0-6%), y mediados pieza defectos 2,4% (0-7%); compuesto de alteraciones menores 10,7% (3-31%), incluyendo principalmente colas dobladas 6,9% (1-29%), normal perder los jefes del 1,4% (0-7%), y suelta acrosomes 2% (0-5%). No hubo asociación entre las características morfológicas y foaling.

Un total de 52% de las muestras no mostró crecimiento microbiano, en el 41% <100 CFUs por placa se detectaron, y en 7%> 100 CFUs por placa. Los microbios fueron principalmente coagulasa-negativos estafilococos o hayan pertenecido a las familias Enterococcus, enterobacterias, o Corynebacteriaceae. No hubo asociación entre los resultados bacteriológicos y foaling.

Promedio CASA motilidad y sem fueron los siguientes: TMOT 37,0 ± 3,3, PROG 27,6 ± 2,7, y VAP 58,7 ± 2,0 y estos valores no se correlacionó con la fertilidad. Promedio motilidad progresiva evaluados en microscopía de luz mostró siguientes cambios durante el periodo de incubación: 0 h 40,2 ± 1,7 (min 10, max 60), 1 h 35,0 ± 1,4 (5, 50), 2 h 29,0 ± 1,6 (10, 40), 3 h 24,9 ± 1,7 (10-40), y 4 h 21,0 ± 1,7 (5-40). Motilidad progresiva correlacionaron significativamente con la tasa de foaling después de 2-4 h de incubación (coeficientes de correlación 0,39 - 0,51, p <0,05). Sementales (> 7 yeguas), con tasas de foaling> 60% parece conservar la motilidad espermática ligeramente mejor que con sementales foaling tasas de <60%, aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa (Fig. 1]. Del mismo modo, el semen resultante en las tasas de foaling> 60% mostró mayor integridad de membrana plasmática porcentajes medidos con fluorometer de semen resultante en las tasas de foaling <60%, pero las diferencias no fueron estadísticamente significativas (Fig. 2].

La concentración de espermatozoides y el número total de espermatozoides en una dosis de AI mostró gran variación: la concentración media ± sem 383,2 ± 48,6, min 45, max 1593, y el número promedio de espermatozoides / dosis AI 713,2 ± 47,2, min 302, max 1777. Cuando sementales haber> 20 yeguas fueron analizados, el número total de espermatozoides en una dosis de AI mostró una significativa correlación negativa de 0,58 con la tasa foaling (p <0,05). El número total de espermatozoides / AI dosis y la concentración de esperma para semental foaling grupos con tasas <60% o> 60% se muestra en la Fig. 3, la diferencia es significativa (p <0,05). Para todos los demás parámetros de los coeficientes de correlación con la fertilidad son bajas y no significativas.

Cuando los distintos parámetros se compararon entre sí, todos los parámetros de motilidad correlación significativa entre sí (coeficientes de correlación variaron de 0,44 a 0,81), del mismo modo la membrana plasmática pruebas de integridad mostró correlaciones significativas entre sí (0,37 - 0,83). CFDA / PI tinción con microscopía de luz y con un fluorometer también correlacionó significativamente con la motilidad progresiva antes de la incubación. El número total de espermatozoides / dosis AI mostró una significativa correlación negativa con los otros parámetros, excepto con motilidad progresiva durante el periodo de incubación (3-4 h) y CFDA / IP con microscopía de luz.

Experimento 2

El promedio de HOST-valores fueron de 30,1 ± 1,6 (18-49) antes de la incubación y 21,7 ± 1,6 (9-46) después de 3 h de incubación. Un importante coeficiente de correlación de -0,50 con foaling tasa (p <0,05) se puso de manifiesto antes de la incubación. El promedio de CFDA-valores obtenidos en microscopía fueron 42,9 ± 2,4 (14-66) antes de la incubación y 33,0 ± 1,8 (12-48) después de 3 h de incubación. Cuando sementales haber> 20 yeguas fueron analizados, CFDA / PI tinción con microscopía de luz a 0-h de incubación y de acogida con fluorometer después de 3 h de incubación mostró coeficientes de correlación de 0,5 con foaling tipo (p> 0,05). El anfitrión resultados en 2 semental grupos divididos por sus tasas de foaling se muestran en la Fig. 4. Para otras pruebas, los coeficientes de correlación con foaling tasa se baja y no significativa. El TMOT PROG y valores de sementales con las tasas de foaling <60% y> 60% se muestra en la Fig. 5.

Cuando los distintos parámetros se compararon, TMOT, PROG, VAP, y PAR correlación después de la 0-h-y 3 h incubaciones, coeficientes de correlación que van desde 0,5 a 0,8. CFDA, HOST y resazurin tanto por microscopía y fluorometer correlación después de la 0-h y 3 h-incubaciones con coeficientes de 0,4 - 0,8, pero no se demostró la correlación entre estos parámetros y los parámetros que representan la motilidad. Antes de incubación, la concentración mostraron una significativa correlación negativa con CFDA / PI tinción, utilizando microscopía de luz y la fluorometer, pero esta correlación desapareció después de las 3 h de incubación.

Discusión

No existe una prueba única se mostró como un método fiable constante para predecir la capacidad de fertilización del semen. Los resultados de Exp. 1 no puede ser repetido, a pesar de que la sementales y los métodos utilizados eran en parte similares. Las diferencias en los resultados de estos experimentos podrían explicarse también por los diferentes lotes de eyacular.

Membrana plasmática pruebas de integridad

Algunos tendencia de la membrana plasmática pruebas de integridad a ser indicadores de mayor foaling tasas se observó en nuestro estudio. Fluorómetros no han sido muy utilizados en el examen de semen semental. Aunque no fuerte correlación con la tasa de foaling fue encontrado, las diversas mediciones fluorométricos hizo correlacionan con la integridad de membrana plasmática en microscopía de luz y con los demás. El uso de fluorómetros tiene algunas ventajas en comparación con el uso de microscopía de luz: se requiere menos tiempo, y más células en la muestra son evaluados [14]. En verracos [27] y los toros [28], fluorométricos mediciones se correlacionaron con los parámetros de fertilidad.

Neild et al. [29] no encontró relación significativa entre el anfitrión y la fecundidad, sino una tendencia a que el anfitrión de correlación con el número o servicios por preñez. Hemos detectado tanto negativas como positivas las correlaciones, lo que sugiere que esta prueba no es adecuado para la evaluación de congelados-descongelados semen semental. Nie et al. [30] informó de las tasas de embarazo más bajos para HOS + grupo. Blach et al. [12] encontraron evidencia indirecta de que muchos immotile espermatozoides poseen una membrana plasmática intacta, lo que indicaría que estos dos parámetros no se correlacionan entre sí. En nuestra primera experiencia, integridad de membrana plasmática con microscopía de luz correlacionado con muchos otros parámetros, incluida la motilidad. Esto está en desacuerdo con el estudio de Samper [13] señaló que la integridad de membrana para mostrar extremadamente pobre correlación con la motilidad, sobre todo en conservas de esperma. Del mismo modo, en nuestro segundo experimento correlación entre la motilidad y la integridad de membrana plasmática no se observó.

Motilidad

Motilidad correlacionado con la fertilidad en nuestro primer experimento, pero no en el segundo. Una explicación puede ser pre-selección de esperma. La mayoría de los laboratorios utilizan el 30% como valor umbral, al aceptar el semen para la venta. La tarea más importante de pruebas de semen es excluir esperma de baja calidad, y esto ya se ha hecho en los laboratorios que había exportado el semen. Otra explicación es el uso de diferentes lotes de varios ejaculates de cada semental, pero aún así la pregunta sobre la exactitud de la motilidad evaluación como un medio de predecir la fertilidad se plantea. El esperma de un semental con el mayor motilidad progresiva (60%) no produjo ningún embarazos en 10 yeguas inseminadas. Motilidad ha sido reclamado por otros investigadores para ser un pobre predictor de las tasas de embarazo [6, 31]. Sin embargo, Voss y sus compañeros de trabajo [6] sugirió que, si bien la relación entre la motilidad y la fertilidad es pobre en el semental, spermatozoal la motilidad y la calidad de la motilidad son todavía las más fiables estimaciones de la fecundidad en la práctica. Por otra parte, Jasko et al. [32] reportaron correlaciones significativas entre los parámetros de la motilidad y la fertilidad. Newcombe [33] informó de que los embarazos por inseminación de semen cuando se redujo con baja motilidad fue utilizado. VAP es fiable o no repetible, de acuerdo con Kirk et al. [34]. La motilidad resultados inmediatamente después de la descongelación no necesariamente predicen los resultados después de la incubación, como se vio con motilidad progresiva en nuestro primer experimento. Longevidad pruebas por lo que puede ser útil para evaluar la viabilidad del esperma, aunque Voss et al. [6] sugiere que la longevidad puede ser de un valor limitado para predecir el potencial de fertilidad. A pesar de estas contradicciones entre los estudios, la motilidad sigue teniendo valor como una forma fácil y económica para la estimación relativa de células salud.

Sperm número y la concentración

El número total de espermatozoides / AI dosis y la concentración correlacionado negativamente con muchos parámetros. Esto puede explicarse por la tendencia a aumentar la dosis de IA y, por tanto, la concentración - el volumen de una paja se limita - cuando baja después de descongelar la motilidad se detecta a aumentar el número de espermatozoides mótiles progresivamente y, por consiguiente, la posibilidad de embarazo [35]. Esta práctica sólo es eficaz hasta cierto punto; Amann [11] presentó una curva dosis-respuesta muestra que la fecundidad deja de mejorar la crítica como el número de espermatozoides necesarios para obtener la máxima fertilidad de un determinado sexo masculino se ha alcanzado. Altas dosis de concentración y puede incluso disminuir la fertilidad. Alto número de espermatozoides y la concentración más intenso provocado respuestas inflamatorias en el útero [36, 37]. Espermatozoides en las dosis más altas de AI llegó a la oviducts más tarde de espermatozoides que figuran en pequeñas dosis [37]. La fecundidad se redujo cuando la dosis que figuran AI> 900 × 10 6 espermatozoides congelados [35].

Morfología

En nuestro estudio, el porcentaje de esperma morfológicamente normales y las tasas de foaling no se correlacionó, tal vez porque el semen con un alto porcentaje de anomalías morfológicas no es congelado. Jasko et al. [38, 32] puso de manifiesto el porcentaje de espermatozoides normales que tienen una correlación positiva con la fertilidad. Sin embargo, Voss et al. (1981) observó una variación considerable en las características morfológicas entre los sementales y entre ejaculates dentro de sementales. Sugirieron que spermatozoal morfología puede no ser tan valiosa en la evaluación del potencial de fertilidad en el semental como lo es en otros grandes animales domésticos.

Los problemas de fertilidad en estudios de caballos

Los problemas enfrentados en anteriores estudios de fecundidad también son evidentes aquí. El número de hembras inseminadas por semental era pequeña, la paja no eran del mismo lote, foaling tasas fueron recogidos durante varios años - la fertilidad de sementales puede variar entre años y disminuir con la edad. Inseminación condiciones, veterinaria competencias, la gestión de las explotaciones estudios, los criterios de selección de yegua, etc varían considerablemente. Muchos otros factores, además de influir en las características del semen de fertilidad. Aunque la obtención de las tasas de embarazo es difícil, es más precisa y fiable que las tasas de foaling. Sin embargo, esto no elimina otros factores que afectan la fertilidad, como la gestión y el desempeño reproductivo de yeguas, su anterior estado reproductivo, así como posibles factores genéticos [32]. A multi-center estudio de Samper et al. [35] resume los principales factores que afectan a las tasas de embarazo de yeguas criadas con semen congelado: el técnico, mare edad y condición, la inseminación volumen, el momento de la inseminación, y el número de espermatozoides por dosis. La normalización de todas estas variables es evidente que no es posible.

Desarrollo de métodos de congelación de semen semental depende de la fiabilidad de encontrar correlaciones entre las pruebas de laboratorio y la fecundidad, que parece muy difícil de lograr ya que los resultados de diferentes estudios en este campo tienden a ser contradictive. El presente estudio fue incapaz de abordar la cuestión de que las pruebas de laboratorio que predecir con precisión la fertilidad de producida comercialmente semen semental. La objetividad, repetibilidad y precisión son requisitos básicos para los ensayos de laboratorio, pero muchos análisis de semen pruebas no cumplan estos requisitos [7]. El control de calidad de semen semental criopreservados sigue siendo un problema en la práctica, cuando por ejemplo, la citometría de flujo no está disponible. A efectos prácticos, sería más importante para identificar las muestras de esperma que pueden fertilizar pobres tienen potencial [4]. Nie et al. [30] llegó a la conclusión de que la evaluación de espermatozoides frescos ofrecen ninguna ventaja para el embarazo más simplemente inseminating con espermatozoides no seleccionadas para cualquier características particulares.

Las limitaciones a la cría de caballos - un pequeño número de yeguas por eyacular y por semental y la tremenda yegua variaciones en la gestión y la inseminación - nunca nos permiten llevar a cabo ensayos similares a lo que el ganado ha hecho la industria en el desarrollo de métodos de congelación y las técnicas de IA. Fertilidad de los juicios de caballos están obligados a ser de poco valor, debido a estas razones [16].