Journal of Nanobiotechnology, 2006; 4: 7-7 (más artículos en esta revista)

Fagocitosis en respuesta a totalmente controlado plural estimulación de los antígenos por los macrófagos en el uso de chip microcultivation sistema

BioMed Central
Kazunori Matsumura (matsumura_kazunori@bpx.cu-tokyo.ac.jp) [1], KAZUKI Orita (orita_kazuki@bpx.cu-tokyo.ac.jp) [1], Yuichi Wakamoto (wakamoto_yuichi@bpx.cu-tokyo.ac . jp) [1], Kenji Yasuda (cyasuda@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp) [1]
[1] Departamento de Ciencias de la Vida, Escuela Superior de Artes y Ciencias, La Universidad de Tokio, 3-8-1 Komaba, Meguro, Tokio 153-8902, Japón
[2] División de Biosystem, Instituto de Bioingeniería y Biomateriales, Tokio y Médico Dental University, 2-3-10 Kanda-Surugadai, Chiyoda-ku, Tokio 101-0062, Japón

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Resumen

Para entender el mecanismo de control de la respuesta inmune innata en los macrófagos, una serie de fagocitosis en plural las respuestas a la estimulación de los antígenos en células idénticas se observó. Dos zymosan partículas, que se utilizaron como antígenos, se pusieron en diferentes superficies de un macrófago utilizando pinzas ópticas en un chip en un solo sistema de cultivo de células, que mantiene aislado de las condiciones de cada uno de los macrófagos durante su cultivo. Cuando los dos zymosan partículas se adjunta a la macrófagos al mismo tiempo, los macrófagos y respondió phagocytosed tanto de los antígenos al mismo tiempo. Por el contrario, cuando el segundo antígeno se adjuntó a la superficie después de la primera se había iniciado la fagocitosis, los macrófagos no respondió a la segunda estimulación durante los primeros fagocitosis, la segunda fagocitosis comenzó sólo después de que el primer proceso ha terminado. Estos resultados indican que (i) la fagocitosis en un macrófago no es un proceso independiente cuando hay estímulos plural, (ii) la respuesta de los macrófagos a la segunda estimulación está relacionada con el tiempo "demora desde el primer estímulo. Estímulos que se producen en intervalos de tiempo corto se debió a la fagocitosis simultánea, mientras que un segundo estímulo que se retrasa el tiempo suficiente podría ser descuidado hasta la conclusión del primer proceso de fagocitosis.

Fondo

Fagocitosis como mecanismo efector de la respuesta inmune innata podría ser activado por el embargo de los antígenos de la superficie de macrófagos. La proteína basada en la comprensión de las vías de procesamiento de señales de inmunidad innata a los microorganismos como Los receptores tipo Toll (TLR), nucleótidos vinculante oligomerización de dominio (NOD) proteínas, y la diferenciación mieloide primaria de proteínas de respuesta 88 (MyD88) para las familias de agentes patógenos asociados patrones moleculares (SMOP), ha contribuido al desarrollo de terapias para las enfermedades de inmunodeficiencia humana [1, 2]. Sin embargo, todavía es difícil de explicar la variabilidad de las respuestas provocadas por la falta de conocimiento del mecanismo de modulación de la respuesta inmune de los macrófagos único contra antígenos múltiples estímulos. En otras palabras, todavía no sabemos si el procesamiento de señales puede trabajar simultáneamente y de manera independiente contra una pluralidad de estímulos de antígenos en diferentes lugares en la superficie de un solo macrófagos.

Para comprender el complejo mecanismo de procesamiento de señales que ocurre en la fagocitosis cuando existen múltiples estímulos a los macrófagos, tenemos que dar una serie de estímulos totalmente controlado a un hecho aislado los macrófagos único paso a paso en virtud de circunstancias aisladas. Esto se debe a que con el grupo convencional basada en el cultivo en un plato, y la estimulación de los antígenos con el objetivo macrófagos normalmente se hace en una forma incontrolada probabilístico. Por otra parte, el contacto físico con otros macrófagos podría también influir en la respuesta fagocitaria de los macrófagos.

En este trabajo, presentamos el curso temporal de la fagocitosis de un hecho aislado único macrófagos contra una pluralidad de estímulos con antígenos. En el experimento, para evitar los efectos de factores inesperados, hemos utilizado nuestras herramientas de chip único sistema de cultivo de células para dar plenamente controlados a los estímulos aislados macrófagos, y luego medir su respuesta a esos estímulos.

Métodos
El chip de un solo sistema de cultivo celular

Anteriormente, hemos desarrollado un chip de un solo cultivo de células del sistema aprovechando el microfabrication técnica y óptica de captura. Hemos aplicado este sistema para medir el proceso de adaptación de aislados E. coli, para medir el tamaño y el patrón de dependencia de la comunidad efecto de miocitos cardíacos, y para medir la respuesta de una sola célula basada en redes neuronales patrón en un chip [3 - 9]. El sistema nos permite mantener la condición de alrededor de las celdas constante bajo condiciones aisladas, y también podemos físicamente añadir o eliminar otros microorganismos mediante el uso de trampas ópticas. Las células individuales en microchambers se puede observar con una resolución espacial de 0,2 μ m de phase-contrast/fluorescence microscopía.

Para medir la respuesta de los macrófagos, como se ilustra en la Fig. 1 (a], el protocolo fue el siguiente: el primer antígeno (zymosan) fue atrapado por pinzas ópticas y aplicada para estimular la macrófagos, luego el segundo antígeno fue atrapado por otro pinzas ópticas y se aplica para estimular el otro lado de la misma macrófagos; después de la estimulación, un cambio en la forma fue observado por lapso de tiempo de grabación durante un largo período. Figura 1 (b] representa la puesta en marcha de la en-chip único sistema de cultivo de células. Los macrófagos se cultivaron en el set de chips microchamber en el cultivo plato. Temperatura, humedad y otras condiciones del plato estaban completamente controlados por la etapa del microscopio durante el cultivo a largo plazo lapso de tiempo de observación con un dispositivo acoplado por carga (CCD) cámara (CS220, Olympus) relacionados con la captura de vídeo-ordenador sistema. Dos independientes 1064-nm de longitud de onda de infrarrojos pinzas ópticas (máx. 1,5 W; PYL-1-1064-M, IPG Photonics, Oxford, MA, EE.UU.) se organizaron en este sistema para manejar dos antígenos al mismo tiempo. Figura 1 (c] muestra una sección transversal vista de la microchamber de diseño fabricados en el cultivo de chips, en la que una fina capa de fibronectina y 75 - μ m de espesor microestructuras en una capa de agarosa fueron fabricados. Para escudo fibronectina (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón) sobre el lavado de diapositivas de vidrio (vidrio techno Asahi Corp, Chiba, Japón), 1 ml de 6 - μ g / μ l de solución de fibronectina (en tampón fosfato salino; PBS) se depositó . El dispositivo se incubaron durante 2 h, enjuagar con PBS, lleno de 3 ml de Manejo Forestal Sustentable del macrófago-medio, y se coloca en el 5% de CO 2 incubadora a 37 ° C. Para formar la microestructura de agarosa en el chip, 1480-nm centrado rayo láser infrarrojo es irradiado para fundir una parte de la capa de agarosa. Figura 1 (d] muestra la parte superior de la vista de la microchambers utilizado en este experimento. Los macrófagos se cultivaron en cada microchamber bajo condiciones aisladas.

Preparación de la muestra y cultivo

Macrófagos alveolares se aislaron de cinco semanas de edad, los ratones machos CBA (Charles River Laboratories, Inc, Wilmington, MA). Inmediatamente después de sacrificar los animales por dislocación de la columna vertebral, los pulmones se lavaron con 1 ml de suero-macrófago-Free medio (SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las suspensiones de células (1 × 10 2 células / ml) fueron chapados en un recubiertos de fibronectina microchamber gama e incubadas a 37 ° C en el 5% de CO 2 incubadora. Después de una incubación de 2 h, otras no-adherente células como los eritrocitos fueron retirados por el lavado. A continuación, el plato se trasladó a la en-chip de un solo sistema de cultivo de células. Zymosan partículas (Molecular Probes, Eugene, OR) se reconstituyó en un macrófago de la ordenación forestal sostenible a medio y vortexed enérgicamente. Para estimular las células, 5 μ l de 100 partículas / μ l zymosan resuspendido solución se aplicaron para el chip. Durante el en-chip de cultivo se registraron cambios en la superficie la forma de macrófagos, y hemos definido la hora de comienzo de la fagocitosis a ser cuando la superficie la forma de macrófagos en el punto de zymosan archivo adjunto comenzado a mostrar cambios concretos.

Resultados y discusión

En primer lugar, después de que el cultivo se inició en el chip, al mismo tiempo estimula la aislados macrófagos con dos zymosan partículas de lados opuestos utilizando dos pinzas ópticas, como se muestra en la Fig. 2. Los dos zymosan partículas se adjunta a la macrófagos dentro de 6 s de unos a otros (Fig. 2 (d)] de la dirección opuesta. Fagocitosis comenzado en un plazo de 30 s en ambos lados, y ambos fueron zymosan partículas phagocytosed simultáneamente. El proceso de fagocitosis procedió de la misma manera y terminó casi al mismo tiempo (343 s desde el inicio). Seis más experimentos producen los mismos resultados: el segundo, cuando la estimulación se produjo a los 10 s de la primera estimulación, se produjo simultáneamente la fagocitosis.

A continuación, se estimuló la aislados macrófagos con dos zymosan partículas con diferentes plazos (Fig. 3]. Al igual que en el anterior experimento, lo primero que estimuló un lado de la macrófagos con zymosan de partículas usando pinzas ópticas (Fig. 3 (a-c)]. Just 117 s después de confirmar el inicio de la fagocitosis en el primer archivo adjunto (Fig. 3 (d)], que atribuye el segundo zymosan de partículas a la superficie de los macrófagos (Fig. 3 (e)]. Entonces, como se muestra en la Fig. 3 (e-g], aunque el segundo zymosan se adjuntó a la superficie de los macrófagos, fagocitosis no comenzó hasta el primer proceso de fagocitosis se terminó (Fig. 3 (h)]. Cabe señalar que el tiempo requerido para iniciar el segundo proceso de fagocitosis fue inferior a 10 s después de la finalización del primer proceso. Por otra parte, el tiempo necesario para completar la fagocitosis para el primer estímulo fue de aproximadamente 590 s, mientras que tomó s 1140 para el segundo estímulo - aproximadamente el doble de largo. Cuando el segundo estímulo se produjeron más de 90 s después de la primera estimulación, la misma respuesta tardía del segundo fagocitosis se observó en los cuatro posteriores experimentos.

Para confirmar la magnitud de la variabilidad de la fagocitosis, que mide también el proceso de fagocitosis de células individuales en el caso de una sola estimulación de zymosan. La figura 4 muestra un ejemplo del proceso de fagocitosis. El promedio de tiempo (de seis muestras) para el inicio del archivo adjunto después de la fagocitosis fue de 97 s, y es 748 s para completar el proceso de fagocitosis.

Los resultados indican que el retraso del segundo estímulo puede producir una respuesta diferente en el segundo proceso de fagocitosis de los macrófagos en función de las fechas del segundo estímulo. Si el segundo antígeno estimulación comenzó a los 10 s de la primera estimulación, la respuesta de los macrófagos es simultánea. Por el contrario, si el segundo estímulo se retrasó más de 47 s después de la primera estimulación, la fagocitosis de la segunda estimulante no comenzó hasta después de la primera se terminó la fagocitosis. A medida que el tiempo de espera para el segundo fagocitosis (480 s en la Fig. 3] fue mucho más largo que la variabilidad del tiempo de arranque de la fagocitosis (un promedio de 97 s, máx. S 155 en la Fig. 4], el retraso en el proceso después de la segundo estímulo no se debe a la variabilidad de la fagocitosis, pero al parecer debido a la negligencia durante el primer proceso a pesar de que la célula había sido estimulada por el segundo estimulante. Las dos respuestas diferentes macrófagos a dos estímulos indican que existe algún mecanismo para controlar el calendario de la fagocitosis en el caso de que existan varios estímulos. Esto demuestra el potencial de la fagocitosis simultánea de dos partículas zymosan en diferentes áreas en el macrófago, tal y como se muestra en la Fig. 2. Asimismo, indica que el proceso de fagocitosis inicial puede prevenir un posterior proceso de fagocitosis se producen durante el primer proceso.

Una posible explicación es que puede haber una reunión de los receptores en la membrana celular para el primer antígeno, y esto puede causar una falta de capacidad para el segundo sentido la estimulación en el lado opuesto hasta que los receptores son liberados a partir del primer antígeno. El mismo fenómeno de la recopilación de sensor se informó de proteínas en las células T receptores [10 - 12]. Si el movimiento de detección de proteínas en los macrófagos es la explicación para estas diferencias en la respuesta, el sensor de proteínas debe moverse más rápido que 1 μ m / s (10 μ m de circulación de menos de 10 s) para responder a la segunda antígeno dentro de los 10 s después la primera es la fagocitosis terminado (ver Fig. 3]. Es decir, los sensores deben dispersar las moléculas de un lado de los macrófagos a los demás (ca. 10 μ m de diámetro) en 10 s. Esta velocidad es la difusión dentro de la magnitud de la velocidad de difusión libre de proteínas de la membrana celular, 5-10 μ m 2 / s. En cambio, estudios recientes encontraron que la difusión de muchos tipos de proteínas transmembrana en la membrana celular son mucho más bajos que los que están en las membranas artificiales reconstituido por un factor de tanto como 10 a 100, debido a que la transmembrana son proteínas corralled, o sean objeto de difusión hop [ 13, 14]. Desde este punto de vista, el movimiento del sensor de proteínas para la fagocitosis parece que se asemejan a la libre difusión en lugar de proteínas transmembrana anclado hop o difusión transmembrana proteínas.

En conclusión, se aplicó en un único chip-sistema de cultivo de células para medir plural estimulación de los antígenos en la superficie de aislados macrófagos y encontró que un retraso en segundos de estimulación puede ser descuidado hasta la primera fagocitosis fue completa. Este fenómeno indica que la fagocitosis sistema no funciona independientemente de la condición del otro lado de la celda.

Autores de las contribuciones

KM, KO, y YW llevó a cabo la microchamber diseño, la preparación de células, única célula de observación, análisis de imágenes y también redactó el manuscrito. Sus contribuciones son iguales. KY concibe el estudio y participó en su diseño y la coordinación. Todos los autores (KO estuvo representada por KY) leído y aprobado el manuscrito final.

Nota

La autorización de Ética N º 42 (a Yasuda Lab., Abril 1 2005, a 31 de marzo de 2006) se obtuvo de la Organización Permiso éticos de la experimentación con animales en la Escuela Superior de Artes y Ciencias, La Universidad de Tokio.

Agradecimientos

Damos las gracias al Prof S. Kouno y el doctor K. Yanagihara por su asesoramiento sobre los preparativos para la adquisición de los macrófagos. El apoyo financiero, siempre y en parte por el Japón de Ciencia y Tecnología Organización (JST) y de subvenciones para la investigación en Ciencias del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón, se agradece.