Journal of Nanobiotechnology, 2006; 4: 8-8 (más artículos en esta revista)

Una nanopartícula basado en la inmovilización de ensayo para prión estudio de la cinética

BioMed Central
Gilles K Kouassi (gkk2@psu.edu) [1], Joseph Irudayaraj (josephi@purdue.edu) [2]
[1] Agrícola y Biológica de Ingeniería, La Universidad Estatal de Pennsylvania, State College, University Park, PA 16802, EE.UU.
[2] Bindley Centro de Biociencias, Universidad de Purdue, 225 S. University St, West Lafayette, Indiana 47907, EE.UU.

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Resumen

Magnético recubierto de oro y nanopartículas magneticas fueron sintetizados por co-precipitación del hierro férrico y cloruros, y por el método micromicelles, respectivamente. Fueron sintetizados nanopartículas funcionalizadas para llevar carboxilo y fracciones de aminoácidos y utilizados como portadores de proteína prión carbodiimide después de la activación en presencia de N-hydroxysuccinimide. La unión de la proteína prión recombinante (huPrPrec) a la superficie de estas nanopartículas fue confirmada por FTIR y el tamaño y las estructuras de las partículas se caracterizaron por microscopía electrónica de transmisión. Las conclusiones indican que la tasa de prión vinculante aumentó sólo ligeramente cuando la concentración de priones en el medio de reacción se incrementó. Constantes de velocidad de carácter vinculante son muy similares a Fe 3 O 4 @ Au y Fe 3 O 4-LAA cuando las concentraciones de proteína fueron: 1, 2, 1,5, 2,25 y 3,57 μ g / ml. Para un 5 μ g / ml concentración de huPrPrec la unión constante de velocidad fue mayor para el Fe 3 O 4-LAA partículas. En este estudio se allana el camino hacia la formación de complejos de la proteína prión en un 3-dimensional estructura que podría revelar oscuros fisiológicos y patológicos de la estructura y la cinética de la proteína prión.

Fondo

Enfermedades priónicas también llamado encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) son un grupo de enfermedades degenerativas que incluyen la acumulación pronunciada, en ciertas regiones del cerebro, de un isómero misfolded PrP sc celular de la proteína prión (PrP c) [1 - 3]. La encefalopatía espongiforme de los bovinos, la tembladera en ovinos, Gerstmann-Straussler Scheinker en humanos, y Creutzfied-Jakob son causados debido a la misfolding de proteínas denominado proteína prión [1 - 4]. Comprender la base de las enfermedades priónicas gira en torno a la comprensión de cómo la proteína normal, PrP c se convierte en su forma anormal, PrP sc. Hipótesis sugieren que la infección por priones se asocia con una conformacionales de transición entre las dos formas [1 - 5]. En un sentido más amplio, los priones son elementos que difundir y propagar la variabilidad a través de una multitud de conformaciones de las proteínas celulares normales [6]. Sin embargo, el mecanismo por el cual se produce esta conversión no está claramente conocido. Cui et al. [6] y Spencer et al [7] propone que esta conversión implica un cambio en la conformación de una estructura rica en α-hélice a un rico en β-hoja a través de un arreglo espacial y la molécula plegables.

La proteína se desarrolla está asociada con la interrupción de las interacciones que conduzcan a una pérdida en la estructura secundaria (el pliegue de hélices-α, β-capítulos y vueltas, y estructura terciaria - el embalaje secundario de los elementos estructurales y los aminoácidos cadenas laterales [8 ]). En las dos últimas décadas una preocupación fundamental que se plantea es sobre las cuestiones de las enfermedades relacionadas con el prión. Por ejemplo, la carne exportada del Reino Unido ha sido prohibido por una serie de países como medida de precaución contra la encefalopatía espongiforme bovina (EEB), tras el importante brote de enfermedad de las vacas locas en 1996. Aunque la causa de la infección sigue siendo desconocida, se sugirió que harina de carne y hueso importados de otros países puede haber sido incorporados a los piensos suplementos antes de que estos países podrían adoptar una adecuada estrategia de control de alimentación [9]. En 2003, la EEB fue detectado en una vaca en Canadá y otra en los EE.UU. que conducen a la muerte de más de 2700 animales y la posterior realización de pruebas para rastrear la historia y la fuente de contaminación [10]. Métodos adecuados para detectar la pantalla y las enfermedades relacionadas con el prión podría impedir la matanza masiva de animales y al mismo tiempo garantizar la seguridad de los animales basada en los productos alimenticios. Desde la identificación y cuantificación de las proteínas y su mecanismo de plegado son muy importantes en el diagnóstico de las enfermedades, los enfoques basados en la nanotecnología podría ser utilizado para desarrollar la detección de ensayos que son muy sensibles con capacidad para diferenciar entre los elementos estructurales [11].

Es bien sabido que interacciones covalentes entrecruzamiento de grupos funcionales de proteínas ha demostrado ser un enfoque muy útil en el estudio de la estructura-función de proteínas en relación [12]. Por otra parte, información sobre plegamiento de proteínas puede ser mejor evaluada y la molécula manipulada a través de estrategias adecuadas bioconjugation utilizando enfoques basados en la nanotecnología. Nanoestructuras podría ser interpretado como una elección natural. La estructura-función de la relación de las proteínas o su estabilidad depende de la combinación de varias propiedades que tienen que ser cumplidas por los aminoácidos en una determinada posición en la proteína. Por ejemplo, una relación entre la estabilidad de las fracciones hidrófobas y el enterrado de residuos conformacionales con la estabilidad se ha encontrado [13]. Esto sugiere que la conformación que involucra el 3-dimensional disposición de la molécula de proteínas afecta a su funcionalidad. El examen de la 3-D permite la estructura de proteínas para exhibir conformaciones que puede revelar detalles de su estructura y ayudan a comprender su actividad [13]. Conformacional se produzcan cambios moleculares a través de distintos dominios, tal y como se define por su carácter vinculante para los fragmentos de anticuerpos monoclonales. Sin embargo, un piso 2-D de superficie ofrece menos capacidad vinculante que un 3-D estructura, lo que aumenta considerablemente la sensibilidad de medición [15]. Por otra parte, el 3-D estructura rendimientos superiores señal más de un sustrato plano y aumenta la cantidad de proteína adsorbida por unidad de superficie [16]. En este contexto, las nanopartículas de metal podrían servir como posibles portadores y / o materiales de anclaje para las biomoléculas. Nanopartículas magnéticas, por ejemplo, se han reportado como estructuras de apoyo para los materiales biológicos entre ellas proteínas, péptidos, enzimas, ADN, debido a su singularidad [17 - 19]. Moléculas marcadas magnéticamente podrían ser dirigidos o llevados a un lugar específico en un sistema biológico mediante campos magnéticos adecuados. Sin embargo, la agregación es un problema conocido cuando la utilización de nanopartículas magnéticas. Mientras que las nanopartículas magnéticas tienen ventajas únicas, considerable atención también ha sido colocada en la funcionalización de nanopartículas de oro por su excelente biocompatibilidad y establecido los protocolos de síntesis. Por otra parte, la posible aplicación de la química tiol de oro en superficie permite la fijación de moléculas con relativa facilidad utilizando diversos enlaces tiol [20 - 23]. Por lo tanto, cuando las nanopartículas magnéticas está revestida con una concha de oro, el carácter magnético y los atributos podrían conservarse, y todas las ventajas de las superficies de oro podrían aprovecharse en las zonas de biosensores y bioseparations cuando tal biocomplex es funcionalizado.

En el presente estudio, se presenta la cinética de unión de la proteína prión para magnético recubierto de oro y nanopartículas magnéticas, después de la modificación de la superficie química de estos materiales. La modificación de las nanopartículas magnéticas consiste en la chemosorption de L-ácido aspártico (LAA), mientras que el oro recubierto las nanopartículas magnéticas se carboxylated utilizando mercaptopropionic ácido. La unión de la proteína prión de las partículas se logró inmediatamente después de la activación de carbodiimide en presencia de N-hydroxysuccinimide. El cambio en la tasa de obligatorio en respuesta a la variación de la densidad de proteínas en el medio de reacción también fue examinado.

Resultados y discusión

Las partículas en general tienen una forma esférica y cubren una distribución de tamaños de partículas. La Fe 3 O 4 @ Au nanopartículas son más grandes y están en el rango de entre 8 y 13 nm, mientras que Fe 3 O 4-LAA tenían entre 5 y 9 nm. La diferencia de tamaño se debe a la capa de oro, en el supuesto de que la concha de oro en todo el partículas magnéticas contribuye a un aumento de tamaño. TEM imágenes de Fe 3 O 4 @ Au nanopartículas (a) y huPrPrec funcionalizado con recubrimiento de oro nanopartículas magnéticas (Fe 3 O 4 @ Au-huPrPrec) (b) se muestran en la Figura 1, y Fe 3 O 4-LAA nanopartículas (a) huPrPrec funcionalizado y nanopartículas magnéticas - Fe 3 O 4-LAA-huPrPrec (b) se muestran en la Figura 2. La presencia de la concha de oro en todo el nanopartículas magnéticas fue confirmada por la diferencia en los espectros de absorción de oro puro y Fe 3 O 4 @ Au coloide preparados de la misma manera. La banda de absorción del coloide de oro se observó que tiene su máximo en 528 nm, mientras que el Fe 3 O 4 @ Au coloide exhibió un máximo a 558 nm (Figura 3]. Los resultados obtenidos fueron consistentes con los reportados por Junio et al. [22] y Rivas et al. [24] para la absorción máxima (526 nm) de oro puro coloide, mientras que la absorción máxima para la Fe 3 O 4 @ Au era compatible con el valor informado de Junio et al. [22].

La incorporación de grupos carboxilos en la Fe 3 O 4 @ Au partículas consistió en colocar las nanopartículas para dos noches en una solución etanólica de 3-SM vinculante para permitir que se produzca entre el oro y la superficie grupo tiol a través de la bien conocida tiol química. Para la funcionalización de nanopartículas magnéticas, LAA fue quimisorbido [23] en la superficie de partículas para proporcionar una superficie de partículas con carboxilo y grupos amino. Estos grupos son más activadas por carbodiimide para la inmovilización de la proteína prión. Figura 4 describe la quimisorción de ALA en Fe 3 O 4 (a), la carboxilación de Fe 3 O 4 @ Au mercaptopropionic utilizando ácido (b) y la inmovilización de la proteína prión en las partículas, por medio de la carbodiimide puente. En pocas palabras, la nanopartículas magnéticas fueron activados con ácido nítrico para favorecer la fijación de L-ácido aspártico con grupos carboxilos en las nanopartículas magnéticas. La formación de amida lazos entre ácidos carboxílicos y aminas fue catalizada por carbodiimide que activa los grupos carboxilos en los enlaces para formar O-derivados de la urea. Sucintamente, la adición de N-hydroxysuccinimide catalizó la formación de los ésteres activos intermedios más que reacciona con las aminas función de la proteína del prión a dar la amida vínculo entre la proteína y los grupos carboxilos en las partículas.

FTIR

La adsorción de monocapas y biofunctionalization de las nanopartículas son cualitativamente evaluados por espectroscopía FTIR. Figura 5 muestra los espectros de FTIR Fe 3 O 4 @ Au, Fe 3 O 4-LAA, huPrPrec, Fe 3 O 4 @ Au-huPrPrec, y Fe 3 O 4-LAA-huPrPrec. El recubrimiento de Fe 3 O 4 @ Au y Fe 3 O 4 con grupos carboxilos y LAA se señaló por la aparición de varios picos en las regiones de 1400 a 1650 cm -1 en los espectros de la Figura 5a y 5b. La multitud de pequeños picos de los espectros de desplazamiento con las características asociadas con los diversos grupos funcionales dificultan la identificación de picos específicos de carbonilo y grupos de amina en el quimisorbido regiones, lo que dificulta la diferenciación entre Fe 3 O 4 @ AuCOOH (Fe 3 O 4 @ Au teniendo grupos carboxilos) y Fe 3 O 4-LAA difícil. Spectra en la figura 5c representa a los grupos funcionales relacionadas con la pura huPrPrec a través de bandas característico de proteínas en 1490, 1541 y 1645 cm -1 ola números asignables para el estiramiento simétrico de disociar el grupo carboxílico originarios de los aminoácidos, amida amida I y II como se muestra en los espectros de la Figura 5d y 5e. En el 1415-1300 cm -1 región de los espectros en la figura 5c, d y 5e una débil banda típica de los espectros del grupo carboxilato atribuibles a las proteínas también se observó. La presencia de proteínas características en los espectros de puro huPrPrec y en los espectros de Fe 3 O 4 @ AuCOOH-huPrPrec, Fe 3 O 4-LAA-huPrPrec confirmó que efectivamente se huPrPrec obligado a las nanopartículas.

Encuadernación Cinética

huPrPrec fue inmovilizada en funcionalizado Fe 3 O 4 @ Au y Fe 3 O 4-LAA partículas después de la activación de EDC en presencia de NHS. El importe de huPrPrec fue determinada por espectrofotometría utilizando diferentes concentraciones de huPrPrec. La tasa de obligatorio expresado en el cambio en la concentración de proteína no encuadernado en el medio de reacción se midió utilizando un análisis de regresión lineal de las parcelas de huPrPrec concentración en función del tiempo. El coeficiente de variación entre repeticiones fue inferior al 4%. Figura 6a, b, c, d, e, y 6f muestran parcelas de la disminución de huPrPrec cuando las concentraciones iniciales fueron: 1, 1,5, 2, 2,25, 3,75, y 5 μ g / ml, respectivamente. Constantes de velocidad de huPrPrec presentan en el cuadro 1 se muestra un aumento en la concentración inicial de la proteína prión de aproximadamente 0,06 a 0,194 h -1, y 0,058 a 0,212 h -1 para el Fe 3 O 4 @ Au y Fe 3 O 4-LAA, respectivamente , En el rango de concentraciones de huPrPrec. Para cada concentración de proteína, la constante de velocidad es casi el mismo, con independencia del tipo de nanopartículas, excepto cuando una concentración de 5 μ g / ml de huPrPrec se utilizó. La unión se produjo gradualmente y alcanzó aproximadamente el 94%, 87%, 65%, 73%, 79% y 74% de Fe 3 O 4 @ Au y 94%, 87%, 67%, 73%, 81%, y 71 % De Fe 3 O 4-LAA, cuando las concentraciones iniciales de huPrPrec fueron 1,5, 2, 2,25, 3,75, y 5 μ g / ml, respectivamente, después de 20 h de reacción. Figura 7 muestran parcelas de la constante de velocidad como una función de la concentración inicial de huPrPrec. La tendencia observada muestra que la constante de velocidad aumentado de manera exponencial con la concentración inicial de huPrPrec. Fischer et al. [25] inmovilizada la enfermedad asociada proteína prión utilizando 0,1 mg / ml de proteína prión reaccionar para inmovilizar la enfermedad asociada solución de proteína prión en bolas magnéticas. En este sentido, hemos podido cuantificar hasta el 0,6% de 1 μ g / ml de reaccionar huPrPrec. La baja concentración de huPrPrec junto al aumento de la unión constantes de velocidad observadas con una mayor concentración de proteínas sugiere que la metodología de detección es sensible. El cuadro 2 muestra el porcentaje de huPrPrec vinculante para las nanopartículas. La tendencia es bastante similar para la inmovilización llevarse a cabo utilizando tanto los transportistas como a pesar de que la tasa global vinculante constantes fueron ligeramente más altos en Fe 3 O 4-LAA de la Fe 3 O 4 @ Au conjugados. Esto indicó que era vinculante ligeramente más eficaz cuando Fe 3 O 4-LAA complejo se utilizó. Cuanto mayor es el tamaño de Fe 3 O 4 @ Au debería haber sido favorecida por el tipo de carácter vinculante, ya que ofrece una mayor superficie, pero este no es el caso aquí, donde Fe 3 O 4-LAA exhibió una mejor afinidad. La diferencia en la afinidad de carácter vinculante podría atribuirse al hecho de que poseen LAA aminoácidos que se originó a partir de la proteína que pueden presentar mayor afinidad a la superficie de las partículas. La diferencia en las constantes de velocidad observada en esta concentración puede estar asociada con la diferencia de grupos funcionales en la superficie de las nanopartículas utilizadas. Prión es una proteína compleja entidad, y aunque vinculante numerosos socios se han encontrado a las proteínas, su función sigue siendo poco clara, ya que cada porción de la proteína tiene sus propias propiedades funcionales [26]. A pesar de importantes esfuerzos se han realizado en elucidar las enfermedades relacionadas con el prión, numerosas preguntas sobre la estructura y conformación de la proteína están pendientes de ser contestadas. Huang et al [16] demostraron que inmovilizar proteínas específicas en las nanopartículas magnéticas permite a las moléculas para ampliar y adquirir una mejor conformación que podría dar lugar a una mejora de la actividad. Como la posibilidad de mover las nanopartículas magnéticas mediante un campo magnético externo es un valor esencial para la manipulación molecular para el diagnóstico, la inmovilización de la proteína prión en magnético recubierto de oro y nanopartículas magnéticas y la cinética de los datos obtenidos en este estudio pueden contribuir a un mejor ensayo biológico en la que la proteína podría ser dirigida hacia la meta lugares como la proteína prión monoclonal de anticuerpos [8] dirigido por los campos magnéticos. Por otra parte, los datos sobre la cinética vinculante puede ser útil en el diseño y la evaluación molecular de los transportistas y en la medición de la eficacia de la superficie química. Desarrollo de metodologías para la conexión de la proteína prión de las nanopartículas magnéticas también pueden contribuir a mejorar in vivo e in vitro de manipulación de las moléculas que es esencial a dilucidar la estructura de la proteína y la consiguiente actividad.

Conclusión

Hemos demostrado la posibilidad de inmovilizar a huPrPrec magnético recubierto de oro y nanopartículas magnéticas de funcionalización de estas partículas con la química adecuada para soportar grupos carboxilo. La inmovilización metodologías desarrolladas en este estudio y la información sobre la cinética de prión vinculante será útil para los productos sensibles y etiqueta libre de detección de priones, las proteínas, y será útil en la evaluación de la fisiología y patología de estas proteínas. Asimismo, prevemos que la inmovilización discutieron metodologías podían aplicarse para la rápida identificación, los estudios epidemiológicos, evaluación genética, y la investigación forense.

Métodos
Preparación de nanopartículas magnéticas

Hierro (II) cloruro tetrahidratado 97%, hierro (III) cloruro hexahidrato 99%, hidróxido de sodio, anhídrido acético, ácido nítrico, 1-butanol, octanaje, el tolueno, metanol, L-ácido aspártico (LAA), cetyltrimethylammonium bromuro (CTAB) , 3-mercaptopropionic ácido (3-SM), tetrahydridoborate de sodio (NaBH 4), y buffer fosfato salino (PBS), pH 7,4 se obtuvieron de Sigma-Aldrich Inc (St Louis, EE.UU.). Tetrachloroaurate de hidrógeno (III) de hidratos (HAuCl 4) se obtuvo de Sigma-Aldrich Inc (Milwaukee, WI). Estreptovidina, una cepa de Streptomyces avidini fue adquirido de Sigma-Aldrich Inc (MO, EE.UU.) y 1-etil-3 - (3-dimethylaminepropyl) carbodiimide clorhidrato (EDC) de Pierce (Rockford, IL, EE.UU.) se utilizó para completar la streptavidina-biotina reacción a la presencia de N-hydroxysuccinimide (NHS) (Sigma-Aldrich, Allentown, PA). Humanos prión proteína recombinante histidina de etiquetado (23-231), huPrPrec se obtuvo de Abcam Inc (Cambridge, MA).

Preparación de Fe 3 O 4 nanopartículas magnéticas

Nanopartículas magnéticas Fe 3 O 4 fueron preparadas por co-hidrotermal de prepcipitation férrico y ferroso NaOH utilizando como base, tal como se describe por Kouassi et al [21]. Normalmente hierro (II) y cloruro de hierro (III) cloruro (1:2) fueron disueltos en agua nanopure en una concentración de 0,25 M iones de hierro y químicamente precipitado a temperatura ambiente (25 ° C) en varias ocasiones por la adición de NaOH 1 M para mantener un pH constante de 10. Los precipitados se calienta a 80 ° C durante 35 min bajo continuo de mezcla y lavado 4 veces en el agua varias veces y en etanol. Durante el lavado, las nanopartículas magnéticas fueron separados de los líquidos de lavado utilizando un separador magnético de fuerza superior a 20 megaoersted (MOE). Las partículas fueron finalmente seca en una estufa de vacío a 70 ° C.

Síntesis de oro recubiertos de nanopartículas magnéticas (Fe 3 O 4 @ Au)

Fe 3 O 4 @ Au se prepararon utilizando micela inversa de CTAB utilizando 1-butanol como cosurfactant y octanaje como el petróleo fase de modificación del procedimiento desarrollado por Junio et al. [22]. El tamaño de la micela inversa depende de la proporción molar de agua a los agentes tensioactivos. En este trabajo, las partículas fueron preparados por la elección de un molar ratio de agua a CTAB, como w [H20] / [CTAB] = 8. El procedimiento y los componentes del experimento fueron descritas por Junio et al. [19]. A un 2,5 ml de una solución que contiene 1 M FeCl 3, 0,5 M FeCl 2, 0,17 mol de CTAB, 0,7 mol de butanol, y 0,17 mol de octano, se añadió un 2,5 ml de solución B, con 1 M NaBH 4 y la misma composición de CTAB, butanol, y el índice de octanos como en la solución A. La mezcla se calienta a 60 ° C al mismo tiempo con rigor la mezcla durante 20 minutos para formar nanopartículas magnéticas. Una cantidad de 2 ml de una solución C que contiene 0,44 mol de HAuCl 4, 0,8 mol de CTAB, 0,25 mol butanol, y 0,011 mol de octano y un volumen equivalente de una solución que contiene 1,6 D M NaBH 4, 0,8 mol de CTAB, 0,25 mol de butanol, y 0,11 mol de octano se añaden sucesivamente. El pH se mantuvo a 11 mediante la adición de cantidades ínfimas de 0,5 M de NaOH. La mezcla fue mezclado continuamente durante 15 minutos. El oro recubierto las nanopartículas magnéticas formado se lavaron cuatro veces con agua, varias veces con metanol y secado en una estufa de vacío durante 6 h. Para demostrar que una capa de oro se formó en torno a las nanopartículas magnéticas, el oro coloidal y Fe 3 O 4 @ Au soluciones fueron preparadas por la disolución de 1,5 mg de HAuCl 4 y Fe 3 O 4 @ Au, respectivamente, a 4 ml de agua y la absorbancia se midió utilizando un UV-Vis Du espectrofotómetro Beckman.

LAA funcionalización de nanopartículas magnéticas

1,5 g de nanopartículas magnéticas fue sumergido en 50 ml de 0,1 M LAA preparado en solución de ácido nítrico de pH ≈ 2. La mezcla fue sonicated durante 15 minutos y agita vigorosamente durante 10 horas a temperatura ambiente. Un campo magnético externo se aplicó a recuperar las partículas y lavados dos veces con agua nanopure. El proceso se prevé para garantizar la quimisorción de ácido aspártico, teniendo carboxilo y amino grupos sobre la superficie de las partículas.

Carboxilación recubierto de oro nanopartículas magnéticas Fe 3 O 4 Au @

La carboxilación de oro magnético recubierto las nanopartículas se hizo para permitir la formación de amida vínculo entre los grupos carboxilo en la superficie de las nanopartículas con grupos amino de las moléculas de proteína. Nanopartículas magnéticas (1,5 g) se añadieron a 15 ml de solución etanólica de 3-SM 20 mm, sonicated durante 48 h, y lavarse con agua nanopure y secado en una estufa de vacío durante 6 h.

Inmovilización de proteína prión (huPrPrec) en magnético recubierto de oro y nanopartículas magnéticas

Uno de EDC mg, 1,2 mg de NHS y 8 mg de carboxilo o LAA funcionalizado partículas se han añadido a 3 ml de solución tampón fosfato (pH 7.4) que contiene 3-15 μ g de huPrPrec. La mezcla se sonicated a 4 ° C durante 10 min y continuamente se agita durante 18 horas a temperatura ambiente. 4 h en intervalos de tiempo un separador magnético se utiliza para separar las partículas del medio de reacción y 30 μ l de la solución reaccionar fue tomada y utilizada para la determinación del contenido de proteínas utilizando el Bio-Rad Protein de ensayo utilizando IgG humana como la proteína normal. Porción de las partículas se tomaron y lavados con PBS no encuadernado para separar las proteínas de la partícula y superficies utilizadas para la caracterización.

Encuadernación Cinética

La concentración de proteína en el sobrenadante se vigila cada cuatro horas por un período de veinte horas para evaluar la concentración de obligado huPrPrec y las constantes de velocidad se determina mediante análisis de regresión lineal de la trama de la concentración de proteínas en función del tiempo. Cada punto es la media de dos mediciones. La sensibilidad del ensayo se demostró mediante el examen de la dosis y la respuesta de la constante de velocidad frente a huPrPrec concentración en la gama de concentración de entre 2 y 5 μ g / ml.

Caracterización

Los tamaños de magnético recubierto de oro y nanopartículas magnéticas se caracterizaron por microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEM 1200 EXII, JEOL) y la fijación de biomoléculas cualitativamente por espectroscopía FTIR (BioRad FTS 6000, Cambridge, MA). Las muestras para análisis TEM se prepararon de la siguiente manera: una gota de nanopartículas magnéticas se dispersa en agua nanopure y la solución resultante se sonicated durante 5 min para obtener mejores características de dispersión de partículas. Una gota de la solución se dispersa luego depositado en una rejilla de cobre y se seca de un día a temperatura ambiente. La confirmación de la unión de huPrPrec en las nanopartículas magnéticas se hizo utilizando espectroscopía FTIR. Las nanopartículas teniendo huPrPrec obtenido después de la inmovilización procedimiento fueron separados utilizando un separador magnético y lavados con PBS para eliminar Sin huPrPrec. Una pequeña cantidad de los restantes huPrPrec de nanopartículas magnéticas conjugados se mezclan en 5 ml de PBS y una gota de la mezcla se depositó en la micro FTIR-ATR titular muestra para su análisis.

Autores de las contribuciones

Autores Kouassi y Irudayaraj son a la vez responsable de la concepción, la planificación de los experimentos, el análisis de datos y la redacción del manuscrito.