Immunity & Ageing, 2006; 3: 8-8 (más artículos en esta revista)

Citometría de flujo de evaluación de celulares poli (ADP-ribosyl) ación capacidad en linfocitos de sangre periférica

BioMed Central
Andrea Kunzmann (andrea.kunzmann @ uni-konstanz.de) [1], Dan Liu (liudan819@hotmail.com) [1], Kathryn Annett (ke.annett @ ulster.ac.uk) [2], Muriel Malaisé ( Muriel.malaise @ uni-konstanz.de) [1], Bastian Thaa (bthaa@gmx.de) [1], Paul Hyland (Paul.Hyland @ ntu.ac.uk) [3], Yvonne Barnett (yvonne.barnett @ ntu.ac.uk) [2], Alexander Bürkle (alexander.buerkle @ uni-konstanz.de) [1]
[1] Grupo de Toxicología Molecular, Departamento de Biología, Box X911, Universidad de Konstanz, D-78457 Konstanz, Alemania
[2] El cáncer y el envejecimiento Grupo de Investigación de la Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad de Ulster, Coleraine, BT52 1SA, Irlanda del Norte, Reino Unido
[3] Facultad de Biomédicas y Ciencias Exactas y Naturales de la Facultad de Ciencia y Tecnología, Nottingham Trent University, Campus Clifton, NG11 8NS, Nottingham, UK

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Resumen
Fondo

Poli (ADP-ribosyl) ación es una modificación postraduccional de proteínas nucleares catalizada por poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARPs), utilizando NAD + como sustrato. La activación de PARP-1 es en respuesta inmediata a los daños del ADN generados por endógenos y exógenos agentes dañinos. Se ha implicado en varios procesos celulares esenciales incluyendo la reparación del ADN y el mantenimiento de la estabilidad genómica, que son a la vez íntimamente vinculada con el proceso de envejecimiento. La medición de celulares poli (ADP-ribosyl) ación de capacidad, definida como la cantidad de poli (ADP-ribosa) producidos al amparo de máxima estimulación, por lo tanto, es pertinente para la investigación sobre el envejecimiento, así como para una variedad de otras cuestiones científicas.

Resultados

Este documento informa de un nuevo y robusto protocolo para la medición de celulares poli (ADP-ribosyl) ación capacidad en PBMC o Jurkat T-células por medio de citometría de flujo, sobre la base de un previamente establecidos inmuno-dot-blot ensayo. Con el fin de validar el nuevo ensayo, se determinó la curva dosis-respuesta de 3-aminobenzamide, un conocido inhibidor competitivo PARP, y que deriva una CI 50 que está muy cerca del valor publicado. Al someter a prueba un conjunto de muestras tomadas PBMC de quince jóvenes y sanos donantes humanos, que podría confirmar la presencia de una importante variación interindividual, como ya se observó utilizando un ensayo radiométrico.

Conclusión

La metodología descrita en este documento debe ser de utilidad general para la determinación de celulares poli (ADP-ribosyl) ación de capacidad en una amplia variedad de ajustes, especialmente para la comparación de grandes series de muestras, tales como estudios de población. En contraste con los publicados anteriormente radiométricas o inmuno-dot-blot ensayos, FACS el nuevo método basado permite (i) el análisis selectivo de células mononucleares de gating y (ii) la detección de una posible heterogeneidad en poli (ADP-ribosyl) ción entre la capacidad las células del mismo tipo.

Fondo

El envejecimiento es un proceso multifactorial degenerativa que afecta a todos los tejidos incluyendo el sistema inmunológico [1]. Hay pruebas de una pérdida de la estabilidad genómica en las células durante el envejecimiento normal (para el examen: [2, 3]]. Esta inestabilidad genómica puede ser mediada por las limitaciones en las vías de reparación del ADN. Esta opinión está respaldada por los informes recientes de relieve el papel fundamental de la reparación del ADN (p. ej. Reparación por escisión de nucleótidos) en la determinación de la tasa de envejecimiento [4], mientras que por otro lado las proteínas que se encuentran deficientes en síndromes de envejecimiento acelerado, como la Werner proteína (WRN), han demostrado poseer en funciones de reparación del ADN y el mantenimiento de la estabilidad genómica (para el examen: [2]].

La biodisponibilidad y distribución intracelular de iones de zinc pueden tener un impacto en los procesos relacionados con la reparación del ADN y el mantenimiento de la estabilidad genómica y, por tanto, en el proceso de envejecimiento [5]. Esto se desprende del hecho de que varios de reparación del ADN relacionados con las proteínas son de zinc-finger proteínas [6]. Un ejemplo destacado de un dedo de zinc de proteínas que participan en la reparación del ADN genómico y la estabilidad es poli (ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP-1, EC 2.4.2.30). PARP-1 cataliza una de las inmediatas respuestas celulares a estrés genotóxico, es decir. la síntesis de poli (ADP-ribosa) [3, 7 - 10]. Por un lado, esta enzima es un objetivo muy prometedor para la quimioterapia del cáncer [11], y especialmente para BRCA2 déficit de las células tumorales [12]. Por otro lado, la participación de poli (ADP-ribosa) el metabolismo en el proceso de envejecimiento ha sido durante mucho tiempo sugerido, como hemos podido demostrar que los celulares capacidad para producir poli (ADP-ribosa) en la sangre periférica de células mononucleares (PBMC) se correlaciona positivamente con especies específicas de vida en mamíferos [13]. Por otra parte, hemos podido establecer una asociación entre la alta celulares poli (ADP-ribosyl) ación lymphoblastoid capacidad en las células con la longevidad humana [14].

Toxinas ambientales que pueden interferir con la integridad estructural de los dedos de zinc, como arsenicals, recientemente se han demostrado para suprimir el daño del ADN inducido por poli (ADP-ribosa) en la formación de células vivas en la cultura, incluso a muy bajas concentraciones que prevalecen en el agua potable de algunas regiones geográficas del mundo [15]. Otras condiciones que pudieran conducir a efectos similares son proteínas daño oxidativo o la disminución de la biodisponibilidad del zinc, ya sea como resultado de la deficiencia nutricional de zinc o cambios en el transporte de zinc o de almacenamiento intracelular.

Una de las tareas del proyecto ZINCAGE [5], apoyada por la Comisión de la UE es, por tanto, a fin de evaluar poli (ADP-ribosyl) ación capacidad en PBMC humanos como una función de la edad y el estado nutricional de zinc de los donantes. Los datos obtenidos se correlacionaron con otra serie de factores genéticos, bioquímicos y psicológicos parámetros que deben evaluarse dentro de ZINCAGE. Sobre la base de la importancia y multi-funcional naturaleza de poli (ADP-ribosyl) ción, es evidente que confiables y convenientes métodos para evaluar celular poli (ADP-ribosyl) ación capacidades son necesarias.

Anteriormente, varios métodos se han desarrollado para evaluar los celulares poli (ADP-ribosyl) ación capacidad. Esto fue logrado principalmente por permeabilised incubando células con un doble hundidos activador de oligonucleótidos de ADN y posteriormente medir la incorporación de NAD + radiomarcado en ácido insoluble material [13, 14, 16]. Hubo, sin embargo, los principales inconvenientes con que la metodología incluido el requisito de utilizar la radiactividad, de relativamente gran número de células, y la notoria ineficiencia de las medidas de lavado para eliminar cualquier etiqueta radiactiva no incorporado NAD + de ácido tricloroacético (TCA) precipitados. Por lo tanto, posteriormente desarrolló una no radiactivos inmuno-dot-blot de ensayo para cuantificar celular poli (ADP-ribosyl) ación capacidad [17]. Este método permite permeabilised células que han sido incubadas con un activador de oligonucleótidos y no llevan la etiqueta NAD + para ser directamente dot-borrado en una membrana de nylon y, a continuación, TCA-precipitó in situ. Immunodetection resultante de la poli (ADP-ribosa) se logró utilizando un anticuerpo monoclonal conjugado con peroxidasa de base cuantitativa sistema de detección de quimioluminiscencia. Este método, sin embargo, no permitió la separación de determinados tipos de células o la detección de heterogeneidad entre las células del mismo tipo.

En el presente trabajo se describe una nueva metodología utilizando una citometría de flujo basado en la técnica.

Resultados y discusión

En este estudio, una modificación a un dot-blot de ensayo para la cuantificación de celulares poli (ADP-ribosyl) ación capacidad [17], fue elaborado sobre la base de citometría de flujo.

Con el fin de evaluar los niveles de celulares poli (ADP-ribosyl) ación de este método, los niveles de fondo de media intensidad de fluorescencia (IMF) ha de establecerse. Los primeros experimentos se llevaron a cabo utilizando un Protocolo para determinar los niveles de IFM sin tratar en células Jurkat T, es decir. células con anticuerpos no etiquetado, que actúa como un control negativo y considerado como una medida de fluorescencia de fondo. Además, la tinción de anticuerpos se realizó en permeabilised células incubadas con o sin NAD + en la presencia o ausencia de activador de oligonucleótidos. La Figura 1 muestra la típica distribución de frecuencias (histogramas) obtenidas con el Protocolo A. Figura 1 (A] representa el control negativo (IFM = 58,07), y puede considerarse como antecedentes de fluorescencia nivel que estas células no son anticuerpos que llevan la etiqueta. Paneles (B) - (D) muestran los histogramas de células T Jurkat muestras manchadas de primaria y secundaria de anticuerpos después del tratamiento de las células que se detallan en el protocolo, con excepción de la falta de NAD + y el activador de oligonucleótidos (B), o la falta de NAD + solamente (C), o la falta de oligonucleótidos sólo (D). En los grupos B - D un ligero aumento en las IFM se desprende, que oscilan entre aproximadamente 130 y 180 unidades, lo que refleja más o menos el fondo de la tinción primaria y secundaria de anticuerpos, no como importantes cantidades de poli (ADP-ribosa) se produjeron en virtud de estos condiciones. Permeabilised células, sin embargo, que había sido incubadas con NAD + plus activador de oligonucleótidos y teñidas con anticuerpos (Grupo E) dio lugar a varias veces mayor intensidad de fluorescencia (MFI = 793,41), como se esperaba, porque PARP-1 está plenamente estimulados en estas condiciones. Este resultado indica claramente la utilidad de la citometría de flujo como herramienta para la evaluación de poli (ADP-ribosyl) ación capacidad.

En el curso de nuestros experimentos hemos desarrollado un protocolo de ensayo modificados (Protocolo B), para medir PBMC. Las principales diferencias entre un Protocolo y el Protocolo B son: (i) la fijación / permeabilisation ( "prefixation") con etanol al 100% antes de la reacción se inicia, y (ii) un segundo paso mediante la fijación de formaldehído que se realizan después de la PARP - 1 reacción ha tenido lugar. El prefixation se hace para "estabilizar" las células de las etapas subsiguientes del procedimiento experimental. Cabe señalar que el ADN romper la línea impulsada por poli (ADP-ribosyl) ación se produce principalmente como un automodification de PARP-1 [18]. Polymer formación conduce a una fuerte carga negativa modificación de proteínas. Esto puede conducir a un efecto de repulsión de ADN como también con carga negativa, y, por tanto, automodified PARP-1 podría perderse de la cromatina. Por lo tanto, un segundo paso fijación se introdujo el uso de formaldehído. Este ensayo modificado resultó ser más estable y reproducible y, por tanto, recomienda el formato de ensayo.

Citometría de flujo proporciona la opción de seleccionar determinadas poblaciones celulares de gating. Por ejemplo, estamos interesados en medir la actividad de PARP específicamente en PBMC y, por tanto, desea excluir a otros tipos de células (como las plaquetas) la contaminación de la preparación. PBMC puede ser teñidas con un CD de anticuerpos y 45 seleccionados por gating como se muestra en la Figura 2. Esta población celular se analizaron en forma selectiva todos los experimentos.

Como se muestra en la Figura 3, las IFM de valores humanos PBMC se incubaron en ausencia de NAD + son muy bajos, mientras que la adición de NAD + y, más aún, una mayor incorporación de activador de oligonucleótidos IFM planteadas por más de diez veces. Para ilustrar la utilidad de la citometría de flujo basado en el ensayo de conformidad con el Protocolo B, el conocido inhibidor PARP 3-aminobenzamide fue agregado a la mezcla de reacción a diferentes concentraciones, es decir, 1, 3, 10, 30, 100, 300, y 1000 μ M (Fig. 3]. Como era de esperar, una parte significativa y dependiente de la concentración de inhibición de poli (ADP-ribosa) la formación se observó en las concentraciones entre 30 y 1000 μ M, frente a los niveles de fondo a la mayor concentración probada, lo que pone de manifiesto la especificidad de la inmunoticción de poli (ADP - ribosa). Ningún cambio significativo se observó en 3-aminobenzamide concentración de hasta 10 μ M. La potencia del inhibidor observado en estos experimentos se corresponde muy bien con su conocido IC 50 in vitro (aproximadamente 40 μ M; [19]].

En trabajos anteriores utilizando un radiométricas PARP actividad ensayo [13], que había observado importantes heterogeneidad interindividual entre las muestras tomadas de jóvenes donantes sanos. Éste era el caso de PBMC tomado de alguna de las especies de mamíferos probados. Por lo menos en cierta medida la heterogeneidad que puede haberse debido a problemas técnicos relacionados con la eliminación de la ineficiencia no incorporado radiactivos NAD +. Por lo tanto, puso a prueba un conjunto de muestras tomadas PBMC de quince donantes humanos sanos (24-29 años de edad), utilizando el nuevo formato de ensayo (Cuadro 1a]. El promedio de nivel de actividad (es decir, [IFM con NAD + y oligonucleótido] - [IFM sin NAD +] fue 665 con una desviación estándar de 419. Estos datos ponen de manifiesto una sustancial (varias veces) la variación interindividual, sin evidente diferencia de género. También observó la variabilidad entre esos donantes a prueba en paralelo (cuadro 1 bis, los donantes marcadas con asteriscos). Esto, sin embargo, no se debió a la inestabilidad del ensayo, como mediciones de PBMC de un solo donante, ya sea realizado en paralelo o en experimentos consecutivos en días diferentes mostradas sólo marginal variabilidad (Tabla 1b]. Por lo tanto, la variabilidad visto en el cuadro 1a, parece ser biológico en lugar de técnica. Sin embargo, para los grandes estudios se recomienda utilizar patrones internos como partes alícuotas de PBMC criopreservados de un solo donante. Se ser interesantes para descifrar las razones de la marcada variación interindividual, así como las posibles consecuencias biológicas de la persona. Un candidato, en el que estamos centrados en la ZINCAGE proyecto, es el celular de zinc.

Conclusión

La metodología descrita en este documento debe ser de utilidad general para la determinación de celulares poli (ADP-ribosyl) ación de capacidad en una amplia variedad de ajustes, especialmente para la comparación de grandes series de muestras, tales como estudios de población. En contraste con los publicados anteriormente radiométricas o inmuno-dot-blot ensayos, FACS el nuevo método basado permite (i) el análisis selectivo de células mononucleares de gating y (ii) la detección de una posible heterogeneidad en poli (ADP-ribosyl) ción entre la capacidad las células del mismo tipo.

Métodos
Materiales

Tampón fosfato salino (Dulbecco A; PBS) fue de Oxoid, Basingstoke, Reino Unido. De suero de ternera fetal (FCS) de Invitrogen, Paisley, Reino Unido. Clorhidrato de Tris (Tris-HCl), ácido etilendiaminotetracético (EDTA), cloruro de magnesio (MgCl 2), 2-mercaptoetanol, digitonin, β-nicotinamide adenina dinucleotide (NAD +; grado V), 3-aminobenzamide (3-AB), sodio azida fueron de Sigma, Poole, Reino Unido. El activador deoxyoligonucleotide PARP (GGAATTCC) [16], fue disuelto en 15 mM NaCl a 385 μ g / ml. Percoll fue de Amersham Bioscience, Upsala, Suecia. Mouse anticuerpo monoclonal que reconoce poli (ADP-ribosa) fue purificado, tal como se describe anteriormente, de la cultura sobrenadante de 10 H hibridoma de células [20] (especie de regalo de Miwa M. y T. Sugimura, Tokio, Japón), utilizando una proteína-Una columna de cromatografía kit [17]. Alexa Fluor ® 488 cabra anti-ratón secundaria de anticuerpos fue de sondas moleculares, Paisley, Reino Unido. 45 CD de anticuerpos fue de BD Bioscience, Erembodegem, Bélgica.

Células

Células Jurkat T, T leucémicas una línea celular, se mantiene como una suspensión de la cultura en medio RPMI 1640 (Sigma) suplementado con 100 U / ml de penicilina, 100 μ g / ml estreptomicina, 2 mM L-glutamina y el 10% de suero de ternera fetal (Sigma ). Culturas fueron incubadas a 37 ° C y el 5% de CO 2.

Recién obtenido humanos PBMC de donantes sanos fueron aisladas por gradiente de Percoll centrifugación [13].

FACS basado en la actividad de PARP ensayo - Protocolo A

Para llevar a cabo ensayos de actividad de PARP, una modificación del método de dot blot de acuerdo a Pfeiffer et al. [17] fue utilizado.

Jurkat células T fueron contados, lavado en PBS, pildoradas y resuspendido en helado hipotónico permeabilisation buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,8, 1 mM EDTA, 4 mM MgCl 2, 30 mM 2-mercaptoetanol), complementado con el 0,015% (w / v) digitonin (Sigma), y dejó en hielo durante 1 minuto. A otros 4 ml de digitonin-gratis, helado de amortiguación permeabilisation fue entonces añadido y las células fueron pildoradas a 326 g, 4 ° C, durante 10 minutos y de nuevo resuspendido en helado permeabilisation de amortiguación a una densidad de 2 × 10 5 cells/53 μ l en un fondo en V placa de 96 pocillos.

Con el fin de investigar celulares poli (ADP-ribosyl) ación de capacidad, la permeabilised Jurkat T se incubaron las células con ADN de activador y no llevan la etiqueta NAD +, que actúa como sustrato, a fin de permitir la formación de poli (ADP-ribosa).

Treinta y cuatro μ l de buffer de reacción (100 mM Tris-HCl pH 7,8, 1 mM NAD +, 120 mM MgCl 2) y 13 μ l de doble hundidos activador oligonucleótido disuelto en 15 mM NaCl a 385 μ g / ml se añadió a las muestras de 2 × 10 5 células en hielo, produciendo un volumen total de 100 μ l por reacción. La mezcla se incubó a 37 ° C durante 4 minutos, y luego las células se pildoradas a 652 g, 4 ° C, durante 3 minutos y resuspendido en 60 μ l de PBS. La reacción fue detenido por la adición de 140 μ l de helado el 70% de etanol y la incubación durante 15 minutos a -20 ° C. Luego, las células fueron pildoradas a 652 g, 4 ° C, durante 5 minutos y luego se lavan en 240 μ l de tampón FACS (1 × PBS, 0,5% FCS, 2 mM NaN 3), con agitación a 4 ° C, y de nuevo se centrifuga a 652 g, 4 ° C durante 2 minutos.

El pellet de células fue resuspendido en 240 μ l de anticuerpo primario diluido (purificado 10 H anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce poli [ADP-ribosa]; dilución 1:300 en tampón FACS) a 4 ° C durante la noche. Las células fueron entonces pildoradas a 652 g, 4 ° C, durante 2 minutos y se lavan en 240 μ l de tampón FACS, como antes. El pellet de células resultante se resuspendió en 240 μ l Alexa 488-anticuerpo secundario conjugado (dilución 1:1000 en tampón FACS; Invitrogen) en la oscuridad seguida por agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos, pildoradas y lavado, una vez más, y finalmente resuspendido en 240 μ l FACS de amortiguación y la izquierda en el hielo antes de que el análisis de citometría de flujo.

Cell muestras fueron analizadas por citometría de flujo en un FACS Calibur II (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) que funcionan con CellQuest versión 3,3 del software. La población total de células viables fue cerrada a su lado hacia delante y de dispersión. Las muestras de control se evaluaron en cada experimento. La fluorescencia de células no tratadas se registró para determinar el nivel de fluorescencia de antecedentes negativos para el control de las células, mientras que células tratadas con primaria y secundaria de anticuerpos tinción se utilizaron como control positivo de células. Un total de 10000 archivos de caso para cada muestra fueron adquiridas en forma individual "en vivo-puerta". Los datos se expresaron como media intensidad de fluorescencia (IFM) por encima de fondo.

FACS basado en la actividad de PARP ensayo - Protocolo B

Este método es similar al Protocolo A, con excepción de las siguientes modificaciones: Etanol, en lugar de digitonin, se utiliza para permeabilisation; el tiempo de reacción (incubación con NAD + y activador de oligonucleótidos) se amplió a 10 minutos y esta fue seguida por una segunda fijación el uso de formaldehído. Para mayor conveniencia de este protocolo (que es la versión recomendada, véase la discusión) se describe aquí, en un paso a paso la moda:

• Centrifugar las células (2 × 10 5 por punto de datos) en 15 ml tubo durante 5 min a 326 g (ten en cuenta que alrededor de 1,5 × 10 6 PBMC pueden recuperarse a partir de 1 ml de sangre)

• Resuspender el precipitado en 10 ml de PBS

• Contar las células

• Centrifugar las células durante 5 min a 326 g

• Resuspender pellet en el 100% de etanol (helado)

• Deje a -20 ° C durante al menos 20 min

• Centrifugar las células durante 10 min a 815 g

• Resuspender el pellet de células en ~ 10 ml de tampón A (10 mM Tris-HCl pH 7,8, 1 mM EDTA, 4 mM MgCl 2, 30 mM 2-mercaptoetanol)

• Centrifugar las células durante 10 min a 815 g

• Resuspender pellet en N × 27 μ l de buffer A (N = número de pozos que quedan por llenar, cada uno de ellos, 2 × 10 5 células) y la transferencia de 27 μ l por pocillo en una forma de "V" placa de 96 pocillos

• Incubar la placa con las células en hielo durante al menos 5 min

• Añadir 20 μ l 3 × reacción de amortiguación (con o sin NAD +), además de 13 μ l de 15 mM NaCl incorporar o no activador de oligonucleótidos (concentración final: 5 μ g por reacción) por lo tanto, llegar a un volumen final de 60 μ l

• Deje a 37 ° C durante 10 min

• En segundo lugar fijación:

∘ Añadir 60 μ l de formaldehído 4% en PBS e incubar durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente

∘ añadir 60 μ l de 100 mM glicina en PBS para la amortiguación de formaldehído

• Centrifugar durante 10 min a 815 g

• Lave con 200 μ l de tampón FACS

• Centrifugar durante 5 min a 815 g

• Resuspender el precipitado en 100 μ l de anticuerpo primario (10 H) diluido en tampón FACS (concentración final de 5 μ g / ml)

• Incubar durante 1 h a 37 ° C o durante la noche a 4 ° C

• Centrifugar durante 5 min a 815 g

• Lave dos veces (como antes)

• Centrifugar durante 5 min a 815 g

• Resuspender pellet en 100 μ l de anticuerpo secundario diluido (Alexa 488-conjugado de cabra anti-ratón, dilución 1:1000 en tampón FACS) Nota: El presente y los siguientes pasos debe realizarse bajo luz tenue.

• Incubar durante 30 min a 37 ° C

• Lave dos veces (como antes)

• Centrifugar durante 5 min a 815 g

• Resuspender el precipitado en 200 μ l de tampón FACS

• Deje en hielo hasta FACS análisis (tal y como se describe más arriba) o almacenar las muestras a 4 ° C

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

AL, DL, KA, MM, BT, y AP realizado el trabajo experimental se muestra en este documento. AB concibe el estudio y dirigió el trabajo experimental. YB participado en el diseño y la coordinación de los experimentos y ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer: Profesores Miwa M. y T. Sugimura, Tokio, Japón de 10 H hibridoma de células, la Unión Europea para apoyo financiero, bajo los auspicios de "nutricional de zinc, el estrés oxidativo y Inmunosenescencia: bioquímica, genética y el estilo de vida implicaciones para un envejecimiento saludable "(ZINCAGE; contrato número FOOD-CT-2003-506850; Coordinador: Dr Eugenio Mocchegiani, Ancona, Italia), así como" La inmunidad de células T y Envejecimiento "(T-CIA; número de contrato QLK6 - CT-2002-02283), el Departamento de Educación y el Aprendizaje para la beca a KA, y Profesor Marcus Albrecht Groettrup y Wendel, Univ de Konstanz, para uso compartido de equipo.