Journal of Immune Based Therapies and Vaccines, 2006; 4: 4-4 (más artículos en esta revista)

Modulación de la respuesta inmune humoral a la vacuna BCG oral por Mycobacterium bovis BCG Moreau de Río de Janeiro (RDJ) en adultos sanos

BioMed Central
Renata Monteiro-Maia (renatamaia@ioc.fiocruz.br) [1], Maria B Ortigão-de-Sampaio (vaccine@sgul.ac.uk) [2], Rosa T Pinho (rospinho@ioc.fiocruz.br) [ 3], Luiz RR-Castello Branco (branco@ioc.fiocruz.br) [1]
[1] Centro de Pesquisas Arlindo de Assis, Fundación Ataulpho de Paiva, Avenida Almirante Barroso, 54, 15 °. Andar, Rio de Janeiro, Brasil
[2] Celular y Molecular Medicine (Centro de infección), St George's, Cranmer Terrace, Londres SW17 0RE, UK
[3] Laboratório de Imunologia Clínica, Departamento de Imunologia, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Avenida Brasil, 4365, Manguinhos, Río de Janeiro, Brasil

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Resumen
Fondo

La administración oral de BCG fue la ruta utilizada inicialmente por Calmette y Guérin, pero fue sustituido por la administración intradérmica en prácticamente todos los países después de la Lubeck accidente. Sin embargo, Brasil siguió administrando oral BCG Moreau RDJ, que se mantuvo hasta mediados del decenio de 1970 cuando fue sustituido por la vía intradérmica. Aunque la vacuna BCG se ha utilizado en seres humanos desde 1921, poco se sabe de la respuesta inmune inducida. El objetivo de este estudio fue analizar las respuestas inmunológicas después de la vacunación oral con M. bovis BCG Moreau RDJ.

Métodos

Este estudio en voluntarios sanos se ha medido celular y humoral aspectos de la respuesta inmunológica oral a M. bovis BCG Moreau RDJ en Río de Janeiro, Brasil. De células T tráfico y Th 1 y Th 2 respuestas de citocinas se describen, así como isotipo de la producción de anticuerpos específicos utilizando nuevas técnicas.

Resultados

La inmunización oral no tiene efectos adversos. Hemos demostrado que hay celular y humoral las respuestas inmunológicas después de la inmunización oral. Oral revacunación no induce una prueba cutánea positiva a los individuos y de respuesta múltiple de refuerzo por vía oral fue capaz de inducir la modulación en las respuestas inmunológicas humoral (IgG de cambiar a IgA) en los sujetos previamente inmunizados e incapaz de inducir la tolerancia. Por el contrario, la respuesta inmune celular no difiere entre los individuos vacunados con positivos y negativos prueba cutánea de reacciones.

Conclusión

Todos los sujetos, incluidos los que no respondieron a la prueba cutánea en estudio la apertura, son capaces de montar humoral y celular respuesta inmune a antígenos de la prueba.

Fondo

La vacuna BCG fue desarrollada por la atenuación en vitro más de 13 años a partir de una muestra virulenta de Mycobacterium bovis por Albert Calmette y Camille Guérin en el Instituto Pasteur de Lille. La cepa atenuada denominada BCG (Bacilo de Calmette-Guérin) que ahora se conoce como Mycobacterium bovis BCG. BCG fue dado a los seres humanos por primera vez en 1921, cuando ya se ha convertido en el más utilizado la vacuna en el mundo [6]. Se ha dado a 3 millones de personas con baja incidencia de acontecimientos adversos graves [18]; más de 100 millones de personas que actualmente reciben la vacuna con el fin de prevenir la tuberculosis [23]. Más del 90% de la producción mundial se haga de la BCG ruso-I, 172-1 Tokio, danés 1331, Moreau RDJ y Pasteur 1173-P2 sub cepas [19].

A pesar de la utilización de la vacuna durante más de 80 años, siendo varias las controversias relativas a la eficacia, con estudios que informan la protección de las tasas que varían entre 0 y 80% [12, 13, 4, 11].

La administración oral fue la ruta utilizada inicialmente por Calmette y Guérin, pero fue sustituido por la administración intradérmica en prácticamente todos los países después de que el accidente Lubeck, en la que 67 de 249 bebés, dada la vacuna murió debido a la contaminación de la BCG con virulenta de Mycobacterium tuberculosis [2] . Sin embargo, Arlindo de Assis siguió administrando oral BCG, que se mantuvo en Brasil hasta mediados del decenio de 1970 cuando fue sustituido por la vía intradérmica. Incluso después de este cambio de ruta, la Fundación Ataulpho de Paiva seguido para producir la vacuna oral [7].

Estudios de Assis y Carvalho [3] puso de manifiesto que ninguno de los 167 niños desarrollaron una respuesta a la prueba cutánea de una semana después de la inmunización oral; piel positividad a la prueba sólo apareció a partir del 6 semanas después de la inmunización oral con BCG Moreau.

Se sabe que la inducción de respuesta inmune mucosa es de vital importancia para la protección contra agentes infecciosos cuya vía de entrada es a través de la mucosa, como es el caso de la tuberculosis. La administración oral se demostró capaz de inducir una mayor mucosa y la respuesta inmune sistémica en comparación con la vía intradérmica [16].

Brown et al (2003) [9] demostró que podía inducir BCG micobacterias anticuerpos específicos y Williams et al (2004) [26] confirmó que la vacunación oral con BCG inducida por un aumento significativo de isotipo IgA anti-LAM anticuerpos que tienen importantes funciones en sistémica respuestas, así como la protección que ofrece la mucosa.

Anfitrión resistencia a la invasión por micobacteria se asocia principalmente con la generación de la respuesta inmune celular [15].

CD4 + células T se activan después de la presentación de antígenos de micobacterias en asociación con la clase de moléculas MHC II, la producción de citocinas, principalmente IFN-γ, el principal activador de los macrófagos [25] que los actos en relación con el TNF-α para contratar los macrófagos, aumentando la eficacia anfitrión de la respuesta inmune [22].

Linfocitos T CD8 + también son capaces de secretar citocinas incluyendo IFN-γ, TNF-α, IL-2 e IL-4 y son importantes para controlar el equilibrio entre Th1 y Th2 respuestas [25]. Deficiencia de estas células provoca mal organizado infiltrados celulares que sugiere su importancia en la formación de granulomas de protección [1]. Además, estas células parecen tener un papel importante en la protección contra la reactivación de infección latente [21].

Una vez convertido en micobacterias patógenos intracelulares, suero de los componentes no pueden acceder y pierden su función protectora [25]. B-células han sido descritas como una importante fuente de quimiocinas implicadas en el desarrollo de granulomas y, en consecuencia, impiden la difusión por micobacteria, lo que resulta en el reclutamiento de células apropiadas para la localización para las primeras semanas después de la infección [8].

El concepto de un espacio común de la mucosa asociada sistema de regulación y coordinación de la respuesta inmune en las mucosas ha sido un importante avance en nuestra comprensión de la protección contra los agentes patógenos de la mucosa. Este sistema se basa en prueba T y los linfocitos B que migran desde el lugar de presentación de antígenos a través de linfáticos y la sangre de forma selectiva "casa" para el tejido linfoide en sitios distantes en gastrointestinal, respiratorio, genitourinario y otros mucosa asociada a las regiones [17].

En este contexto, el objetivo de este estudio fue analizar humoral y celular la respuesta inmune a antígenos de micobacterias y correlacionar a las pruebas de tuberculina en voluntarios sanos adultos, en Río de Janeiro (Brasil) después de la vacunación oral con M. bovis BCG Moreau RDJ.

Métodos
Voluntarios de la piel y las pruebas

Sujetos sanos de edad 18-50 años fueron reclutados que no ha dado la historia de enfermedad pulmonar, la tuberculosis o la enfermedad de Hansen, y en los cuales el examen clínico y radiografía de tórax estaban dentro de límites normales. Para la prueba tuberculina, Multi-test (Mérieux ®) se aplicó para el brazo derecho y después de leer las 48 horas. Los voluntarios fueron reanalizada reactividad para la piel al final del estudio (6 meses después de la inmunización oral). Por escrito el consentimiento informado se obtuvo de los participantes antes del estudio de inscripción.

Los antígenos

Los antígenos utilizados fueron M. bovis BCG Moreau RDJ, de las proteínas secretadas M. bovis BCG Moreau RDJ la cultura y el PPD Rt48 (Statens Serum Institute).

Vacunación

Durante un período de 90 minutos de ayuno sujetos recibieron 100 ml 2% bicarbonato de sodio para neutralizar el ácido gástrico y después de una laguna de 15 minutos por vía oral fueron inmunizados con 5 ml M. bovis BCG Moreau RDJ vacuna en una concentración de 20 mg / ml (realizados por la Fundación Ataulpho de Paiva).

La recogida de sangre y la recogida de células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC)

Las muestras de sangre fueron tomadas antes de la inmunización (contados negativamente en la escala), el día de la vacunación (día cero) y en los días 3, 5, 7, 10, 12, 14 y 19 después de la inmunización oral con M. bovis BCG Moreau RDJ. PBMC fueron separados de sangre heparinizado por un gradiente de densidad y linfocitos fueron lavados y contados antes de su utilización en experimentos.

ELISPOT

Entre el 5 × 10 5 y 1 × 10 6 PBMC se transfirieron a 25-y las placas pre-recubiertas con 20 μ g / ml oral M. bovis BCG Moreau RDJ vacuna y se incubarán durante 2 1 / 2 horas a 37 ° C en el 5% de CO 2. Anti-IgA (2 μ g / ml), anti-IgG (2 μ g / ml) y anti-IgM (4 μ g / ml) y anti-anticuerpos humanos se han añadido y se incubarán durante 2 horas. Goat anti-humano conjugado con anticuerpos con fosfatasa alcalina (2 μ g / ml) se incubaron por 2 horas antes de su desarrollo mediante la utilización de BCIP. Wells se leyeron en virtud de un microscopio invertido después de 3 horas de desarrollo.

Celular lymphoproliferation

En forma de U placas de 96 pocillos fueron recubiertas con proteínas secretadas BCG o PPD Rt48 (10 μ g / ml); mitogen utilizado fue Concanavalina A (2,5 μ g / ml). La media de 3 H incorporación (cpm) se midió por triplicado scintillation de contar en un contador beta durante 1 minuto.

Medición de citoquinas

Sobrenadantes de celulares lymphoproliferation ensayos fueron congelados a -70 ° C para su posterior medición de las citocinas IL-4 e IFN-γ utilizando muy sensible kits RPN-2783 y RPN-2787 (Amersham ® BIOTECNOLÓGICO), respectivamente, de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Resultados
Las pruebas cutáneas respuestas y correlación con la vacuna contra la historia

De 100 individuos evaluados para la piel PPD reactividad, 77 (77%) fueron positivas y 23 (23%) negativos (figura 1]. De los 23 individuos PPD negativo, 19 habían sido inmunizados por vía oral y 3 intradérmica en la infancia y la 1 no habían sido inmunizados (figura 2]. Sólo 6 pacientes su consentimiento a la respuesta inmune cinética estudio (Tabla 1] y sólo dos de ellos han convenido en una exposición oral de refuerzo de vacunación 42 días después de la vacunación primaria. De estos 6 pacientes, 3 dio un historial de contacto con la tuberculosis (temas 2, 5 y 6). Todos los sujetos fueron la prueba de PPD 6 meses después de la inmunización oral y los resultados fueron similares a las primeras pruebas. Sujetos que respondieron positivamente a las pruebas cutáneas fueron evaluados clínicamente y ninguno mostró síntomas o signos de infección.

Respuesta humoral (ELISPOT)

Utilizando la técnica de ELISPOT fue posible observar la cantidad y el isotipo de la producción de anticuerpos por plasmablasts en respuesta a la inmunización oral con M. bovis BCG Moreau RDJ. Los resultados se expresaron en términos del número de manchas formado por 10 6 PBMC. A pesar de las diferencias en el número de puntos, todos los temas que aparece un pico respuesta inmune humoral, observados por la detección de anticuerpos IgG, entre los días 10 y 14 después de la inmunización oral (figura 1]. Temas 2 y 6, que recibió más de una dosis de vacuna oral y habían sido inmunizados en la infancia a través de la exposición oral y las vías intradérmica, respectivamente, muestran una alteración respuesta inmune humoral con anticuerpos de IgA; tema 2 que aparece antes y con mayor expresión en el día 12 después de la inmunización y 12 días después de impulsar con la vacuna oral (día 49) apareció un nuevo pico de IgA expresión. Tema 6 (Id primaria de vacunación en el momento del nacimiento) presentó IgA respuesta inmune tras la vacunación oral expresivo y mantenerse los niveles de IgG tras la inmunización oral. En cambio voluntario 2 (oral primaria de vacunación en el momento del nacimiento) mantuvo la anterior expresión de IgA y la IgG no presentó respuesta inmune (figura 2].

Lymphoproliferation celular y respuesta de citoquinas a PPD RT 48

Citocinas se analizaron para todos los temas excepto tema 6 con el objetivo de observar Th 1 (representado por el IFN-γ) y Th2 (representado por la IL-4) respuestas.

Todos los sujetos mostraron una respuesta linfoproliferativa al PPD Rt48 aunque la magnitud de estimulación diferentes (figuras 3 y 4]. Voluntarios de 1 a 5 mostró la producción de IFN-γ y 1 a 6 muestran las respuestas linfoproliferativas a Rt48 PPD. El pico de producción de IFN-γ fue de 30 pg / ml para los voluntarios 1, 330 pg / ml para los voluntarios 2, 380 pg / ml para los voluntarios 3, 40 pg / ml los voluntarios para el 4 y 50 pg / ml para los voluntarios 5. Los índices de estimulación (SI = cpm a prueba: cpm control - RPMI medio) de los mismos temas fueron, respectivamente: 45, 90, 20, 4, 50 y 8.

Por lo que respecta a la producción de citoquinas en respuesta a las proteínas secretadas, la producción de IFN-γ se observó, alcanzando un máximo de 7 días después de la inmunización oral. Los niveles de expresión difiere entre las personas, pero se mantuvieron cinética. Todos los sujetos fueron capaces de IL-4 la producción en respuesta a las proteínas secretadas aunque no se observó pico; constante en lugar de producción de esta citoquina se observó durante el período de estudio (datos no presentados).

Discusión

El uso de la vacuna BCG intradérmica resultados en un mayor número de personas capaces de responder a las pruebas de la piel, pero la durabilidad de esta respuesta varía entre los individuos y el diámetro de induración disminuye con el tiempo. En algunos programas, prueba cutánea negativa respuesta a PPD se ha interpretado como una indicación para la revacunación. Según Hoft et al (2000) [20], la vacunación con BCG oral inhibe las respuestas DTH, pero esta inhibición no representa un estado de tolerancia, ya que estas personas muestran importantes micobacterias específicos de IFN-γ respuestas. Otra hipótesis para explicar la escasez o la falta de respuesta DTH en individuos inmunizados por vía oral es que las diferentes poblaciones de células T se activan por la vacuna BCG a través de la exposición oral y las vías intradérmica [20].

También observó que dos individuos que recibieron impulsar oral con la vacuna BCG durante el estudio mostró una alteración en la respuesta inmune humoral visto como un cambio de isotipo IgG a partir de IgA, lo que sugiere que la revacunación oral es capaz de provocar celular y humoral respuestas. Esta respuesta es independiente de la ruta utilizada en una vacunación previa. Dado que la tuberculosis afecta a un importante sitio de la mucosa, el tracto respiratorio, el potencial uso de anticonceptivos orales de refuerzo de vacunación en los programas de inmunización es de interés. Motivos que no fueron impulsadas no eran capaces de montar el cambio de isotipo de inmunoglobulina para la prueba de antígenos. Hoft et al (2000) [20] proponer una combinación de anticonceptivos orales y las vías intradérmica de la vacuna BCG con el objetivo de inducir la mucosa protectora y sistémica inmunidad contra la infección inicial y la progresión sistémica.

La cinética de respuesta linfoproliferativa se describe en este estudio son similares a las descritas previamente utilizando la vacuna oral [10]. Al igual que nuestro estudio anterior, podemos demostrar que la proliferación y el tráfico de priming de las células T demuestra la estimulación de la respuesta inmune mucosa, al mismo tiempo que la respuesta inmune sistémica; pico respuestas en este estudio (D7-12) son similares a las observadas por Castello-Branco et al (1994) [10].

No hubo diferencias en la cinética de células T circulación entre la prueba cutánea PPD respondedores y no respondedores. Todos los sujetos desarrolló una respuesta linfoproliferativa después de la inmunización, lo que sugiere la existencia de distribución de células T-homing al sitio donde estaban cebados. La inmunización con M. bovis BCG Moreau RDJ era capaz de alterar la respuesta inmune celular al brazo (Th 1), fundamental para la protección contra la infección, sin dejar de estimular la respuesta inmune humoral (Th 2) necesarios para el control de la respuesta celular [24, 1] .

Es importante recordar que la mitad de los sujetos informaron el contacto con enfermos de tuberculosis, y que el contacto con micobacterias atípicas podría haber influido en los resultados ELISPOT, un índice de estimulación inmunitaria de los antígenos de micobacterias. Edad, que variaba entre 18 y 50 años, podría haber contribuido también a las diferencias en las respuestas.

Un estudio anterior (Das et al 1998) [14] de la vacuna BCG a prueba de tuberculina negativa individuos mostraron una falta de IFN-γ respuesta después de la inmunización. La cepa de BCG utilizadas en la inmunización puede influir en la respuesta inmune. Además de ser uno de los más inmunogénica de cepas de BCG, M. bovis BCG Moreau RDJ muestra gran similitud con la cepa original de Calmette producido y Guérin, sólo la cepa BCG Rusia genéticamente más cercana a la original, pero se asocia con una elevada incidencia de eventos adversos incluyendo BCG osteítis [6]. Estas diferencias de las cepas genéticas son claramente de importancia fundamental en la determinación de la respuesta inmune, así como la virulencia [5].

Este estudio demuestra, por primera vez, la respuesta inmune a la inmunización oral con M. bovis BCG Moreau RDJ en los seres humanos. Todos los sujetos, incluidos los que no respondieron a la prueba cutánea en estudio la apertura, son capaces de montar humoral y celular la respuesta inmune a antígenos de la prueba.

Los datos que aquí se presenta servirá de base para nuevos estudios con mayor número de temas, con el objetivo de estudiar variables adicionales incluidas isotipos de inmunoglobulinas, otras citoquinas importancia de la mucosa en la respuesta inmune, así como las respuestas a las proteínas secretadas purificado.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

MRM llevó a cabo el ELISPOT, proliferación celular y los ensayos de medición de citoquinas, participó en el diseño del estudio y escribió el manuscrito. MBOS y LRCB voluntarios reclutados. MBOS RTP y participó en el diseño del estudio y participó en la redacción del manuscrito. LRCB concibe el estudio, análisis de datos, la coordinación, el proyecto y la finalización del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a todos los voluntarios y Charles Woodrow sustanciales de las contribuciones para hacer la revisión crítica del manuscrito.