Farmacológicos reducciones de los niveles de tau total; implicaciones para la función de la dinámica de microtúbulos tau en la regulación de expresión

Los microtúbulos de proteína tau asociada (MAPT) ha demostrado ser un componente integral de formación y el axón neuronal transporte, y sirve como un sustrato para múltiples vías de señalización celular [1, 2]. Sin embargo, en varios trastornos neurológicos con demencia clínica, al parecer, tau pierde su función normal y empieza a acumular aberrantly en diversos tipos de inclusiones patológicas. Las mutaciones en el gen MAPT [3, 4], se mostraron a dar lugar a la formación de agregados de tau neurofibrillary conduce a FTDP-17 (la demencia frontotemporal con parkinsonismo vinculado al cromosoma 17), lo que da pruebas concluyentes de que las anormalidades en tau son suficientes para producir neurodegeneración y demencia. Si bien la enfermedad de Alzheimer (EA) es la predominante en efecto, demostrando la demencia coherente patología tau, la acumulación de tau anormalmente fosforilados especies es también una característica principal histopatológico de varias otras demencias hereditarias, incluida la degeneración corticobasal (CBD), parasupranuclear parálisis (PSP) y la demencia frontotemporal (FTD). Además, post-mortem evaluaciones de muchos de inicio tardío de la enfermedad de Parkinson (PD) casos demuestran tau anormal agregación, sugiriendo además el papel central que esta proteína puede tener en una serie de alteraciones neurológicas que no están relacionadas con la deposición amiloide como con EA.

La evidencia reciente ha indicado que la anormal acumulación intracelular de tau en última instancia, podría perpetuar la libre [5], y esta conversión de tau se ha propuesto ser una ganancia tóxica de la función fenómeno [6]. La reciente generación de viable y aparentemente normal MAPT ^{- / -} ratones ha planteado la posibilidad de que las neuronas pueden ser tolerante de las perturbaciones en los niveles globales de proteína tau. Colectivamente, estos datos sugieren que las reducciones de tau puede ser una aplicación terapéutica viable. En apoyo de esta idea, Santacruz et al. También ha demostrado recientemente que la reducción de la expresión de mRNA MAPT en una Tet-Off inducible tau modelo murino invertido el déficit cognitivo y la pérdida neuronal en estos ratones, sin reducir el número de agregados de tau [7]. Por lo tanto, tau en lugar de los agregados y ovillos, puede servir como un candidato válido terapéutica, en particular en los casos causados por mutaciones familiares de los MAPT locus. Estos estudios demuestran la necesidad de que los compuestos a facilitar la supresión de cualquiera de la piscina total de tau o específicas formas aberrantes de tau (es decir, hyperphosphorylated, misfolded, etc.) Lamentablemente, sin embargo, la viabilidad de los esfuerzos a gran escala para identificar modificadores de la proteína endógena especies ha demostrado ser técnicamente difícil. Recientemente hemos desarrollado una nueva técnica para medir cuantitativamente tau diversas especies, entre ellas un ensayo para analizar la proteína tau total y al mismo tiempo medir los niveles de GAPDH como una estimación de viabilidad celular [8]. El uso de esta plataforma, hemos analizado de una biblioteca sin protección de patentes y los compuestos han identificado varios que son capaces de reducir los niveles de tau en el cerebro derivado líneas celulares.

Una de las principales patológicos contribuyente a varias demencias es la acumulación anormal de la proteína tau. Por lo tanto, reducir los niveles generales de esta proteína puede celebrar relevancia terapéutica. Hemos desarrollado una célula cuantitativos basados en la metodología de cribado para la medición intracelular los niveles de proteína tau para identificar sin protección de patentes y la FDA aprobó los compuestos que pueden tener eficacia en contra de este importante componente proteínico de AD patología. Anteproyecto Western blot análisis reveló que, junto con sus robustas adhesividad, H4 humanos neuroglioma-al igual que las células tienen un gran tau inmunoreactividad correspondientes a las dos 3 y 4 de repetir humanos tau isoformas (Figura 1A]. Por lo tanto, hemos elegido esta línea para todas las pantallas para evaluar los niveles de tau total. Para determinar el rango dinámico lineal de tau y GAPDH en la H4 células por medio de la occidental en la celda de ensayo, las células fueron chapados en diferentes densidades de siembra y se incubarán durante 48 horas. Se determinó que para tau con la detección de 680 nm con etiqueta fluorescente anti-anticuerpo secundario de conejo y GAPDH con la detección de 800 nm con etiqueta fluorescente anti-anticuerpo secundario del ratón, el rango óptimo para la detección de tau fue en un momento en H4 células fueron sembradas en una densidad entre ~ 3 × 10 ⁴ y ~ 4 × 10 ⁵ por pocillo (fig. 1C]. A continuación, determinó que el coeficiente de variación fue del 5% para el total de inmunoreactividad tau y la relación señal-fondo proporción era de aproximadamente 12,9 ×. Por lo tanto, sin semillas 8 × 10 ⁴ células / así para todas las posteriores investigaciones.

El uso de este paradigma del CIM, seleccionados comercialmente disponibles que contienen químicos biblioteca ~ 880 funcionalmente diversas moléculas (85% de los cuales son comercializados comercialmente) para que la reducción de compuestos total tau. Los primeros análisis revelaron que el 26 compuestos (3%) fueron significativamente (p <0,05) reducir tau inmunoreactividad (IR) en relación con GAPDH IR (Tabla 1]. De estos 26 compuestos, 9 resultado en> 25% de reducción en GAPDH IR (Tabla 1; cursiva). Dos compuestos, epicatechin y betametasona, fueron falsamente identificados por nuestro análisis inicial, ya que el aumento de GAPDH IR sin cambiar tau IR (Tabla 1; pequeñas tapas) y esto modificó la tau / GAPDH ratio utilizado inicialmente para identificar compuestos. Nueve compuestos causado un> 25% de reducción en los niveles de tau con <10% de reducción en GAPDH IR, que representa quizás el más óptimo para la categoría terapéutica pertinencia (Tabla 1; negrita). Los seis restantes compuestos hizo tau reducir por lo menos en un 19% (ciclopirox) o más, con diferentes efectos sobre los niveles de GAPDH (Tabla 1; negrita-cursiva).

A fin de identificar candidatos terapéutico óptimo, hemos realizado una dosis respuesta a la H4 células con la metodología del CIM (100 μ M al 10 nM), junto con los análisis LDH. Trece fueron los elegidos entre los 25 iniciales sobre la base de varios factores, entre ellos la potencia de la tau IR reducciones de las pantallas de primaria, la relevancia de la literatura y la disponibilidad comercial. Sólo el 6 compuestos demostrado una ventana terapéutica en que la concentración que la reducción de los niveles de tau en un 50% es 10 veces inferior a la concentración que es tóxico para el 50% de las células (según la evaluación de los niveles de LDH). Cinco de estos compuestos (daunorubicin, azul de metileno, camptothecine, paclitaxel y albendazol; betametasona fue excluido debido al aumento de GAPDH IR en las pantallas de primaria), además se caracteriza por sus efectos sobre la tau de Western blot y QRT-PCR análisis. Western blot reveló que los niveles de tau se redujeron significativamente en un dependiente de la dosis de manera de los 5 compuestos de vehículo en relación con las células tratadas (Figura 2]. Daunorubicin y camptothecine demostrado reducciones similares en los niveles MAP2 y ligeras reducciones en GAPDH IR que paclitaxel, azul de metileno y el albendazol parecen reducir tau específicamente (Figura 2]. Para determinar la universalidad de estos efectos, luego evaluaron la eficacia tanto en la M17 y N2A líneas celulares. Curiosamente, sólo tau dentro de la M17 humanos neuroblastoma línea celular (Figura 3] fue sensible al tratamiento con los 5 candidatos de plomo, mientras que los niveles de tau N2A permanecido en gran medida sin cambios (no se muestra). Por lo tanto, estos efectos no fueron replicados en un neuroblastoma murino línea celular, lo que sugiere que los compuestos identificados pueden no tener suficiente eficacia en modelo murino sistemas, a pesar de la eficacia de dos diferentes CNS humanos derivados de líneas celulares.

PCR en tiempo real se utilizan para determinar si tau mRNA expresión H4 en la línea celular se modificó después del tratamiento con estos 5 candidatos. Curiosamente, daunorubicin, paclitaxel, albendazol y camptothecine todos los tau reducido los niveles de mRNA en relación con GAPDH (Fig 4]. Camptothecine y paclitaxel causado reducciones de dosis que responda a tau mRNA que albendazol y daunorubicin tau reducido de manera similar en cada uno de los niveles de concentración (con la excepción de los 10 μ M daunorubicin concentración que no tenía expresión mRNA detectable, ya sea para tau o GAPDH). Por el contrario, el aumento de azul de metileno tau mRNA expresión en relación con GAPDH a pesar de la reducción de los niveles de proteína tau (Fig 4]. Chelidonine se incluyó como un complejo de control que redujeron los niveles de tau primaria pantallas, pero no cambiar la expresión mRNA.

Si bien la mayoría de los últimos AD terapéutico desarrollo se ha centrado en la eliminación de A β o la prevención de su agregación en placas, las recientes conclusiones de Oddo et al y Santacruz et al. la acumulación de tau que sólo puede ser revertida en una etapa temprana en su patogenia AD destaca la necesidad de estrategias terapéuticas para frenar o incluso detener la acumulación de tau en esta enfermedad y otros cargos hereditarios tauopathies [5, 7]. Varias estrategias han sido recientemente sugirió que se dirigen a diversos patológicamente tau especies asociadas, incluida la hyperphosphorylated y agregación de las especies competente (Para revisión ver [6]].

Aunque la proteína tau fue caracterizado como un último estadio de AD componente de la patología, la identificación de mutaciones en el gen MAPT en pacientes con demencia clínica y un parkinsonianas fenotipo (es decir, FTDP-17) [3] demostraron que tau, y en por sí sola, es capaz de causar enfermedad neurodegenerativa. De hecho, varios estudios han demostrado que la variación genética en la crítica 5 'y promotor de la región MAPT locus se asoció con típica de aparición tardía PD (LOPD) [12, 13] y la irregularidad de la acumulación de tau se ha observado en los dos parkinsonismo kindreds y casos esporádicos LOPD [14]. Por otra parte, un informe reciente ha demostrado que la actividad transcripcional tau se veía afectada por la introducción de un polimorfismo de nucleótido único encontrado en el haplotipo H1 de parálisis supranuclear progresiva pacientes [15]. De este modo, la expresión alterada de la proteína tau puede efectivamente contribuir a la aparición de parkinsonismo, incluidos LOPD. Mientras tanto α-sinucleína y la acumulación de tau son a menudo una característica de neuropatológicos clínicamente diagnosticados pacientes con EP siguientes exámenes post mortem, un estudio reciente demostró que adenoviral sobre expresión de tau, pero no α-sinucleína, era suficiente para promover la pérdida neuronal dopaminérgica y afectar el comportamiento de giro en ratas normales otros, prestar mayor apoyo a un papel importante para tau en la patogénesis de la DP [16].

Aquí, sobre la base de los resultados que ratones deficientes totalmente tau de expresión son bastante viable [17, 18] y la idea de que en general la reducción de la piscina de tau para su posterior agregación podrá celebrar potencial terapéutico después de la aparición de enfermedades, analizamos una pequeña biblioteca de todo comercializados compuestos por su capacidad para reducir el total de los niveles de proteína tau. Utilizando un ensayo CIM [8, 9], hemos demostrado que varios compuestos de hecho, parecen capaces de reducir los niveles de proteína tau, y que de los 25 compuestos identificados, 9 estuvieron involucrados con la dinámica de microtúbulos y 4 fueron putativo de filamentos de proteína / inhibidores de la agregación. Hemos demostrado que varios de estos fármacos son capaces de tau forma selectiva los niveles más bajos sin afectar a otro microtúbulos de proteínas asociadas, MAP2. Además, varios (5) anti-proliferativa compuestos fueron identificados a partir de nuestras pantallas, destacando además el papel que desempeña tau en la división celular y la sensibilidad potencial de su expresión sobre la base de las necesidades funcionales de la célula en un momento dado.

Estamos clasificados tau-la reducción de compuestos sobre la base de su capacidad funcional como se cita en el actual cuerpo de la literatura. En la medida, en un informe reciente de Pickhardt y colegas demostraron que anthraquinones fueron capaces de disolver pareados helicoidales filamentos de tau e inhiben su agregación [20]. En anteriores trabajos también ha demostrado que la doxorubicina regula el metabolismo tanto tau [21] y perturba microtúbulos [22]. Por lo tanto, nuestra determinación de anthraquinones, como la doxorrubicina y daunorubicin, como reductores de los niveles de tau total, no sólo es compatible con las anteriores conclusiones, sino que también proporciona apoyo adicional para la idea de que los niveles de tau puede ser muy dinámica basada en la exigencia de la célula para la generación de redes de microtúbulos. Quizás es más importante, estos hallazgos sugieren que la degradación de tau es un proceso muy ordenado que requiere precisa sincronía, tanto en la traducción y transcripción niveles debido a los múltiples fragmentos de división, las reducciones en los niveles de mRNA MAPT, e incluso la aparición de mayor peso molecular tau especies que son producidos por estos compuestos. También hay que destacar que, si bien la toxicidad se observó con la duda de varios compuestos, tau niveles fueron significativamente inferiores en comparación con los niveles de GAPDH. Esto fue algo sorprendente como la vida media de ambos proteína tau mRNA y se consideran relativamente larga vida [23, 24] en comparación con otras moléculas. Ciertamente, mientras que en condiciones normales tau podría ser bastante estable, nuestros resultados sugieren que compuestos destinados a la tubulina, el sustrato de tau, promover la rápida y ordenó la retirada de tau de la célula. Esto puede indicar que los problemas de degradación de la proteína tau en última instancia, podría facilitar su acumulación anormal en una condición de enfermos, como AD y PD.

Estudios de seguimiento en la línea celular H4 reveló que el principal mecanismo por el cual estos compuestos suscitó tau reducciones probablemente debido a la reducción de la actividad transcripcional (Fig 4]. Algunas conclusiones relativas a la especificidad de este efecto se puede extraer como ha quedado demostrado anteriormente que tau mRNA es una transcripción muy estable en las neuronas debido a 3 'UTR motivos estructurales [24]. Estos resultados indican que tal vez el MAPT 5 'UTR se está modulada directamente por estos compuestos, o que los microtúbulos desestabilización activa una vía de retroalimentación negativa que reduce tau expresión. Por lo tanto, es posible que uno de los fragmentos producidos por el tratamiento con estos compuestos (Fig. 3] es también negativamente en la regulación de la expresión mRNA MAPT. Esto podría vincular la asociación genética se encuentra en el 5 'MAPT locus para LOPD que parece conducir a una mayor expresión tau [Kwok] [Patrón] con una consecuencia funcional de transporte intraneuronal afectada debido a la ruptura y microtúbulos tau expresión alterada (es decir, la acumulación de presináptica α-sinucleína y mitocondrial desglose, dos características clásicas de PD). Este hallazgo también apoya la labor anterior de Litman et al., Lo que demuestra que sí tau mRNA co-localiza con microtúbulos intacto dentro de los axones [25], y, por tanto, la perturbación de microtúbulos puede dar lugar a reducciones en los locales de ambas proteínas tau y los niveles de mRNA. Esto también podría sugerir que MAPT ARNm es tal vez localmente traducido en la pre-sinapsis, que prevé un mecanismo de regulación rápida que no se vea obstaculizada por la clásica trata de la proteína del núcleo. Por lo tanto, la alteración de la estabilidad de microtúbulos puede de hecho conducir a niveles de expresión alterada de tau.

Cuando células de neuroblastoma humano fueron tratados con varios de estos mismos compuestos y sometidos a análisis occidental, marcada degradación de tau y se observó en algunos casos un alto peso molecular (HMW) tau especies surgido. Algunos estudios han identificado este HMW tau como 110 especies kDa producida a partir de una transcripción empalmados alternativamente de tau que se encuentran predominantemente en el sistema nervioso periférico [26, 27], mientras que la capacidad funcional de HMW tau sigue sin estar clara. Otro resultado interesante fue la falta de tau reducciones detectables en el ratón N2A neuroblastoma línea celular después del tratamiento con estos mismos compuestos. Humanos y el ratón tau se procesan muy claramente, que en ratones adultos exclusivamente producir el exón 10 (+) tau isoformas mientras que los adultos normales de los seres humanos producen tanto el exón 10 (+) y el exón 10 (-) tau isoformas en una proporción de 1:1 [28] . Además, a pesar de un robusto β deposición en ratones transgénicos para formas mutantes de la proteína precursora amiloide (APP), tau ni la acumulación ni enredo formación se ha observado en estos animales. Así, un ratón tau es claramente diferente de tau humano y, por tanto, no es de extrañar que los compuestos que afectan a humanos tau no son capaces de alterar ratón tau. También sugiere que la validación in vivo de estos compuestos es probable que requieren el uso de ratones transgénicos para humanos tau o incluso ratones que se han humanizado para el gen MAPT [29].

Ciertamente, mientras que todos los compuestos identificados tienen propiedades únicas y funciones, nuestros resultados indican que los microtúbulos es un trastorno primario modificador de tau y los niveles de expresión. Si bien estos compuestos han sido utilizados normalmente para detener la división celular, todavía no se ha determinado cuál es su impacto podría ser diferenciadas a neuronas terminales que utilizan microtúbulos y sus proteínas asociadas en una forma totalmente diferente del resto del cuerpo. El reciente estudio realizado por Zhang et al. demostró que la administración in vivo de los microtúbulos estabilizador Paxceed tau impedido el secuestro y la mejora del transporte axonal en un modelo murino de tauopathy, proporcionando la primera indicación de que los compuestos que afectan la integridad microtúbulos podría tener potencial terapéutico para las enfermedades neurodegenerativas participación de tau [30]. Lamentablemente los niveles de tau no se evaluaron en los ratones transgénicos para tau humanos en este estudio, sin embargo, sobre la base de nuestros resultados aquí sería tau predijo que los niveles se redujeron en los ratones. Así, en pacientes que ya sufren de demencia hereditario, asociado con mutaciones en el gen MAPT, tal vez reducir el conjunto de los patógenos sustrato podría celebrar inmediatamente promesa clínica, en particular, ya que muchos de los compuestos identificados en este análisis son aprobados por la FDA y que actualmente está siendo utilizado por los médicos para tratar otros trastornos diversos.

El H4 neuroglioma humanos, humanos BE (2), neuroblastoma-M17 (M17) y el ratón Neuro2a (N2A) neuroblastoma líneas celulares se mantuvieron en T-75 frascos con Opti-MEM (Invitrogen) con un 10% de SFB y antibiótico. N2A células se complementaron con 2 mM de glutamina. Nueva culturas se iniciaron passaged mensual y posteriormente dos veces por semana con tripsina. En preparación para el tratamiento farmacológico y en el análisis de células Occidental, H4 células fueron passaged en 96-y placas de fondo claro (BD Falcon) a una densidad de 8 × 10 ⁴ células / pocillo y se incuba durante la noche. Las células fueron tratadas por triplicado durante 24 horas con una sola concentración (normalmente 1-10 μ M) de cada compuesto a partir de la Prestwick (880 compuestos) biblioteca o vehículo (DMSO). Sobre la base de nuestros estudios anteriores, EC82 (Conforma Therapeutics) [9] se añadió a cada plato para su uso como control positivo para la reducción de tau. Para estudios de dosis-respuesta, 100, 10, 1, 0,1 y 0,01 μ M concentraciones de drogas han sido agregadas a los pozos en doble ejemplar durante 24 horas. Para la preparación de homogeneizado por un número normal de análisis de Western blot, las células fueron passaged en 6 pozos de placas, se incubaron durante la noche y tratados al día siguiente con las drogas o el vehículo a las concentraciones indicadas. Las células fueron incubadas durante 24 horas y cosechada en una solución tampón que contiene la lisis (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 M NaCl, 0,1% Tritón-X, 5 mM EDTA), más el 1% SDS, PMSF, y tanto la proteasa y un inhibidor de la fosfatasa cóctel.

CD diseñado, realizado y analizado todos los datos generados a partir de ensayos de ICW, qPCR y el Western Blot. Compuso el papel e interpretado los resultados. PA y Nagorno-Karabaj con la asistencia de cultivo celular y análisis de Western blot. WL y LP siempre la interpretación de los resultados y la concepción intelectual. MH y CE siempre concepción inicial del programa, los fondos asegurados para la investigación, ha desarrollado la dirección del proyecto, y contribuyó a la redacción del manuscrito.