Acta Veterinaria Scandinavica, 2006; 48(1): 17-17 (más artículos en esta revista)

Impacto de la infección coccidial en la vacuna y vvIBDV en los tejidos linfoides de pollos SPF como detectado por RT-PCR

BioMed Central
Susanne Kabell (ska@dfvf.dk) [1], Kurt J Handberg (kha@dfvf.dk) [1], Magne Bisgaard (Magne.Bisgaard @ vetmi.kvl.dk) [2]
[1] Instituto Danés para la Alimentación y la Investigación Veterinaria, Hangøvej 2, DK-8200 Aarhus N, Dinamarca
[2] Departamento de Veterinaria Pathobiology, The Royal Veterinary and Agricultural University, 4 Stigbøjlen, DK-1870 Frederiksberg C, Dinamarca

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Resumen
Fondo

Este estudio tiene como objetivo investigar un posible efecto causado por coccidios en la respuesta inmunitaria a la vacuna-y muy virulenta infecciosa bursal disase virus (vvIBDV) en pollos SPF.

Métodos

Dos grupos de tres semanas de edad SPF pollos fueron vacunados antes de la inoculación con coccidios y desafío virulento con IBDV, todos en un plazo de ocho días. Dos grupos de control fueron tratados de manera similar, excepto que el desafío con virus de campo se omitió en un mismo grupo, mientras que la inoculación con coccidia se omitió en el otro grupo. Los signos clínicos, lesiones en los intestinos causada por coccidios, lesiones en la bursa de Fabricius causados por IBDV, IBDV-títulos de anticuerpos, y la detección de virus de la transcripción reversa reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) se compararon entre los grupos. Tejidos linfoides y hisopo muestras fueron analizadas por el general RT-PCR, y los resultados positivos fueron identificados por la cepa específica dúplex (DPX) RT-PCR.

Resultados

En el triple infectados por grupos, IBDV cepa de la vacuna se detectó en el bazo y el timo tejidos, y sobre el terreno no se detectaron virus en muestras bursa, en contra de la doble infección por grupos.

Conclusión

Los resultados sugieren un efecto sobre la mejora de la respuesta inmunitaria causada por la coccidiosis subclínica vvIBDV y actúa de manera concertada.

Fondo

Enfermedad de Gumboro, posteriormente llamado enfermedad infecciosa bursal (EII) es una enfermedad en pollos jóvenes infecciosa causada por el virus de la enfermedad bursal (IBDV), un doble hundidos, bi-virus ARN segmentados [1]. Dos serotipos 1 y 2, se ha informado, serotipo 1 es el único patógeno para los pollos domésticos [2]. Varias cepas de serotipo 1 de diversa virulencia han surgido, tal como fue revisado por [3]. Hasta la fecha definitiva marcadores de virulencia no han sido identificados. IBDV objetivos de la IgM positiva linfocitos B en la bursa de Fabricius [4, 5], transitoriamente comprometer la humoral, así como la respuesta inmune celular [6, 7].

La infección con el virulento IBDV en tres a seis semanas de edad los pollos provoca una alta morbilidad y mortalidad, seguido por la inmunosupresión en los pollos que sobreviven [8]. La exposición a una edad más temprana sólo se traduce en la inmunosupresión [9]. La inmunosupresión puede causar una mayor susceptibilidad a diferentes antígenos incluidos Salmonella [10], bronquitis infecciosa [11], la enfermedad de Newcastle [12] y E. tenella [13, 14]. Sin embargo, la situación inversa, el impacto de las diferentes infecciones en el curso de una infección por IBDV, incluyó la vacunación, aún no se ha investigado.

Problemas debido a IBDV se han notificado brotes de Dinamarca [15] y varios otros países [16 - 18], incluso en los rebaños vacunados [19], el aumento de las especulaciones de que diversos factores de estrés, infecciones subclínicas, en particular, podría influir en el resultado de la vacunación. Eimeria especies son consideradas como parásitos omnipresente en la mayoría de los entornos de aves de corral, colonizar las tripas de pollo después de ingestión de ooquistes esporulados. Coccidial infecciones son tradicionalmente controlada por los coccidiostáticos en el alimento. Sin embargo, en Dinamarca todo el trigo se añade gradualmente a la alimentación, y de la edad de tres semanas y hasta el tratamiento, 25-30% de la alimentación de pollos de engorde puede ser sustituido por el trigo. La concentración de los coccidiostáticos disminuye proporcionalmente, aumentando el riesgo de coccidiosis subclínica. E. tenella principalmente repeticiones en el epitelio de la cecae, pero el desarrollo de las etapas de E. tenella se han encontrado en la bursa de Fabricius [13], también participan en la replicación de IBDV [20]. El desarrollo de inmunidad protectora hacia coccidia incluye principalmente la mediada por células del sistema inmunológico [21], mientras que la protección contra IBDV, previsto sobre la base de la respuesta inmune humoral [22], también depende de las células T participación [23]. De hecho, Yeh et al. [24] han informado, que químicamente bursectomised re-pollos infectados con IBDV, en ausencia de anticuerpos humorales contra IBDV están protegidos por la mediada por células del sistema inmune por sí solo. Como coccidios y IBDV podrán fijar el mismo grupo de edad de los pollos e invadir el tejido mismo, la inmunidad y también en cierta medida se basa en factores similares, encaminadas a investigar la influencia de una infección subclínica coccidial en la EII pollos vacunados, posteriormente impugnada con vvIBDV. El objetivo de nuestro estudio fue investigar el efecto de la presencia de coccidios en el tejido distribución de la vacuna y vvIBDV. En un artículo anterior, documentamos las indicaciones de vvIBDV replicación en los tejidos linfoides de los pollos vacunados [25]. Se sospecha que la infección subclínica coccidial podría destacar los pollos suficiente para agravar la tensión sobre el terreno de replicación, a pesar de la vacunación.

Los parámetros investigados y comparación incluidos los signos clínicos, lesiones patológicas en el intestino y en la bursa de Fabricius, la seroconversión, y la presencia de ARN viral en los tejidos linfoides y bursal muestras de hisopo.

Métodos
Pollos

Huevos libres de gérmenes patógenos de Lohmann Tierzucht (Cuxhaven, Alemania) se incubaron en condiciones de laboratorio, y los pollos son criados como hemos descrito anteriormente [26]. El método para euthanisation de pollos fue de conformidad con el artículo 2 (1) en la Directiva 86/609/CEE del Consejo, de 24 de noviembre de 1986.

Virus

Cepas de virus utilizadas incluyeron la venta en el comercio EII D78 cepa de la vacuna y la cepa virulenta DK01, descritos anteriormente [26].

Coccidial cepa y la inoculación de protocolo

E. tenella ooquistes de un sueco sobre el terreno brote fueron amablemente proporcionados por el doctor P. Thebo, SVA, Upsala. Los ooquistes esporulados y se mantuvo en el 2% de solución de dicromato de potasio a 12 ° C [27]. La solución que figuran 200 000 esporulados E. tenella ooquistes por ml y unos 10 E. acervulina ooquistes por ml, según las estimaciones de conteo en una cámara de McMaster bajo un microscopio. La dosis de ooquistes esporulados, se ajustó a infectar a las aves sin causar mortalidad [28]. La dosis óptima se decidió de acuerdo a los resultados del siguiente experimento preliminar: Doce pollos fueron D78 vacunados con la vacuna de acuerdo con las recomendaciones empresa (Intervet, Boxmeere, Países Bajos) cuando eran de 21 días de edad. Al día 24 se dividieron en cuatro grupos de tres pollos cada uno y las piernas marcadas por las marcas. Después de un tiempo de alimentación de cuatro horas, esporulados E. tenella ooquistes se dieron oralmente a las siguientes dosis, 0, 150, 1500 y 15 000. Los pollos fueron euthanised siete días después de la inoculación, y la autopsia se realizó de inmediato para evaluar el grado de infección coccidial. Resultado lesión resultados, evaluados según lo descrito en la detección de coccidios, fueron los siguientes: 0,0,0; 0,0,0; 3,2,2 y 3,3,3. De estos resultados se decidió a inocular tres grupos experimentales con ooquistes esporulados 1500 cada una, con el fin de imitar coccidiosis subclínica.

Detección de coccidios

El tracto intestinal fue retirado inmediatamente después de la muerte y un examen microscópico bajo luz intensa. Lesión resultados fueron evaluados de acuerdo con Johnson & Reid [29]. En cuanto a E. tenella, 0 = no hay lesiones graves, 1 = algunas petequias dispersas en la pared cecal, cecal normal de la pared y el contenido, 2 = más numerosas petequias, algo cecal pared engrosada, la sangre presente en el contenido cecal, 3 = coalescent petequias, cecal engrosamiento de las paredes en gran , Mucho de sangre y fibrina en paños contenido cecal, 4 = Cecal paredes muy hinchado y engrosada, con distensión de sangre o coágulos caseosa. En cuanto a E. acervulina, 0 = no hay lesiones graves, 1 = pocos alargada manchas blancas en la pared duodenal en una escalera-como aspecto normal de la pared intestinal y el contenido, 2 = numerosas manchas blancas en la pared duodenal, normal pared intestinal y el contenido, 3 = coalescent lesiones en todo el duodeno, engrosamiento de la pared intestinal, el contenido acuoso y viscosa, 4 = completamente coalescent lesiones, grisáceo mucosa, en gran pared intestinal engrosada, mucoide contenido.

Además, se preparó frotis de duodeno, yeyuno y ciego, a fin de confirmar la presencia de coccidios de examen directamente bajo microscopio de luz.

Histología

Bursa tejidos fueron fijados en el 4% de formaldehído durante la noche, incrustado en la cera de parafina y cortar en 2 μ secciones, montado en Super Frost Plus diapositivas y teñidas con hematoxilina y eosina (HE) [30].

Las lesiones observadas en los tejidos bursa se transforma cuantitativamente. Bursa muestras que no muestran las lesiones que le asigna un valor de 0, lesiones participación de entre uno y 25% de los folículos se le asignó un valor de 1, 26 a 50% se le asignó un valor de 2, 51 a 75% se le asignó un valor de 3 , Y 76 a 100% folículos afectados se le asignó un valor de 4.

Serología

Las muestras de suero fueron almacenadas a -20 ° C hasta el momento de analizar. Las enfermedades infecciosas Bursal Antibody Test Kit 113 de BioChek BV (Gouda, Holanda) se utilizó a lo recomendado por el fabricante. Microsoft Exel fue utilizado para el cálculo del IBDV ELISA títulos de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Microsoft Excel también se utilizó para el cálculo del promedio de los títulos dentro de los grupos incluidos desviaciones estándar, se ilustra gráficamente.

La extracción de RNA y RT-PCR

La extracción de ARN y la RT-PCR se realizaron tal como está descrita anteriormente [25, 26].

Diseño experimental

Cuatro grupos (1-4), incluyendo 23, 24, 23 y 23, respectivamente, los pollos fueron vacunados tal como se recomienda (Intervet, Boxmeere, Países Bajos) con la cepa D78 a la edad de 21 días. A la edad de 24 días, los pollos en los grupos 1, 3 y 4 fueron inoculados oralmente con ooquistes esporulados 1500 cada uno. Los piensos se retiró cuatro horas antes de la inoculación para facilitar el flujo de los ooquistes en el intestino. A continuación, 0,225 ml de solución de ooquistes esporulados fue diluida en 5,775 ml de agua del grifo, y 0,2 ml de esta mezcla se inoculará en cada pollo por vía oral. Grupos 2, 3 y 4 fueron impugnadas con vvIBDV a la edad de 28 días (Cuadro 1]. Las observaciones y registros incluyen los síntomas clínicos, serología y patología. Tres pollos de cada grupo fueron euthanised en los días 28 (ante el virus de desafío), 29, 30, 31, 36, 38 y 42. El día 44, los otros dos pollos en grupos 1,3 y 4, y los otros tres pollos en el grupo 2 fueron incluidos en la muestra. La sangre se recogió antes de euthanisation, y los cadáveres fueron sometidos a autopsia inmediatamente después de la muerte. El tracto intestinal se examinó para las lesiones debido a la coccidia. La mitad de la bursa de Fabricius, así como el bazo, timo y la médula ósea y se tomaron muestras congeladas a -80 ° C. La otra mitad de la bursa fue tratado como se describe en la histología. Bursa hisopos fueron recogidos de los grupos 2 y 4 durante el examen post mortem, eluye en solución salina estéril durante una hora y conservan congelados a -20 ° C hasta el momento de analizar. Todas las muestras de tejidos y muestras de hisopo fueron inicialmente analizadas por Qiagen RT-PCR sin desnaturalización [26]. En caso de resultados positivos, todas las muestras de tejido similar del mismo grupo fueron analizadas por dúplex (DPX) RT-PCR [25] para la identificación de la cepa de virus.

Con el fin de verificar la presencia de virus viable en la bursa tejidos que den positivo para DK01 DPX por RT-PCR, un nuevo experimento se llevó a cabo. Un quinto grupo de once, tres semanas de edad, los pollos SPF, criados y criados como grupos de 1-4 fue contratado. La mitad de cada una de la bursa de Fabricius que den positivo para DK01 fue tratado tal como está descrita anteriormente, antes de la inoculación en estos pollos en tres semanas [26].

Resultados
Signos clínicos

Pollos en grupos de 1-4 no presenten signos clínicos de la enfermedad en cualquier momento durante el período experimental.

Coccidia

Las lesiones se observaron en cifras brutas de examen de cecae de los tres grupos de pollos infectados con coccidia (grupos 1, 3 y 4) el día 31, siete días después de la inoculación, y, al mismo tiempo, numerosas unsporulated ooquistes, que corresponden a la morfología y el tamaño de E . tenella fueron vistos por microscopía de raspado del cecae. Las lesiones fueron evaluadas como puntuación de 3 en los tres grupos. El día 36, los 12 º día después de la inoculación, las lesiones compatibles con lesiones causadas por E. acervulina fueron evaluados como Resultado 2 en pollos de los mismos grupos. Numerosos unsporulated ooquistes, que corresponden a la morfología y el tamaño de E. acervulina se observaron en raspado de duodeno y yeyuno. El cecae parecía normal, y sólo unos pocos ooquistes fueron observadas en raspaduras. Lesiones intestinales no se observaron después de los 12 días después de la inoculación.

El desarrollo de formas E. tenella no se observaron en cualquier muestras de tejidos de la bursa de Fabricius.

IBDV patología

Gross cambios patológicos debido a IBDV sólo en relación con la bursa de Fabricius. Aleatoriamente se producen ligeros ampliaciones de la bursa se observaron en los 28 días, una semana después de la vacunación. Lesiones microscópicas se observaron en todos los bursa muestras de tejidos, excepto uno de 38 días de edad pollo del grupo 5. La cepa de la vacuna inicialmente causó el agotamiento de linfocitos, edema intersticial y plegado de epitelio folicular. Después de desafío con DK01, el agotamiento de linfocitos se hizo más pronunciada, como vacuolas y células necróticas se observaron en la médula folicular, y la estructura de los folículos se disolvió. Bursa lesiones observadas en los grupos 3 y 4 incluyen una mayor parte de la bursa de tejidos que las lesiones observadas en los grupos 1 y 2 en los días 28 ó 29. La lesión Resultado disminuido con el tiempo después de 30 días en el grupo 1, mientras que la lesión resultados de los grupos 2, 3 y 4 se mantuvo, ya sea alto o aumentado después del desafío con virus de campo en los 28 días (Cuadro 2]. Lesión resultados varían considerablemente dentro de cada grupo de tres pollos.

Serología

Títulos de anticuerpos fueron positivos siete días después de la vacunación. Promedio título valores para cada grupo de tres pollos en varios casos mostró grandes desviaciones estándar, y los resultados de ninguno de los grupos se apartan significativamente de los resultados de uno de los otros grupos durante todo el experimento (los resultados no se muestra).

RT-PCR

En el grupo 1, ARN del virus identificado como D78 se encontró en los tejidos sólo bursa, el 96% de estas muestras de ser positivo (Tabla 3]. En el grupo 2, el 96% de las muestras bursa también figura D78, y además, dos muestras de médula ósea y seis bursa hisopo se encontraron muestras positivas. En los grupos 3 y 4, 74% y 96%, respectivamente, de bursa muestras contenidas D78. Sorprendentemente, varios bazo y timo muestras de estos dos grupos se encontraron también positivo (Tabla 3]. La cepa, DK01 fue sólo detectado en seis muestras de los pollos que afecta a cuatro de un total de 70 pollos infectados con el DK01. Tres de estos pollos son de los grupos 2, como DK01 fue identificado en los tejidos de bursa días 29, 31 y 44. Además, DK01 se detectó en el timo y un hisopo bursal de la bursa-positivo de pollo desde el día 31. La sexta muestra positiva es una muestra del bazo de un pollo en el grupo 3 el día 36.

Adicional experimento

Dos días después de la inoculación con extracto bursa, los once bursa-pollos inoculados fueron clínicamente enfermos y, por consiguiente, sacrificados. La autopsia reveló hinchada bursa de Fabricius petequias y hemorragias musculares. DPX RT-PCR utilizando el tejido de la bursa de Fabricius detectado dos D78 y DK01 bursa en todas las muestras (datos no presentados).

Discusión

Aunque los síntomas clínicos no se observaron, lesión resultados documentados y microscopía coccidiosis subclínica en los grupos 1, 3 y 4, dos días después de los pollos en los grupos 3 y 4 fueron retados con el virus de campo. Desde el mismo día, sin pollos se espera que muestran síntomas clínicos de la EII [26]. La presencia de coccidiosis subclínica no tener un impacto negativo sobre la vacunación contra la EII lo suficientemente importantes como para provocar síntomas clínicos, dejando las razones por las interrupciones de vacunas en condiciones de campo no explicada. Las razones de por qué no observar un agravante efecto sobre el sistema inmunitario que favorece E. tenella como se informó anteriormente [14] podrían ser las diferencias en las cepas IBDV, las diferencias en las dosis de esporulados coccidia (1500/150 000), o que nuestra inoculación experimental con coccidia sólo dio lugar a un único ciclo de vida en el país de acogida, probablemente debido al alambre piso en el aislamiento. Diferentes edades de los pollos también pueden haber influido en los experimentos.

Bursa lesión resultados fueron más severas para los grupos 3 y 4 que para el grupo 2, excepto para el grupo 4 el día 30 y ambos grupos los días 38 y 44. La presencia de coccidios podría haber agravado el desarrollo de lesiones en la bursa provocada por IBDV. Como el número de muestras en cada grupo de edad era demasiado pequeño para la evaluación estadística fiable de los resultados, más investigaciones son necesarias para la documentación de una posible influencia de coccidios en bursa lesiones causadas por IBDV.

Serología se utilizó sólo para confirmar, que todos los pollos habían seroconvirtieron. Titre valores no son más interpretados, ya que esto requeriría investigaciones sobre el rendimiento técnico de la prueba ELISA-kit utilizado, que quedan fuera del alcance de este trabajo [31].

D78 fue detectado en el bazo y el timo tejidos de los grupos 3 y 4, pero no desde el grupo 2, lo que indica que la presencia de coccidios pueden haber influido en la distribución de la vacuna cepa de ARN. Sin embargo, esta teoría se veía afectada por la falta de D78 en el bazo, timo y los tejidos del grupo 1. Zhang et al. [32] detectó un celular adaptado IBDV cepa en el bazo y el timo tejidos cuatro horas pi. Estamos especularon que esto podría indicar que las cepas vacunales generalizar y repetir continuamente en diferentes tejidos linfoides, pero a un nivel más bajo que en la bursa, y, por tanto, indetectable por la mayoría de nuestros métodos actuales, hasta que la replicación se mejoró en los grupos 3 y 4. Como una mayor replicación en el timo y el bazo no se registró en los grupos 1 y 2, la reacción actual parece depender de una estimulación concurrente de ambos coccidios y vvIBDV. Rautenschlein et al. [33] sugiere que la estimulación de antígenos sistémica causada por un aumento de la replicación de IBDV en extrabursal tejidos puede dar lugar a una mejor protección de la EII. Esto puede explicar que sólo se detectan vvIBDV en una sola muestra de bazo, pero no en la bursa o tejidos bursal hisopos de los grupos 3 y 4, no con indicación de las excreción de vvIBDV en estos grupos. En comparación, se acaba de ver la repetición de DK01 bursa en los tejidos de tres pollos en la no-inoculados coccidia el grupo 2, lo que sugiere que la excreción de al menos uno de ellos, como detectó la presencia de ARN viral en la bursa hisopo. Indicaciones de replicación y excreción de vvIBDV en pollos vacunados se han discutido en un trabajo previo [25]. La importancia de la D78-positivas las muestras de médula ósea del grupo 2 aún no se ha investigado.

Conclusión

En conclusión, coccidios no parecen afectar a IBDV vacunación en pollos negativamente. Por el contrario, nuestros resultados sugieren un efecto aditivo de concurrentes estimulación del sistema inmunológico de coccidiosis subclínica y vvIBDV, la mejora de la reproducción y distribución de la vacuna contra la cepa de pollo en los tejidos linfoides. Suponiendo que la replicación y de presencia de virus de la vacuna en extra-bursal tejidos linfoides medie una mejor protección, nuestro experimento indica que coccidia contribuido a una mejor respuesta inmune tras la vacunación IBDV. Las perspectivas de estas conclusiones podría ser una posibilidad de beneficiarse de una mejora de efecto inmunológico de los concurrentes, controlada viral y las infecciones parasitarias. Más investigación en el campo inmunológicas complejas consecuencias de las infecciones en los pollos es muy pertinente.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

SK diseñado y llevado a cabo los experimentos y redactó el manuscrito

KJH supervisado y ajustado los procesos de laboratorio

MB concibe el estudio y participó en la redacción del manuscrito

Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a GP Bach, Hansen HC, S. Jespersen, PH Jørgensen, M. Madsen, M. y P. Mörch para Thebo valiosa asistencia y apoyo en este trabajo, que fue financiado por el Instituto Danés para la Alimentación y la Investigación Veterinaria como parte de un estudio de doctorado.