El maíz transgénico puede afectar a las comunidades microbianas del suelo?

Bacillus thuringiensis es un gram-positivos-que forman esporas bacteria que produce cristales parasporal durante esporulación que son patógenas para algunos insectos y otros organismos [1 - 8, Figura 1 A]. En contraste con lepidopterans alimentación por sí sola en los cristales, una pauta clara de las sinergias se demostró lepidopterans para la alimentación en los más patógena mezcla de esporas y cristales [9, 10]. Los preparativos de las esporas bacterianas y las proteínas cristalinas son ampliamente utilizados como insecticidas Bt para el control de plagas de insectos de los cultivos. Toxinas Bt-se clasifican sobre la base de su actividad específica contra invertebrados [11 - 14]. Cry1Ab es una toxina de uso común contra el barrenador del maíz europeo ( Ostrinia nubilalis Hübner) y pueden ser producidos como de larga duración protoxin, como por Monsanto, o como las producidas por Novartis, truncado, preactivated toxina. Además de los informes de insectos que parecen haber adquirido resistencia a las toxinas larvicida pertenecientes a la familia de proteínas Cry1 [por ejemplo, 15], nontarget efectos de la toxina producida por el gen insecticida cry1Ab publicado en la raíz exudados de transgénicos B. thuringiensis maíz siguen sin estar claras. La heterogeneidad intrínseca de la rizosfera de, entre otros, solo las raíces del maíz, es único y bien investigados [16, 17], en contraste con la mayor parte del suelo. Sin embargo, importantes efectos nontarget fuera de la rizosfera no han sido detectados [por ejemplo, 18 - 21]. Comunidades microbianas que ocurren belowground genéticamente modificadas en virtud de los cultivos Bt son, en realidad, menos investigado, y los posibles efectos sobre microorganismos del suelo siguen siendo motivo de preocupación [20, 21]. Las toxinas pueden acumularse en los suelos después de post-cosecha de maíz es paja enterrada (Figura 1 B) y, posteriormente, las toxinas se unen a los componentes del suelo, tales como minerales arcillosos [22] y ácidos húmicos [23]. Sin embargo, a nuestro conocimiento, ¿hasta qué punto este tipo de perturbación del medio ambiente es reconocible en las comunidades bacterianas no se ha abordado todavía. Nuestro objetivo es tener una mejor visión ecológica en la comunidad microbiana utilizando el metabolismo de las huellas dactilares a granel bacterias del suelo bajo condiciones controladas.

Las diferencias se produjeron en la respiración microbiana actividad de muestras de suelo con paja añadido transgénico en comparación con las muestras de suelo con residuos de maíz convencionales (Cuadro 1, Gráfico 2]. A corto plazo, aumento de la respiración microbiana actividad fue mostrada por un pico en la producción de CO ₂ entre los 24 y la 72 ª hora de todas las muestras de suelo tratadas con residuos de maíz transgénico (tanto Novelis o Valmont). El suelo se mantuvo el control, en promedio, a 5,5 ± 3,2 μ g de _CO 2-C ^{g -1} d ^-1 durante todo el experimento. Estas tasas de producción de CO ₂ sugieren diferentes patrones de mineralización de maíz Bt-paja en comparación con la paja de maíz convencional (p = 0,0004). Sin embargo, todas las tarifas de la producción de CO ₂ son aproximadamente comparables después de cuatro días (Figura 2]. Además de sustratos fácilmente degradables, como la paja, siempre mejorar la respiración del suelo, pero en este caso una parte mucho mayor actividad se correlacionó claramente con material vegetal transgénico. Suelos modificado con el maíz Bt-había paja, 30 h después de la adición del material vegetal transgénico, un 73% más que la respiración de los suelos modificado con paja de maíz convencionales. Después de 43 h, aumentó a 157%. Sin embargo, después de 72 h, esta tendencia positiva cambió, como la respiración del suelo se redujo rápidamente al 61%. Durante la fase inicial del experimento (Figura 2], modificada el 20 repeticiones mostraron una relación positiva entre las mayores concentraciones de proteínas Cry en el añadido de paja y las tasas de producción de CO _2: la primera isoline (Nobilis | Novelis) mostró p < 0,00001, y el segundo isoline (Preludio | Valmont) mostró p = 0,0008. Esta última exposición mucho mayor desviaciones estándar (SD), Preludio con ± 39 y transgénicos con Valmont 69 ± SD.

Paralelamente a las mediciones de respiración del suelo, tanto el conteo de unidades formadoras de colonias (CFUs) y la medición del metabolismo de las huellas dactilares de BIOLOG se realizaron a lo largo de un gradiente de tiempo. Al comienzo del experimento, no hubo diferencia significativa fue detectable entre los 5 × 2 microcosmos de suelo (UFC media es igual a 5 × 10 ^6, con p = 0,088). La adición de maíz dado lugar a un pulso de células viables 30 h después de la enmienda del suelo, tal y como previamente detectadas por la respiración del suelo (Figura 2], pero este pulso se rompió 43 h después de la adición de los residuos de la cosecha (Figura 3]. El sistema convencional de Nobilis, que se inició con el mayor número de CFUs (6,34 × 10 ⁶ al comienzo del experimento), sino que representa en promedio el menor número de CFUs (1,06 × 10 ¹⁰⁾ después de la adición de paja, fue la única excepción. Las curvas de CFUs crecido después de la adición de material transgénico mostrar una segunda, mucho más nítida pico 7 d después de la enmienda (Figura 3]. La placa demostró que el agar-crecido colonias en el suelo con paja modificación de los dos cultivares transgénicos, Novelis y Valmont, fueron, respectivamente, y 2,78 × 3,77 × más que en los suelos modificado con Nobilis paja. Después de la adición de los residuos de la cosecha, el promedio de UFC (2,19 ± 3,39 × ¹⁰ 10) se mantuvo cuatro órdenes de magnitud superior a la media de UFC antes del inicio del experimento (4,99 ± 1,21 × 10 ^6). Por tanto isolíneas, los promedios de agar-CFUs crecido no mostraron diferencia significativa después de 21 d (p> 0,86). Straw de Valmont, cultivar los transgénicos con la concentración más baja de la proteína Cry1Ab y el más alto contenido de proteínas, grasas, azúcares y almidón (Tabla S1], presentaron el mayor número de CFUs. Setenta y seis por ciento de la CFUs creció durante las primeras 48 h, pero sin diferencias significativas entre transgénicos y cultivos convencionales.

La utilización única de 31 fuentes de emisión de carbono por las comunidades bacterianas de los suelos en presencia de concentraciones crecientes de la proteína Cry1Ab se midió por un color el desarrollo del ensayo realizado en placas de microtitulación BIOLOG (véase Materiales y Métodos]. Dos tipos de maíz transgénico residuos se han tenido en cuenta y se compararon con los residuos de los cultivos convencionales y paja sin EcoPlates. Reacciones metabólicas se mide por el cambio de tinte de color púrpura a (individual y el desarrollo de color (WCD)), lo que indica el crecimiento de bacterias heterótrofas en un sustrato como el carbono y fuente de energía. Cuando las fuentes de carbono individuales se compararon con arreglo al tratamiento, hay diferencias con muchos de estos sustratos a través del tiempo durante todo el experimento. Las tasas de cambio de color con el tiempo en cada pocillo de la EcoPlate mostró que 12 de 31 de sustratos parece ser más específico para la comunidades bacterianas en los suelos transgénico modificado con paja (Tabla 2 y la Tabla S2, respectivamente). Dos tercios de estos Bt-sustratos sensibles fueron los hidratos de carbono (Tabla S2]. La mayoría de ellos (α-D-lactosa, β-metil-D-glucósido, D-celobiosa, D-manitol, D-xilosa, glucosa-1-fosfato, y N-acetil-D-glucosamina) se correlacionó positivamente con la presencia de la proteína Cry1Ab (Tabla S2], mientras que i-eritritol es el único hidrato de carbono correlacionó negativamente con la proteína Cry1Ab (Cuadro 2]. Otro de hidratos de carbono presentes en esta 31 única fuente de carbono fijado, D, L-α-glicerol fosfato, no mostró ninguna respuesta significativa a la concentración medida de la proteína Cry1Ab (Tabla S2].

Independientemente de los días transcurridos, los condes de un determinado color de desarrollo (un valor CMP que es específico para la respectiva fuente de carbono) mostró diferencias dentro de cada isoline en la actividad catabólica de las bacterias del suelo durante todo el experimento. Estas diferencias en la utilización potencial de carbono están claramente relacionados con la adición de material transgénico y describir una menor utilización de algunos sustratos. Entre los 31 × (31 - 1) = 930 posibles matriz de correlaciones entre la EcoPlate sustratos, el 9,3% correlaciones fueron (algo) que responda a α = 0,10 y 30,7% fueron altamente significativas a α = 0,05. No hubo predominio de una u otra, directa o indirecta, las correlaciones entre los 31 independientes fuentes de carbono, como el 52% de las correlaciones fueron positivas y 48% fueron negativos.

El tiempo es también el modelo canónico como covariable (ver [24] y Materiales y Métodos]. Figura 4, una de las principales curvas de respuesta (PRC) diagrama, tal como se define en Van den Brink y Ter Braak [24], mostró que los patrones de reacción en el tiempo de la comunidad microbiana en virtud del maíz Bt-paja con mayores concentraciones de la proteína Cry1Ab son totalmente diferentes de las comunidades tratados con otros residuos de cultivos transgénicos o aquellos tratados con paja de maíz convencional (p = 0,0020). Sin embargo, las respuestas BIOLOG parecía ser opuestos a los de la placa cuenta, como aquí la Novelis cultivar transgénicos, cuyas varillas mostró la mayor concentración de la proteína Cry1Ab y el más bajo contenido de proteínas, grasas, azúcares y almidón (Tabla S1] , Exhiben el más alto patrón de reacción con el tiempo. Según [24], la MLRP de maíz convencional parece que no guardan relación con otros patrones de respuesta por falta de tiempo y Bt-tratamiento.

Usando el control no tratado como una adecuada especificación de anidación (véase Materiales y Métodos] para ajustar los datos para su primera respiración de suelo a un multinivel modelo lineal generalizado, β-metil-D-glucósido (F _1,38 = 5,15) fue la única de carbohidratos que mostraron una significativa (inversa) correlación entre el tratamiento con paja que contiene una alta concentración de la proteína Cry1Ab y la utilización de carbono (Tabla 3], si bien el mencionado grupo de hidratos de carbono como un producto químico gremio representa una correlación directa entre el tratamiento con transgénicos paja y la utilización de carbono. Un interesante punto de discusión es que casi todos estos hidratos de carbono no parecen apoyar la mayoría de las bacterias cultivables experimental en los pastizales. En la investigación sobre bacterias del suelo a granel crece en la Suiza BIODEPTH área de estudio [25], el 50% de los 31 disponibles en fuentes de carbono mostraron un muy significativa la probabilidad de error de la regresión lineal cuesta ser diferente de cero. Por otra parte, estos autores han sugerido un aumento general de la actividad catabólica en sus ricos en nutrientes Lolium perenne praderas [25]. En nuestro caso, el 39% de las fuentes de carbono disponibles muestran una correlación altamente significativa de distinta-de-cero pendiente con la proteína Cry1Ab (Cuadro 2]. Sólida diferencias en la utilización potencial de carbono también fueron consistentes con anteriores estudios de campo sobre los nutrientes de los pobres de tierras altas praderas. Por ejemplo, algunos sustratos de carbono negativamente correlacionada con la concentración de la proteína Cry1Ab, como los aminoácidos neutros L-fenilalanina (Tabla S2], fueron compuestos descrito como típico para muchos no, los pastizales de las islas británicas [26].

Podemos concluir que, posiblemente, la radiación adaptativa de las bacterias del suelo a granel en nuestro microcosmos poco después de la adición de maíz Bt-paja era mucho más fácilmente detectables en el laboratorio que en el campo (un mosaico de bloques en condiciones experimentales con el pisoteo y de corte [25 ], O una gradación de los pastizales de montaña con mucha mayor utilización de los azúcares en nutrientes ricos en los sitios, posiblemente refleja la disponibilidad de sustrato [26]]. En realidad, pulsante microbiana efectos del maíz transgénico paja se hizo más evidente debido al alto contenido de azúcar añadido de algunos Bt-material (1,11% peso seco en los transgénicos cv. Valmont, dos veces el contenido de su planta madre Preludio). Incluso algunos aminoácidos mostrado una correlación significativa entre la concentración de la proteína Cry1Ab y la CMP, es decir, L-Asparagina (F _1,38 = 6.46) y L-arginina (F _1,38 = 5,53). Además, estos aminoácidos se consideran importantes para el análisis de composición de maíz [27]. No está claro si las diferentes estimaciones de la actividad catabólica como CMP tras la adición de material transgénico son reales o son estocásticos resultados. Estas diferencias de tiempo entre la log-transformado CMP estimaciones son a menudo pequeñas; en el campo, donde los errores son mayores, las mismas incertidumbres temporales se aplican a otras posibles especificaciones de anidación.

Estas posibilidades deben ser abordados en los futuros análisis. En general, sin embargo, la tendencia es claramente diferente de la actividad catabólica de las bacterias en todos los microcosmos tratados con material vegetal transgénico en comparación con las del control y de los suelos modificado con los residuos de los cultivos convencionales.

En experimentos de microcosmos hemos examinado los efectos de la adición de paja de maíz en propiedades tales como la respiración y catabólicos actividades de la comunidad bacteriana. La hipótesis de que las variaciones en la actividad belowground reflejan la influencia de las plantas transgénicas, debido al efecto de la proteína Cry1Ab en la mayor parte bacterias del suelo, y, por ende, sobre la capacidad de la comunidad microbiana para metabolizar las fuentes de carbono. Se combinaron las técnicas microbiológicas y mixtos modelos lineales generalizados para facilitar un entendimiento más amplio posible de estrés.

Los modelos de crecimiento realizadas establecido una sorprendente dicotomía entre los suelos, ya sea modificado con convencionales o transgénicas paja. Las concentraciones de la proteína Cry1Ab influido claramente en la composición de la comunidad microbiana. Prueba del suelo para aumentar la respiración durante el segundo y tercer día del tratamiento puede ser interpretada en relación con la presencia de material vegetal transgénico.

Microbiana absorción de azúcares parece verse afectada por la presencia de material transgénico (p = 0,0015). Nosotros no detectó ninguna correlación entre el aumento de la actividad microbiana por debajo de una capa de paja transgénicos y su contenido de almidón, lignina, hemicelulosa y celulosa. La adición de paja de cultivos Bt-señaló también a un aumento microbiana BIOLOG consumo de hidratos de carbono (p <0,0001).

Nuestros datos sugieren que, en contraste con estudios anteriores, la introducción de maíz transgénico influye en la abundancia, diversidad y funcionamiento de los ecosistemas, la mayor parte de bacterias del suelo. En general, los datos que proporcionan apoyo a la idea de que un Bt-inducida por radiación adaptativa puede ocurrir rápidamente en las comunidades microbianas por debajo de campos de maíz.

Se corta pero sólida diferencias en la comunidad microbiana del suelo después de la adición de material vegetal transgénico. Maíz Bt-paja puede causar no sólo un aumento de la abundancia de CFUs, pero también puede seleccionar para determinados rasgos ecofisiológicas. Esto puede explicar la similitud en respuesta a largo plazo de los suelos tratados con diferentes residuos de maíz. Por lo tanto, las comunidades microbianas extraídos de estos microcosmos siguen siendo bastante comparables a las de los suelos espacialmente homogéneos.

Estos resultados pueden tener implicaciones importantes para el buen estado ecológico de evaluación de riesgos de organismos genéticamente modificados a nivel de la comunidad [21, 28]. Las bacterias son abundantes y muy variadas [29 - 33] y puede responder rápidamente a las perturbaciones ambientales [32 - 36], por ejemplo durante la competencia por los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano y la actividad [34 - 36]. Todos los resultados de estos estudios mostró una evidente respuesta de las bacterias en mayor parte del suelo a la adición de los residuos de la planta transgénica.

La técnica de las huellas dactilares del metabolismo permitió la rápida detección de cambios en la diversidad funcional de la comunidad microbiana tras la introducción de la toxina Cry1Ab en el medio ambiente. Una cuestión resultante de una mayor investigación es, por tanto, para determinar genéticamente que los componentes de la comunidad microbiana contribuir al incremento de la actividad poco después de que el tratamiento con material transgénico.

El suelo es un stagnic luvisol que contiene 75% limo, arcilla 21%, y el 4% de arena de la Hebenshausen 37249 sitio (Meierbreite, 51 ° 21 'N, 9 ° 52' S) del Departamento de Ecología de Suelos y Nutrición de las Plantas en la Universidad de Kassel (Alemania). Total de carbono del suelo y nitrógeno total del suelo fueron analizados por combustión seca, y el porcentaje de carbono orgánico se calculó restando el contenido de carbonato total de carbono del suelo. El pH del suelo se midió en agua desionizada con un electrodo de vidrio. El suelo contenía 1,45% de carbono orgánico y 0,13% de nitrógeno total y tiene un pH de 6,4. Material vegetal se recogieron cerca de Halle (Sajonia-Anhalt) en el sitio sobre el terreno de una red de investigación del Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación. Residuos de brotes (mezcla de tallos y hojas) de cuatro sobre el terreno crecido cultivares de maíz han sido recogidos en la cosecha al final del período de vegetación en octubre de 2002. Novelis (MON810, de Monsanto, http://www.monsanto.com ) Y Valmont (Evento 176, Syngenta Seeds, http://www.syngenta.com ) Fueron los cultivares transgénicos; Nobilis (correspondiente a Novelis) y Preludio (correspondiente a Valmont) se nontransgenic isolíneas. El material vegetal fue secado a 40 ° C. Los tallos y las hojas se mezclaban y cortar con tijeras en trozos pequeños de unos 5 cm de longitud. Una parte del material fue motivo de análisis y experimentos de incubación in vitro. La concentración de la toxina Bt (Cry1Ab proteína) se determinó con la prueba ELISA (enzima-ligado al ensayo inmunoenzimático) QuantiPlate utilizando el Kit de EnviroLogix ( http://envirologix.com ). La proteína Cry1Ab estuvo presente, como era de esperar, sólo en material vegetal transgénico (Tabla S1]. Straw Evento de 176 (Valmont) tuvieron una menor concentración (0,842 μ g g ^-1 ± 0,278 SD) que a partir de paja MON810 (Novelis) (3,859 μ g g ^-1 ± SD 0,527), según el test de Tukey (HSD, α = 0,05 ).

Ecosistemas propiedades como el uso del suelo y la estructura del suelo se sabe que el control de la proporción de CO ₂ por la evolución de O ₂ en la absorción de los suelos nonsterile [36]. Por lo tanto, la medición de corta duración específica la frecuencia respiratoria (tasa de respiración microbiana por unidad de biomasa microbiana), bajo condiciones estandarizadas se realizó para determinar los cambios en la respiración microbiana inducida por la actividad de perturbación en el tiempo. Veinte y nueve ollas de vidrio de 1,0 L se utilizaron, 5 × 5 para la titulación (5 × 4 cultivares y 5 × 1 control) y 4 × 5 para BIOLOG (muestras compuestas, [1 + 2] × 5 y [3 + 4 ] × 5). La tolerancia a Cry1Ab de la comunidad microbiana fue elegido para ser medida por el desarrollo en color BIOLOG EcoPlates y de enumeración de CFUs en placas de agar.

La incubación se realizaron experimentos en cámaras de clima constante ajustado a 15 ° C. Dos gramos de suelo los residuos de la planta (peso seco) se añadieron a 50 g de tamizado (2 mm) del suelo fresco ajustado al 75% de la capacidad de retención de agua en ollas de cristal y tarros de vidrio, y mixta (algunas muestras de suelo después del tratamiento se muestran en la Figura 5]. Además, un control de recibir el mismo tratamiento, excepto para la aplicación del material vegetal se incluyó en el diseño experimental. Los suelos en las macetas se humedecerse todos los días. CO ₂ fue atrapado durante un período de muestreo en NaOH (0,5 M y 0.2M) y detectados mediante una valoración utilizando un Metrohm 665 Dosimat de acuerdo con la técnica de Isermeyer [37]. La respiración se ajustaron a intervalos en función de la actividad del suelo. La detección de CO ₂ atrapado y el cálculo de las tasas de respiración se llevaron a cabo inicialmente durante cortos períodos (diario) y más tarde en 3-D (dos veces) y 5-d (dos veces) intervalos.

Las bacterias fueron extraídos del suelo inmediatamente antes de cada titulación: 15 g de muestra de suelo, sobre la base de peso seco, se mezcla con 150 ml estéril buffer (10 mM bis [2-hidroxietil] imino-tris [hidroximetil] metano (BisTris, Sigma, http://sigmaaldrich.com ) A pH = 7,0) durante 1 minuto a velocidad máxima y luego se centrifuga durante 10 min a 500 gramos. De acuerdo con el método de Van Beelen et al. [38], el sobrenadante se transfirió a 2 ml viales Eppendorf estériles, rápidamente congelados en nitrógeno líquido, y se almacena a -70 ° C hasta el análisis de la comunidad a nivel fisiológico perfiles (CLPP). Este último paso congelación difiere de la original método de Rutgers et al. [39], pero los CLPP de repeticiones realizadas en diferentes puntos temporales durante un año no fueron significativamente diferentes entre sí (p = 0.12), ya que la mayoría de las suspensiones de nuevo suelo ha bacterias muy similares y perfiles BIOLOG UFC placa cuenta congelada en comparación con las suspensiones [40, 41].

Las colonias de células viables se cultiva en 0.1TSA (Trypton soja caldo nutriente de Oxoid, http://www.oxoid.com , Y agar) 5-d de edad, placas de acuerdo con el método de propagación placa. Para obtener el número adecuado de colonias, una serie de cuatro diluciones se hizo, es decir, 3 ^-8, 3 ^-10, 3 ^-12, y 3 ^-14. El número de CFUs se registró después de 8 d de incubación a 25 ° C. Esta muy sensible contar da la mejor información sobre la densidad de células viables.

Para el análisis de los CLPP, la densidad de inóculo independiente enfoque se ha aplicado [39 - 43]. Serie de 3 diluciones de la suspensión bacteriana se produjeron ⁽³ -1 - 3 ^-12), proporcionando una completa gama de color formación en los niveles múltiples, placas de BIOLOG ( http://www.biolog.com ). Estas placas se comercializan como EcoPlate [44, 45], la versión de microplacas BIOLOG diseñado específicamente para microecological estudios (original de la microplaca se describe en [42]]. Aparte de un pozo de agua, contienen tres EcoPlates reproducir juegos de 31 fuentes de carbono, además de un nutriente y solución de sal y un tinte redox. Las placas se inoculan con 100 μ l de suspensión por pocillo y diluido (en 1 / 4 fuerza solución de Ringer) para obtener una densidad de las células de aproximadamente 1 × 10 ⁸ células ml ^-1 (determinada por acridina naranja conteo directo [46]]. Toda la lista de 31 compuestos químicos y los gremios a los que pertenecen de acuerdo a [45] se puede encontrar en el cuadro S2 y en http://www.biolog.com/pdf/eco_microplate_sell_sheet.pdf . Tales conjuntos de único específico de fuentes de carbono fueron proporcionados específicamente para probar las comunidades bacterianas [40 - 45]. El EcoPlates fueron incubadas en la oscuridad a 20 ° C y al menos el 85% de humedad relativa para evitar la evaporación [40]. La cantidad de inóculo que causó el 50% del máximo teórico de respuesta para cada sustrato de conversión (individual CMP) se comparó con la cantidad de inóculo que causó el 50% del máximo teórico medio de respuesta (AWCD) de todos los 31 sustratos en un EcoPlate (log-transformado los valores), lo que resulta en un valor para la abundancia relativa de ese sustrato de conversión [40]. Lo ideal sería que la dilución serie ofrece una completa gama de color los niveles de formación> 95% a <5% de la AWCD. Cada CMP se midió individualmente a 590 nm durante toda una semana [40] semiautomático mediante un sampler y un espectrofotómetro (Spectra MAX250, http://moleculardevices.com ). Cuanto más específico es así de colores, más la fuente de carbono es metabolizada. Similares patrones de definir y, por tanto, comparable de carbono procedente de utilización.

Análisis de varianza (ANOVA PROC) y anidadas (y no anidados) modelos lineales generalizados (PROC MIXED, GLM) se utilizaron para evaluar el efecto de la concentración de la proteína Cry1Ab en la respiración microbiana. La fuerza de una relación entre cada CMP Cry1Ab y se midió el valor parcial de correlación (PROC CORR) utilizando las sumas de cuadrados y productos cruzados. El montaje de los modelos multinivel (en este caso, las ollas de vidrio en función de su tratamiento) y los modelos de crecimiento (una serie de dilución en 12 secciones de cuatro BIOLOG EcoPlates (tres secciones cada una) la comprensión de cada 31 fuentes de carbono repetido 2 ×) requiere un enfoque flexible de estadística. El PROC MIXED de SAS rutina 9.1.3 ha sido elegido, como PROC MIXED fue escrito por los científicos agrícolas que buscan una mezcla de generalización de los modelos lineales que permite tanto fijos como de efectos aleatorios [47]. Después de invocar el procedimiento, tres variables categóricas se definieron a partir de la declaración CLASE: i) addition_straw, ii) Bt, y iii) Cry1Ab. El modelo indica la declaración de efectos fijos (cada fuente de carbono (por lo tanto, A2… H4) versus tiempo determinado como predictor, es decir, 0, 2, 3, 7 y 21 d), RANDOM y la declaración con los tres anidados SUB = opciones se especifica la estructura jerárquica multinivel. Obviamente, predictores adicionales pueden ser incluidos en este modelo, pero la sencillez de la declaración se limitó a un único predictor del tiempo distinta de la de interceptar. Por ejemplo, la sintaxis de L-arginina (A4), utilizando el "entre / dentro" (pc) el método para calcular el denominador grados de libertad ( ) Es la siguiente:

Dos especificaciones estructurales en el PROC MIXED declaración son la opción covtest (pruebas de hipótesis para la varianza y covarianza componentes; ver [48]] y la noitprint opción (para evitar la iteración completa la historia). Los componentes: addition_straw (0 = no la paja, 1 = añadido los residuos de la cosecha) y Bt (addition_straw), con cualquiera de las dos convencionales = 0 o 1 = transgénicos, son objeto binario efectos (maniquíes), mientras que Cry1Ab (Bt) es una de tres niveles (0, 0,8, 3,9 μ g / g) con sujeción efecto. Si el suelo se modifica, la clase-1 unidad (addition_straw = 1) se divide en una clase-2 unidad (Bt) con un no o un Bt Bt. Si transgénico (Bt = 1), esta clase-2 unidad se subdivide en una clase-3 unidad con tres niveles (alto Cry1Ab, bajo Cry1Ab, o ninguna en absoluto). Por ejemplo, la serie de dilución mayor parte del suelo con paja Novelis inoculados en BIOLOG EcoPlates sería codificada como [1 1 3,9], el Preludio convencionales sería codificada como [1 0 0], y el control (una mayor parte del suelo sin ningún tipo de residuos de la cosecha ) Se codificarán como [0 0 0]. De ese modo cuatro series (Nobilis, Novelis, Preludio, y Valmont) se realizaron para la evaluación de la tasa de cambio de color en cada pocillo a d 2, 3, 7 y 21 (4 ×) en dos réplicas cada uno, junto con 4 × 2 en los controles d 0 (4 × 4 × 2 + 4 × 2 = 40 observaciones de lectura y se utiliza). En el funcionamiento PROC modelo mixto, por las dimensiones, por lo tanto, sujeto siempre 40 observaciones (de los cuales 32 son objetos con estado 1, es decir, addition_straw = 1).

Las estadísticas de la bondad del ajuste de varios modelos con los mismos efectos fijos (en este caso, el tiempo), pero diferentes de efectos aleatorios (en este caso, los residuos de la cosecha, si los hubiera) es evaluado por la Akaike criterio de la información (AIC) y por el mucho más Sawa estrictas de información criterio Bayesiano (BIC). La prueba AIC penaliza para añadir parámetros al modelo, por tanto el modelo con el menor valor de AIC es elegido [49]. La prueba AIC calcula la cantidad: , Cuando el l _i son los residuos de los mínimos cuadrados mejor se ajusten a los datos del modelo lineal, es la suma de errores cuadrados, n es el número de datapoints, y p es el número de parámetros del modelo. De manera similar, el modelo con el más pequeño del BIC Sawa valor es elegido [50]. El BIC prueba calcula la cantidad: dónde La última prueba del tipo III de efectos fijos proporciona la importancia del modelo elegido (Tabla 3: p-valor, y F-ratio en el texto). Dado que los efectos que impliquen la clase constará de las aportaciones múltiples parámetros, las pruebas de estos efectos tienen múltiples grados de libertad (aquí, 38 grados de libertad). A multivariante respuesta a tiempo se utilizó para evaluar el efecto de la proteína Cry1Ab en la respiración microbiana, y se realizó en CANOCO 4,5 [24].