Focalizada dinámica molecular estudio de C-Loop cierre del canal y gating en receptores nicotínicos

Los receptores nicotínicos de la acetilcolina (nAChRs) pertenecen a una familia de ligando-garse los canales iónicos que unen a las moléculas de neurotransmisores [1, 2], y mediar rápida transmisión de señales a las sinapsis en todo el sistema nervioso central y periférico. Son pentamers formado, ya sea de un solo tipo de subunidad o de diferentes tipos de subunidades homólogas. Cada subunidad se compone de un conservadas N-terminal ligando vinculante dominio seguido de tres hélices transmembrana (marcadas M1 a M3), una variable frente al citoplasma de bucle, un cuarto dominio transmembrana (M4), y un corto C-terminal extracelular región. Existen dos subtipos de nAChRs presentes en el sistema nervioso: el tipo de receptores neuronales, que se encuentra en el sistema nervioso central y autonómica en todos los ganglios, y los receptores de tipo neuromuscular, presente en el neuromuscular somática cruces de los músculos. Recientemente, nAChRs neuronal como α4β2 y α7 se han convertido en atractivos objetivos terapéuticos para el tratamiento del dolor, deterioro cognitivo, enfermedad neurodegenerativa, la esquizofrenia, la epilepsia, ansiedad y depresión a causa de su papel modulador influencia en el sistema nervioso central [3 - 6] .

Al agonista vinculante a la subunidad interfaces, el ligando vinculante dominio de los nAChR conformacionales se someten a reordenamientos que se propagan a la membrana de dominio-que abarca y la causa de la apertura de canales de iones. Detalles de agonista inducida por cambios conformacionales en el ligando vinculante de dominio han sido recientemente obtenidos a partir de cristalográfica de las estructuras relacionadas con la acetilcolina proteínas de unión (AChBPs) [7 - 11]. El análisis comparativo de una estructura de apo AChBP con varios complejos agonista estructuras indica que los grandes cambios conformacionales están localizados en los bucles de C y F [11]. El C-bucle se comporta como un ligando-desencadenó la tapa, que se mueve por 4 ~ Å, efectivamente cerrar la ligando vinculante bolsillo. La estructura del agonista determinada AChBP también reveló reorientación sustancial de varios residuos en el sitio de unión asociada con C-bucle de reorganización. Sin embargo, como un mínimo de cambios estructurales se han visto cerca de la membrana extracelular de vinculación regiones, el mecanismo estructural que las parejas pequeños cambios en el ligando vinculante de dominio a la puerta de canal sigue siendo difícil de alcanzar. Además, a pesar de su evidente la homología de las diferencias farmacológicas entre los nAChRs y AChBPs puede indicar que los reordenamientos estructurales en la parte inferior de la ligando vinculante dominio difieren en las dos proteínas.

Información adicional sobre la dinámica del ligando vinculante de dominio ha sido proporcionada por la sonda química y métodos mutagensis [12, 13]. Recientemente, mediante la determinación de energía acoplamientos entre pares de residuos a través de un solo canal actual grabaciones, Sine et al. puso de manifiesto que el acoplamiento inicial de obligar a gating fue mediada por la tríada de residuos conservados Lys145 α, α Tyr190, y α Asp200 en el músculo del receptor nicotínico [14]. Los mismos investigadores demostraron más que un par de residuos conservados, Arg209 y Glu45, son la electricidad, junto a la vinculación agonista vinculante para canalizar gating [15]. Medidas importantes también se han realizado hacia el descubrimiento de las transiciones que ocurren durante gating en el dominio de transmembrana. El empleo de aminoácidos no naturales mutagénesis, Lummis et al. mostró que un cambio de prolina de las redes transeuropeas a la conformación cis podría abrir el poro de un neurotransmisor-garse canal iónico [16]. Sitio de mutagénesis dirigida de la poro-M2 forro de dominio, junto con el análisis cinético, sugiere un simple poro mayor mecanismo de gating [17], en lugar de los propuestos anteriormente mecanismo de rotación de las hélices M2 [17, 18].

En este estudio, dirigido dinámica molecular (TTM) de simulación se realizó en el receptor α7 humanos para investigar el acoplamiento inicial de C-bucle de cierre para canalizar gating, y para determinar cómo los residuos Arg206 (equivalente a Arg209 en el músculo del receptor; ver la secuencia alineación en la Figura 1] y Glu45 podría vincular a gating vinculante. Por comparación, un niño de 10 ns estándar equilibrio dinámica molecular (MD) de simulación del mismo sistema, denominado "el control de simulación más adelante, también se llevó a cabo. MD simulaciones han sido cada vez más empleado para proporcionar una visión en detalle atómico, así como los aspectos dinámicos de mecanismos estructurales, que a menudo son difíciles de lograr por sí solo experimento [19]. Desde la disponibilidad de los Cryo-EM estructura del Torpedo nAChR, una serie de MD se han realizado estudios sobre los receptores nicotínicos. Esbirro et al. estudió la dinámica del ligando vinculante de dominio del ser humano receptores nicotínicos α7, y observó asimétrica mociones, en presencia de diferentes ligandos [20]. MD simulaciones del dominio transmembrana investigó la dinámica de las hélices M2 [21 - 23], la importancia de la hidrofóbicas puertas [24, 25], y los lípidos-M4 interacciones [26]. Más recientemente, una simulación en el ser humano α7 nAChR con el ligando vinculante dominios transmembrana y reveló que la proteína sufre un giro a cerca moción por la que se correlaciona movimientos de la C-lazo con la rotación y movimiento hacia el interior de dos subunidades nonadjacent [ 27]. A pesar de estos avances, una importante limitación para la aplicación de MD simulación para el estudio de nAChRs es que la escala de tiempo para la transición gating (μ s-ms) está más allá de la gama actual de cálculo de trazabilidad. Por lo tanto, en este estudio, TTM simulación se utiliza para acelerar la transición conformacional de los inactivos a la estructura activa [28]. El actual TTM simulación se inició a partir de un modelo de homología del receptor α7 humanos sobre la base del Cryo-EM estructura del receptor nicotínico de Torpedo Marmorata [29]. Durante la simulación, la C-bucles de dos subunidades alterna (correspondientes a las dos subunidades α en el Torpedo receptor) se vieron obligados a desplazarse hacia el ligando determinada conformación (representado por la estructura cristalográfica de agonista-AChBP obligados [8]] de restricción a través de fuerzas aplicadas a ocho residuos en la punta de la C-bucle (véase Materiales y Métodos]. Una importante premisa es que la C-bucle regiones del nAChR y AChBP someterse similares reordenamientos estructurales después de la acetilcolina vinculante. A pesar de la mínima reordenamientos distal de la ligando-en el sitio de unión ligando-AChBP obligados, observamos grandes cambios conformacionales hacia la parte inferior del ligando vinculante de dominio en el nAChR obligados a C-bucle de cierre. Estos cambios estructurales se traducen a los poros de dominio, dando lugar a un canal abierto en parte dentro de 4 ns de TTM simulación.

El ligando determinada conformación de la C-bucle, como se refleja en la estructura cristalográfica de AChBP en complejo con carbamoylcholine [8], se utilizó como objetivo la estructura de nuestra TTM simulación (Figura 2 Ay 2 B). La raíz cuadrada media-desviación (RMSD) entre el C-bucle (sobre la base de átomos de C ^α de los residuos 183-200) en el objetivo inicial y las estructuras se ~ 4,3 Å. Este RMSD se redujo gradualmente, a través de la aplicación de las restricciones de energía, lo que resulta en un "abierto" a "cerrado" C-loop transición, lo que corresponde a una transición conformacional de los inactivos a un supuesto estado activo. Después de 2 ns de TTM simulación, la C-lazo doblado sobre el ligando-sitio de unión, con un RMSD relativo a la estructura de meta ~ 0,4 Å. El C-permanecieron en bucle cerrado para la conformación posterior de 2 ns período de relajación. Hubo poco retraso o distorsión estructural durante la transición, lo que indica que una proporción relativamente baja energía barrera separa a los dos C-bucle conformaciones.

C-bucle de cierre dio lugar a una pequeña escala reorganización estructural de varios residuos en las proximidades de la ligando vinculante bolsillo. Estos reordenamientos dado lugar a la formación de un vínculo entre el hidrógeno Tyr188 en la C-loop y Lys145 β en el capítulo 7. Durante la DTM simulación, la distancia entre Nueva Zelanda (Lys145) y OH (Tyr188) disminuyó de 5,7 a 3,1 Å Å. La última distancia de 3,1 Å es similar al observado en la estructura cristalográfica de ligando-AChBP obligados [8]. Para investigar la fuerza de la Lys145-Tyr188 hidrógeno de bonos y la posibilidad de que su formación puede contribuir a la C-bucle de cierre, el efectivo libre de energía (potencial de fuerza media (PMF)) se calculó utilizando el muestreo general de la NZ-OH distancia. El agonista determinada conformación fue estabilizado por ~ 1,9 kcal ^{mol -1} cuando la formación de un enlace de hidrógeno a distancia de 3,0 Å (Figura 2 C), comparables a las medidas experimentalmente la energía de acoplamiento entre Lys145 y Tyr188 de 2,6 kcal mol ^-1 [ 14]. La fuerza del enlace de hidrógeno es algo más débil de lo esperado, probablemente debido a la flexibilidad de la C-loop y la íntima interacción de ambos con residuos de las moléculas de agua cuando no interactúan. La débil interacción de Lys145 con Tyr188 pueden ayudar a explicar por qué la mutación de uno o ambos residuos canal gating reduce la eficiencia, pero no abolirla completamente [14]. Además, hay probablemente otros residuos o mociones, tales como la rotación del núcleo interno de la β capítulos, que contribuyen al acoplamiento ligando-vinculante para el poro del canal.

Inmediatamente después de la marcha hacia el interior de la C-bucle, capítulos β9 y β10 se observó que se someta a una moción de deslizamiento, que pasó la parte inferior del capítulo β10 en las cercanías de Arg206. Esta reorganización dio lugar a un desplazamiento al alza promedio de Arg206 ~ 1,5 Å de la superficie de la membrana, así como un desplazamiento hacia el exterior de ~ 1,0 Å del canal eje (Figura 3]. A pesar de la amplitud del movimiento es pequeña, que resultó ser suficiente para iniciar la posterior cambios conformacionales que dio lugar a la ampliación de los poros.

La punta de la β1-β2 enlazador de perfeccionamiento activo fue objeto de una moción de poro hacia el centro a raíz de la parte inferior de la β10 capítulo. Inicialmente, esta moción fue sterically obstruida por la parte superior de la M2-M3 enlazador, en particular de Pro269, que se mantuvo en estrecho contacto con Glu45 y Lys46 de la β1-β2 enlazador (Figura 4]. La eliminación de la obstrucción steric entre estos residuos permitido un ~ 10 ° de rotación de la M2-M3 enlazador durante la DTM simulación. Esta rotación se refleja en el cambio de la interacción nonbonded energías muestra en la Figura 5 A. Una vez β1-β2 aprobada por el M2-M3 enlazador, los contactos entre M2-M3, β1-β2, Cys bucles y se convirtió en menos amplia. Al mismo tiempo, una base más estable de hidrógeno se estableció vínculo entre Arg206 y Glu45 (Figura 4 B y 4 D).

Para cerciorarse de que los movimientos de la β10 capítulo, M2-M3,-β1 y β2 bucles fueron desencadenadas por la reordenación forzosa de la C-bucle, hemos examinado las propuestas de resolución de estas regiones en un niño de 10 ns MD simulación de control durante el cual la fuerza no se aplicó. Durante el control de simulación, la C-bucle se trasladó más lejos de la unión de bolsillo, junto con un ligero movimiento de flexión de la β10-M1 bisagra en la N-terminal de la M1. Los residuos 205-207 (situado en la región bisagra) desplazado hacia el centro del poro, se desplazan en dirección opuesta en comparación con los mismos residuos en la DTM simulación. Por otra parte, la columna vertebral de los residuos 45 y 46 a β1-β2 permaneció relativamente invariable. En contraste con los movimientos de rotación observada en la DTM simulación, la M2-M3 enlazador sufrió una baja de curling movimiento hacia la superficie de la membrana. Esta moción fue uncorrelated dinámicamente con la cercana β1-β2 región.

El C ^α RMS fluctuaciones durante la DTM simulación se muestran en la Figura 6. La mayoría de las regiones pantalla relativamente pequeñas fluctuaciones. Excepciones notables son la C-bucle (residuos 186-193), F-bucle (residuos 160-170, β8-β9), y Cys bucle (residuos 128-142). Asp197 se mantuvo relativamente invariante, sino que mantuvo su vínculo inicial con el hidrógeno Lys145 mientras que la formación de un segundo enlace de hidrógeno con el Tyr188. Considerables fluctuaciones eran evidentes para la parte media de los aviones F-bucle, en consonancia con la aparición del trastorno en el Cryo-EM estructura [29]. Nuestro TTM simulación también mostró la F-loop rotatoria ligeramente hacia el exterior de su posición inicial. Un consecuencia de esta rotación es que se convirtió en Asn171 más expuestos al solvente. Asn171 Inicialmente se dedicaba a la amplia interacción electrostática con residuos Lys46, Asn47, Asp131 y vecinos de subunidades. La eliminación de esos contactos es compatible con los últimos hidrofóbicas photolabeling experimentos que propuso el F-bucle local cambia su medio ambiente durante canal gating [12].

El conservadas Cys-loop es indispensable para el acoplamiento agonista vinculante para canalizar gating [30, 31]. En nuestra simulación TTM, todo el lazo tendido a acercarse más a β10-M1. Sin embargo, la muy conservadas FPFD motivo (residuos 135-138), que se extiende hasta las cimas de las cuatro hélices transmembrana, restringido la circulación de la Cys-loop, causando una ligera torsión en el centro de bucle. Uno de los residuos junto a la FPFD motivo, Trp134, se encontró a apartarse del plano de la membrana de superficie, también de acuerdo con photolabeling experimentos [12]. Aunque es prueba directa de la falta actual de TTM simulación que los movimientos de la Cys-loop y el M2-M3 enlazador son dinámicamente junto, el estrecho contacto mantenido entre Phe135 (situado en el bucle Cys) y Ile271 (situado en el M2-M3 linker) durante la simulación, sugiere que la Cys-loop puede actuar como un punto de giro para el movimiento de M2-M3 enlazador.

Ha sido propuesto anteriormente que un acoplamiento entre Arg206 y Glu45 desempeña un papel importante en el acoplamiento agonista vinculante para canalizar gating [15]. En el curso de simulación de TTM, esta interacción parece esencial para mediar en la moción concertada de la β10-M1 (Arg206)-β1 y β2 regiones (Glu45). Esta interacción parece causar la parte inferior de la línea β10 señalar a la β1-β2 bucle fuera de su ubicación original. Cuando el receptor se encontraba en la conformación inicial de descanso, un enlace de hidrógeno se formó entre Arg206 y Glu45. Este enlace de hidrógeno rompió espontáneamente en el transcurso de los 10 ns-control de simulación (Figura 4 A y 4 C). Sin embargo, después de ~ 1,5 ns de TTM simulación, la C-C ^{α α} distancia aumentó en un 1 ~ Å (Figura 5 B). En este momento, dos más favorable bonos de hidrógeno formado entre Arg206 y Glu45 (Figura 4 B y 4 D). Tomados en conjunto con los experimentos de mutagénesis de una demostración de un puente entre la sal Arg206 y Glu45 [15], los presentes resultados sugieren que un puente más fuerte de sal se asocia con la activa relación con la conformación inactiva. Para determinar la interacción entre la fuerza Arg206 y Glu45, se calculó la eficaz utilización de la energía libre NH1-OE1 y NH2-OE2 distancias como dos coordenadas de reacción. Dos conformaciones columna vertebral fueron investigados, uno correspondiente a la estructura inicial de reposo (Figura 4 C) y una segunda correspondiente a la final conformer de la DTM de simulación (Figura 4 D). Se constató que con la conformación inicial de columna vertebral, sólo un enlace de hidrógeno es posible con una interacción favorable de 2,3 kcal mol ^-1 (Figura 7 A). El hidrógeno unión fue de 3,7 kcal mol ^{-1 más} estable como Arg206 y Glu45 se separaron de ~ 1 Å (Figura 7 B), en consonancia con el acoplamiento de energía experimental de ~ 3,1 kcal mol ^-1 [15]. Cabe señalar que la experimentación libre de energía asociados con Arg206-Glu45 acoplamiento se midió mediante la aplicación de análisis del ciclo de mutantes en el canal gating paso. Este acoplamiento de energía se originó a partir de la serie de mutaciones a Arg Gln y Arg Glu a, y que probablemente han sido aún mayor si un mutante para el ciclo a Arg Glu Glu y para Arg conjunto podría haber sido generado [15].

Anteriormente, no se ha podido inferir detalles estructurales del receptor gating mecanismo porque no significativo más allá de los cambios conformacionales C-bucle de desplazamiento son evidentes en las estructuras cristalinas AChBP [11, 20, 32]. En el curso de simulación de TTM, los movimientos de Arg206 y Glu45 fueron claramente unido. Es probable que la mutación de cualquiera de residuos que interrumpir la propagación de un cambio conformacional de la unión a los poros de dominio. En la estructura cristalina de AChBP [8, 11], Lys206 (equivalente a Arg206 en nAChRs; ver la secuencia de alineación en la Figura 1] señala claramente fuera de su pareja, mientras que la orientación de Glu45 (o Ser45 en Aplysia AChBP) es similar al que en nAChRs. Por otra parte, desde Lys206 está situado en la C-terminal, esta región de la estructura puede ser de suficiente precisión para describir las diferencias en la presencia o ausencia de agonista.

Ion conducción se produce a conformacionales reordenamientos de los poros de revestimiento hélices que abrir el canal. En el actual TTM simulación, la moción de poro dominio aumentado gradualmente el radio del vestíbulo central (cuantificados en la Figura 8]. Este vestíbulo ampliar la zaga del cierre de la C-bucle de la ligando vinculante de dominio, lo que implica la existencia de una importante barrera energética (> 1,2 kcal mol ^-1). Esta observación es consistente con la propuesta de que un estado intermedio pueden existir entre el ligando vinculante dominio transición y canal gating [33]. En comparación, el tamaño de poro se mantuvo relativamente invariable a lo largo del control de simulación (Figura 8 A). Esto es coherente con el anterior equilibrio simulaciones donde sólo el menor radio de poro se observaron las fluctuaciones [25]. De este modo, los poros observados en la ampliación de la actual TTM simulación puede ser una consecuencia directa de C-bucle de cierre.

El steric interacción de los β1-β2 bucle con el M2-M3 enlazador que parecía ser un factor importante la apertura del poro de la ampliación. Sin embargo, como el movimiento de la M2-M3 y el enlazador β1-β2 bucle se produjeron casi simultáneamente en la DTM de simulación, también es posible que el desplazamiento de la Arg206-Glu45 par eliminado steric interacciones que han restringido la circulación de poro - revestimiento hélices. Como se ilustra en la Figura 4 D, la β10-M1-β1 y β2 vinculación desvinculado de la M2-M3 enlazador después de la DTM de simulación. Esta retirada podría liberar al M2-M3 enlazador a rotar y permitir que el M2 hélices para moverse. De este modo, el β10-M1-β1 y β2 vinculación en el estado de reposo puede simplemente bloquear una tendencia intrínseca de la cadena para abrir. Para ayudar a aclarar esta cuestión, se realizó un complemento de simulación en el dominio de transmembrana de los receptores α7 donde la obstrucción steric (es decir, la Cys bucle, el β10, y el β1-β2 vinculación) fue retirado por la supresión de dominio extracelular. Después de 10 ns de la norma de equilibrio MD simulación, no aumentar el tamaño de poro se puso de manifiesto (datos no publicados). Por lo tanto, la apertura de los poros en nuestro TTM simulación es probable impulsada por la rotación de los β1-β2 bucle. Sin embargo, el efecto de eliminar obstáculos steric de la parte inferior de la ligando vinculante de dominio no puede ser completamente descontado, debido a la limitada escala de tiempo de la simulación complementaria.

El tiempo de evolución de la renta mínima de tamaño de poro y el correspondiente eje z posición durante la DTM simulación se muestra en la Figura 8 B y 8 D. Hacia el comienzo de la simulación (de 0.5-1.2 ns), el mínimo tamaño de poro se redujo ligeramente (de 2,0 a 1,7 Å Å), lo que indica un ligero estrechamiento de los poros. Más cerca de inspección reveló que esto se debió a la cadena de lado a los movimientos intracelulares final del poro. Después de este primer retraso (~ 1,2 ns), el mínimo tamaño de poro empezado a aumentar (suponiendo un valor de 3,0 ± 0,3 Å). Es interesante señalar que la posición mínima de poro desplazado durante la DTM simulación. En un principio, el radio mínimo de poro localizado cerca de la mitad del poro (posiciones 9 'y 13'). Como la simulación avanzado y el mínimo poro Radio aumentado, la parte más angosta del poro fluctuado entre las posiciones 9 'y 13' y entre las posiciones 16'and 20 '. En particular, la posición de poro alrededor de 16 'no estrecha, sino más bien su tamaño no aumentó en la misma medida que en las proximidades de las posiciones 9' y 13 '. Esta observación es consistente con un reciente Cryo-EM estructura del Torpedo nAChR, lo que indica que el mínimo poro posición localizada entre las posiciones a 9 'y 13', y que el canal puede ser cerrada por la rotación de los correspondientes residuos [18]. Además, photolabeling y sustituido-cisteína accesibilidad experimentos han proporcionado pruebas convincentes de que algunos residuos de revestimiento de poro cambiar su accesibilidad durante disolvente canal gating [34 - 37].

Se propuso anteriormente que el M2 hélices someterse a un cuerpo rígido de rotación durante gating [18]. Sin embargo, las propuestas precisas de las espirales son todavía en gran parte desconocido. Hemos utilizado dos parámetros para cuantificar el movimiento general de la M2 hélices durante la DTM simulación. A saber, la orientación angular de una hélice en relación con el canal eje, y la rotación de una hélice alrededor del eje del canal (ver Materiales y Métodos]. Hemos observado tanto la inclinación y rotación de las mociones durante la DTM simulación (Tabla 1]. Dado que la fuerza externa se aplica a subunidades A y D, estas subunidades se espera que muestre la mayor circulación. Esto parece ser cierto en el caso de movimiento de rotación. Ambos A y D subunidades de girar en sentido horario ~ 7 °. Sin embargo, también subunidad C girada por ~ 4 °. El grado de inclinación de cada M2 hélice no parece depender de las fuerzas externas; todos M2 hélices se convirtió en algo más inclinado (3 ° -6 °) en el supuesto estado abierto.

Los parámetros que describen simple cuerpo rígido de rotación y la inclinación de la hélice puede no ser suficiente para describir las propuestas más complejas en los poros de dominio [17, 21, 38, 39]. Por lo tanto, una auto-ángulo de rotación parámetro fue desarrollado para vigilar los movimientos de cada poro de revestimiento residuos (Tabla 1]. Este análisis parece ser más informativo. A pesar de residuos equivalente (en la misma posición M2) en diferentes subunidades girar asimétrica durante la DTM simulación, una tendencia general se puso de manifiesto con más rotación de los ángulos negativos de los residuos en la A y D subunidades. Es decir, los residuos que se enfrenta el canal luz en subunidades A y D girar en sentido horario de ~ 30 °, lo que parece suficiente para eliminar la obstrucción de cadenas laterales hidrofóbicas. En particular, los tres residuos (en la parte inferior: 2 ', media: 13', y la parte superior: 20 ') en el mismo dominio M2 girar en la misma dirección, aunque con diferentes magnitudes. Un análisis más detallado reveló que las cadenas laterales de Val252 (posición 13 '), posiblemente, cambiado su accesibilidad a la luz mientras que las cadenas laterales de Gly241 (posición 2') y Glu259 (posición 20 ') sigue siendo accesible a la luz. En general, las auto-análisis firmemente rotación implica que un movimiento de rotación está involucrado en los poros, mientras que la ampliación de disfavoring la posibilidad de una mera ampliación de poro o mecanismo de inclinación. Además, se redujo la magnitud de la hélice de inclinación y rotación en comparación con los parámetros de la libre rotación de medición indica que la propuesta no puede calificarse como un simple cuerpo rígido de rotación, sino que implica también la inclinación, doblado, o ambos de la M2 estructura helicoidal.

Dada una estructura orientada ampliado con un tamaño de poro, es de interés para examinar si este era capaz de conformación de la conducción de iones. En lugar de realizar un ion-tirando de simulación [40, 41], nos llevó a cabo de 6 ns MD simulación a partir del final conformer de la DTM de simulación. Presumiblemente, un poro abierto se llenará con las moléculas de agua con el fin de llevar a cabo los iones, como el poro de luz se debe principalmente rayado con hidrofóbicas residuos [25, 42]; de otro modo un hecho aislado de iones de sodio entrar en un vacío de poro hidrofóbico experimentaría una importante barrera energética [ 43]. En la figura 9, el tiempo de evolución de la densidad del agua en los poros durante la simulación de la DTM final conformer se representa junto con el control de la simulación. A principios de simulaciones sugiere que la densidad del agua en los poros puede ser utilizado como un indicador del estado de la conductancia del canal [25, 42]. Uso de 0,65 de la densidad como un umbral de penetración de agua como en Sansom et al. [42] reveló que el canal no conductor sigue siendo para la mayoría de la simulación de control. Pero en la simulación de la DTM conformer final, debido al aumento del tamaño de poro, la densidad del agua en los poros aumentado considerablemente en comparación con la que figura en la simulación de control. Aunque el canal parece alcanzar el estado de conducción al inicio de la DTM simulación, la densidad del agua descendió por debajo de 0,65 de la densidad mayor parte del tiempo después de ~ 2 ns de simulación. Esto indica que la DTM conformer final puede ser que no sea representante de un estado completamente abierto a pesar de que el poro se ha ampliado de ~ 1 Å.

La iso-superficies de tiempo-un promedio de densidad del agua tanto desde el control de la simulación y la simulación de la DTM final conformer se muestran en la Figura 10. De acuerdo con la densidad de perfiles en la figura 9, la simulación con la DTM conformer final dio lugar a una mayor ocupación de agua que en los controles de simulación. Por otra parte, la densidad de volumen de agua ha demostrado claramente la constricción de paso de agua cerca de Val252 (posición 13 '), en ambas simulaciones. Sin embargo, una mayor inspección de las trayectorias reveló que la cadena lateral orientaciones, así como la columna vertebral de conformaciones Val252 eran diferentes en las dos simulaciones (Figura 10]. La hidratación simulaciones, por lo tanto, sugieren que la primera constricción a Leu248 y Val252 ha sido parcialmente eliminado, pero que aún más conformacionales reordenamientos de la membrana de la serie de sesiones que abarca puedan ser necesarios para la conducción de iones. Debido a limitaciones de escala de tiempo, por ejemplo, los cambios estructurales no se observaron dentro de los 4 ns de nuestra simulación de TTM.

La diferencia en la hidratación de los dos sistemas puede ser provisional. Anterior simulaciones sobre un sistema simplificado nanopore demostrado que la carga iónica y el desequilibrio potencial a través de la membrana puede inducir agua de permeación de un poro hidrofóbico [43]. Desde esta perspectiva, más estudios computacionales que emplean a más realista las condiciones (es decir, con un adecuado potencial de membrana) puede ser necesaria para la identificación de los diferentes estados de hidratación de la canal.

El actual TTM simulación de obligado C-bucle de cierre se destaca una secuencia de cambios estructurales que se traducen en una mayor poro, y pueden ser de relevancia para la comprensión de cómo agonista es vinculante, junto a canal gating. Como se ilustra en la Figura 11, C-bucle de cierre inducido al alza y un movimiento hacia el exterior de la parte inferior del capítulo β10, que posteriormente fue transmitido a la M2-M3 enlazador a través del fuerte acoplamiento entre Arg206 y Glu45. Los resultados de nuestra simulación de residuos destacar dos pares, uno situado cerca del ligando vinculante de bolsillo (residuos: Lys145 y Tyr188), la otra ubicada hacia la parte inferior del ligando vinculante de dominio (residuos: Arg206 y Glu45), como potencialmente importante para el acoplamiento agonista vinculante para gating. Dentro de nuestra TTM 4 ns simulación, el aumento de tamaño de poro de 1,9 Å ~ a ~ 3,0 Å, con la obstrucción inicial hidrofóbicas retirado en gran parte a Leu248 y Val252 (posiciones 9 'y 13'). El M2 dominios de subunidades A y D se observaron a someterse a un ~ 7 ° de rotación en sentido horario, debido probablemente a la par que ejercen en sus extremos extracelular de la β1-β2 bucles. En general, los movimientos observados, como agonista inducida por el colapso de la carretera C-loop durante el sitio de unión, la rotación de M2, conformacionales y reordenamientos transmite a través de β10 al dominio transmembrana, son consistentes con anteriores estudios computacionales del receptor [27, 44, 45]. Juntos, estos estudios sugieren fuertemente que la rotación en lugar de una simple inclinación o kinking de M2 podría mediar en el mecanismo de gating. Por último, nuestros cálculos indican también que los movimientos gating resultado sólo de pequeños reajustes estructurales en el ligando vinculante de dominio, lo que implica que la transición entre el cerrado y abierto los estados es muy alto rendimiento energético, y puede ser fácilmente modulada por la unión y unbinding de agonista moléculas.

Dos modelos de homología del ser humano receptor α7 se construyeron con Modeller versión 8,0 [46, 47]. El primer modelo, que fue utilizado como la estructura a partir de los TTM y el control de simulación, se basa en los últimos 4,0 Å de resolución Cryo-EM estructura del Torpedo nAChR [29]. El segundo modelo, que tenía como objetivo la estructura de la DTM en la simulación, se construyó mediante la combinación de los rayos X la estructura de AChBP [8] de Lymnaea stagnalis y el Cryo-EM estructura del Torpedo nAChR. Detalles de la modelación procedimiento empleado para la construcción del primer modelo se han descrito anteriormente [45]. En resumen, el modelo que figura la estructura 1835 que comprende los residuos ligando vinculante y dominios transmembrana, así como parte del dominio citoplásmico vestíbulo entre M3 y M4. Cinco veces la simetría no se impone cuando el modelado pentamer estructura. In the first model, the C-loops in two alternating subunits had the open conformation, according to the conformations of the two α subunits of the Torpedo structure, while the remaining three subunits were in the more contracted C-loop conformation based on the conformations of the βγδ subunits.

Construction of the second model (target structure) involved two steps. First, a homology model of the human α7 ligand-binding domain was built from the AChBP structure with carbamylcholine bound [ 8 ]. Then the full receptor was modeled by simultaneously using the newly built ligand-binding domain and the Torpedo receptor structures [ 29 ] as templates. Since the ligand-binding domain template already had the same sequence as that of the target, the corresponding coordinates were directly transferred to the final model. Accordingly, the C-loops in all five subunits were in the closed conformation as seen in the 1UV6 crystallographic structure. As a result of this two-step procedure, the two templates were joined by implicitly satisfying the geometry constraints, thereby avoiding any errors from manually overlaying the two domains. All the obtained models were evaluated with PROCHECK [ 48 ] and Prosa 2003 [ 49 ]. The resulting model with the lowest Modeller target function compared favorably with the template 2BG9 structure in terms of both PROCHECK scores (93%) and PROSA energies (−0.6); the quality of the ligand-binding domain was slightly better than that of the transmembrane domain.

The control MD simulations were performed with the nAChR models embedded in a fully hydrated, 120 Å × 120 Å palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol-phosphatidylcholine (POPC) bilayer. This resulted in a total of ~290 POPC molecules and ~60600 TIP3P water molecules. Charge neutralization was accomplished with the addition of 86 Na ⁺ and 26 Cl ⁻ ions, resulting in a 0.1-M solution. The solvated system then underwent four equilibration steps: (i) 2000 steps of minimization with a fixed protein backbone, (ii) five cycles of a 500-step minimization with decreasing positional restraints on the protein C ^α atoms, (iii) gradual temperature increase from 50 K to 310 K in 10000 steps of constant-volume MD simulation with harmonic restraints (with a force constant of 3 kcal·mol ⁻¹ ·Å ⁻² ) on the protein C ^α atoms, and (iv) 2-ns extensive equilibration with decreasing positional restraints on the C ^α atoms.

MD simulations were also performed on two truncated transmembrane systems. The first corresponded to the transmembrane domain abstracted from the first homology model just described. Simulation on this system was intended to clarify the possible steric effect of β10 and the β1–β2 linker on pore opening. The second system was composed of the transmembrane domain abstracted from the final conformer of the TMD simulation. This system represents a partly “open” channel. Both simulations were performed with the proteins embedded in a fully hydrated, 120 Å × 120 Å POPC bilayer at 0.1 M ionic concentration. Nonrestrained production runs followed the aforementioned equilibration procedure.

All MD simulations were performed in the constant surface area ensemble with the NAMD2 program [ 50 ] and the CHARMM27 force field [ 51 ]. A short-range cutoff of 9 Å was used for nonbonded interactions, and long-range electrostatic interactions were treated with the Particle Mesh Ewald method [ 52 ]. Langevin dynamics and a Langevin piston were used to maintain the temperature at 310K and a pressure of 1 atm. All of the MD runs were conducted on DataStar, an IBM tera-scale machine at the San Diego Supercomputer Center.

The TMD simulation included an additional energy term based on the RMSD of the C-loop residues during the simulation relative to a prescribed target structure. The energy term had the form: V = ½ ∗ k ∗ ( RMSD (t)− RMSD ₀ (t)) ² , where the force constant, k, was 20 kcal·mol ⁻¹ ·Å ⁻² . RMSD ( t ) was the RMSD of the simulation structure at time t relative to the prescribed target structure, and RMSD ₀ (t) was the prescribed target RMSD value at time t . As described above, the target conformation, toward which the C-loop was forced to move, was essentially a homology model based on the Cryo-EM structure of the Torpedo receptor, but with all the C-loops replaced with those in the closed conformation as seen in agonist-bound AChBP. During the simulation, the TMD forces were applied to the backbone atoms of the C-loop residues (Arg186 to Glu193). The value of RMSD ₀ (t) was linearly decreased from 4.3 Å to 0 Å within the first 2 ns and then kept at 0 Å during the rest of the 2-ns TMD simulation. To prevent rotation of the entire molecule, the center of mass and orientation of the protein were fixed.

Taking the NZ–OH distance as the reaction coordinate, the PMF for the Lys145 and Tyr188 interaction was calculated using an umbrella sampling method [ 53 ]. The simulation was performed on a dimer of the ligand-binding domain, immersed in a 50 Å × 80 Å × 80 Å water box. To allow sufficient sampling, the full range of NZ–OH distances from 2.5 Å to 6.0 Å was divided into eight windows with 0.5-Å intervals. At each window, a harmonic bias potential with a force constant of 20 kcal·mol ⁻¹ ·Å ⁻² was applied. Each simulation consisted of a 50-ps equilibration and 100-ps production time. Finally, the results from all windows were combined by using the weighted histogram analysis method [ 54 ]. A similar procedure was used to determine the strength of interaction between Arg206 and Glu45. However, two distances, NH1-OE1 and NH2-OE2, were used as the reaction coordinates for the two constrained backbone conformations, with one corresponding to the starting structure (the first homology model) and the other corresponding to the final conformer from the TMD simulation. Simulations were also performed on a truncated system: a single subunit from the full pentameric receptor with both ligand-binding and transmembrane domains embedded in a 50 Å × 50 Å POPC bilayer, then solvated with a 50 Å × 50 Å × 120 Å water box . To further reduce the computational cost, the NH1-OE1 distance was only varied between 2.5 Å and 3.5 Å, while the NH2–OE2 distance was allowed to sample the full range from 2.5 Å to 6.0 Å. We assumed that NH1 and OE1 always engaged in hydrogen bonding if only one hydrogen bond was possible ( Figure 4 A and 4 B).

Pore radius profiles were determined with the program HOLE [ 55 ]. The tilt angle of M2 was defined as the angle between the principal axis of M2 and the membrane normal ( Figure 12 A). Prior to calculating helix rotational angles, the pore domain was aligned with the z -axis and the coordinates projected onto the xy plane. The rotation around the channel axis was measured as the angle formed by three centers of mass: the center of M2 for the current structure, the center of the pore, and the center of M2 for the reference structure ( Figure 12 B). The self-rotation of individual residues was defined as the angle formed by the C ^α atom of the current structure, the center of M2, and the corresponding C ^α atom in the reference structure ( Figure 12 C). All figures were prepared with the program VMD [ 56 ].