Journal of Translational Medicine, 2006; 4: 33-33 (más artículos en esta revista)

Asequible citometría de flujo para el recuento absoluto de CD4 + T-linfocitos para identificar el subtipo C del VIH-1 adultos infectados que requieren terapia antirretroviral (TAR) y la supervisión de respuesta al TAR en un recurso limitado en el establecimiento

BioMed Central
Lynn S Zijenah (LZIJENAH@HEALTHNET.ZW) [1], Gerard Kadzirange (gkadzirange@zappuz.co.zw) [2], Simon Madzime (smadzime@healthnet.zw) [3], Margaret borok (mborok@medsch.uz . ac.zw) [4], Chiedza Mudiwa (cmudiwa@yahoo.com) [1], Ocean Tobaiwa (otobaiwa@yahoo.com) [1], María Mucheche (mucheche@yahoo.com) [5], Simbarashe Rusakaniko (srusakaniko@medsch.uz.ac.zw) [6], David Katzenstein A (davidkk@stanford.edu) [7]
[1] Departamento de Inmunología, Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Zimbabwe, Harare, Zimbabwe
[2] Chitungwiza Hospital Central, Chitungwiza, Zimbabue
[3] Departamento de Obstetricia y Ginecología de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Zimbabwe, Harare, Zimbabwe
[4] Departamento de Medicina, Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Zimbabwe, Harare, Zimbabwe
[5] Zimbabue Proyecto de Prevención de SIDA, Harare, Zimbabwe
[6] Departamento de Medicina Comunitaria de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Zimbabwe, Harare, Zimbabwe
[7] División de Enfermedades Infecciosas y SIDA Investigación, Universidad de Stanford Medical School, Stanford, California, EE.UU.

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Resumen
Fondo

La Organización Mundial de la Salud (OMS) 's "3 × 5 programa" ha estimulado los esfuerzos para colocar 3 millones de personas en terapia de combinación antirretroviral (TAR) para el tratamiento del SIDA en los países con pocos recursos. Paradójicamente, el costo de CD4 + T-linfocitos esencial para la toma de decisiones para iniciar los adultos VIH positivos en tratamiento antirretroviral, así como para el seguimiento de las respuestas a las ART sigue siendo inaccesible en la mayoría de los países con pocos recursos. Por lo tanto, de bajo costo métodos para enumerar CD4 + T-linfocitos se necesitan con urgencia.

Objetivo

Para evaluar Cyflow citometría (Cyflow SL, Partec, Münster, Alemania) para la enumeración de absoluta CD4 + T-linfocitos en el subtipo C del VIH-1 seropositivos temas utilizando FACSCount (Becton Dickinson y, Immunocytometry Systems, San Jose, CA, EE.UU.) como la "predicado método".

Métodos

Un total de 150 del VIH-1 seropositivos temas se incluyeron en el ejercicio de evaluación. Cincuenta y ocho especímenes fueron recogidos de embarazadas VIH-1 en las mujeres seropositivas (subtipo C estudio de la resistencia a los fármacos). Veinte y siete especímenes fueron recogidos de las mujeres y sus cónyuges con el SIDA en seguidas Duke ART estudio para evaluar la respuesta inmunológica y virológica respuestas a las ART genérico, que comprende Stavudine, Lamivudine y Nevirapine (Stalanev, Varichem Labs, Harare, Zimbabwe). Sesenta y cinco especímenes fueron recolectados de pacientes con SIDA matriculados en un curso Sarcoma de Kaposi (KS) estudio para investigar el impacto de ART en la progresión de KS. Enumeración de CD4 + T-linfocitos utilizando FACSCount se llevó a cabo rutinariamente para todos los tres estudios. El Consejo de Investigación Médica de Zimbabwe y la Autoridad de Control de Medicamentos de Zimbabwe aprobó los estudios. Toda la sangre se recogió en tubos vacutainer con EDTA y aliquoted en dos tubos (200 μ l en cada una). CD4 + T-linfocitos se enumeran los cargos mediante un Cyflow contrarrestar, en el Departamento de Inmunología y una FACSCount en el Departamento de Obstetricia y Ginecología en las 6 horas de flebotomía según las instrucciones del fabricante.

Resultados

Usando análisis de regresión lineal, hubo una fuerte correlación (r = 0,991) entre el total CD4 + T-linfocitos cuenta obtenidos por FACSCount y los obtenidos por Cyflow. Cuando los datos de análisis se estratificó por grupos de estudio, hubo una fuerte correlación entre la FACSCount y Cyflow CD4 + T-linfocitos de los sujetos que cuenta en los tres estudios independientes; Subtipo C resistencia (R 2 = 0,987), Duke ART (R 2 = 0,980 ) Y SK (R 2 = 0,994), Cuadro 1.

El uso de Bland y Altman parcelas, el general, absoluta linfocitos T CD4 + obtenidos por los dos métodos se encuentran en excelente acuerdo (diferencia media 1,21, 95% intervalo de confianza (CI): -2,1 a 3,3). Por el 0-250 CD4 + T-linfocitos gama, el recuento de células CD4 obtenidos mediante FACSCount también se encuentran en buen acuerdo con los resultados obtenidos utilizando Cyflow contra (diferencia media = 2,6 células / μ l, IC 95%: -1,1 a 6,3). Del mismo modo, en el 251-500 (diferencia media 1,0, las células / μ l, IC 95%: -3,7 a 5,6) y el 501-1200 (diferencia media = 0,29 células / μ l, IC 95%: -8,1 a 8,7) T CD4 - linfocitos gama, el buen acuerdo se observó.

Conclusión

El contador Cyflow es tan exacta como la FACSCount absoluta en la enumeración de CD4 + T-linfocitos en el rango 1-1200 células / μ l. Cyflow citometría es relativamente asequible, fácil de usar tecnología que es útil no sólo en la identificación de los individuos VIH seropositivos que requieren tratamiento antirretroviral, sino también para el seguimiento de las respuestas inmunológicas al TAR.

Fondo

La Organización Mundial de la Salud (OMS) "3 × 5 programa" ha estimulado los esfuerzos para colocar 3 millones de personas en terapia de combinación antirretroviral (TAR) para el tratamiento del SIDA en los países con pocos recursos [1, 2]. Esto ha sido posible por la reducción en el precio de los ARV de propiedad y la introducción de versiones genéricas de estos medicamentos. Paradójicamente, el costo de CD4 + T-linfocitos esencial para la toma de decisiones para iniciar tratamiento antirretroviral para los adultos VIH positivos y vigilar las respuestas a las ART sigue siendo inaccesible en la mayoría de los países con pocos recursos. Aunque, algunos los países con pocos recursos que no pueden acceder a precios asequibles CD4 + T-linfocitos enumeración podrá utilizar criterios clínicos de conformidad con las recomendaciones de la OMS para el comienzo de VIH en personas seropositivas ARTE [3], CD4 + T-linfocitos sigue siendo una medida importante de la respuesta inmune Y proporcionar criterios de laboratorio para detener el cotrimoxazol profiláctico.

Laboratorio basado en las recomendaciones de la OMS para la toma de decisiones a comenzar de adultos infectados por el VIH en los individuos ART se basa en gran medida en absoluto CD4 + T-linfocitos cuenta. Citometría de flujo es el estándar de oro y precisa y automatizada de mediciones absoluto de linfocitos T-subconjunto perfiles. Técnicas de citometría de flujo no sólo son caros, pero requieren equipos sofisticados y reactivos, así como personal altamente calificado. Por otra parte, en los países con pocos recursos un fácil acceso a soporte técnico y programas de garantía de calidad para citometría de flujo a menudo no están fácilmente disponibles. No métodos de citometría de flujo para el recuento absoluto de CD4 + T-linfocitos, como el manual de bolas magneticas Dynabead técnica también han sido evaluadas [4, 5], pero también se consideran caros, con mano de obra intensiva y sólo puede acomodar muestra bajo rendimiento [6].

Clínica actual de citometría de flujo métodos de uso, ya sea doble o simple enumeración de las plataformas de absoluta T-subpoblaciones linfocitarias. Dual plataformas se basan en una combinación de porcentajes de citometría de flujo y los glóbulos blancos (WBC) obtenidos a partir de analizadores hematológicos para obtener los números absolutos de linfocitos T. Por otra parte, la única plataforma citómetros se dedican citómetros de flujo directo con absoluta facilidad el recuento. Estudios anteriores han demostrado que la doble plataformas tienen una mayor entre laboratorios por ciento del coeficiente de variación (CV%) de absoluta CD4 + T-linfocitos en comparación con las plataformas único [7]. Cuanto mayor sea CV% se atribuyó a la utilización de diferentes analizadores hematológicos, sin garantía externa de la calidad y control de calidad interno para WBC utilizados en plataformas dual [8] y las referencias en él.] Plataforma única citómetros de flujo puede permitir el desarrollo eficaz y exacta enumeración de T - subpoblaciones linfocitarias en entornos clínicos donde grandes numbersof pacientes están recibiendo la atención [9].

Recientemente, grandes avances se han hecho en el desarrollo fácil de usar asequibles única plataforma de citometría de flujo métodos para enumerar absoluta CD4 + T-linfocitos. Por ejemplo, Janossy y colegas presentó primaria CD4 gating en citometría de flujo volumétrico de absoluta CD4 + T-linfocitos cuenta sin microbolas o hematología [10]. Sin embargo, este método fue desarrollado a través del "estado del arte" citómetros de flujo (Ortho Cytoron y FACSCalibur), con la consiguiente capacidad y los costos.

Recientemente, un número creciente de punto de atención menos costosos métodos para medir absoluta CD4 + T-linfocitos cuenta se han desarrollado. Estos incluyen el desarrollo y la evaluación de la plataforma única de citometría de flujo utilizando métodos de bajo costo citómetro de flujo que puede ser alimentada desde una batería de auto o de paneles solares (Cyflow SL, Partec, Münster, Alemania) de Cassens y colegas [11, 12] , La modificación de un comercialmente disponibles 4-parámetro citómetro de flujo, Luminex 100 (Luminex, Austin, Texas, EE.UU.) para un pacto prototipo de instrumento portátil que puede funcionar con 12 voltios batería recargable [13] y del sistema ACC Guayaba (Guayaba Technologies, Hayward , CA, EE.UU.).

El objetivo del presente estudio fue evaluar sola plataforma Cyflow citometría (Cyflow SL, Partec, Münster, Alemania) para la enumeración de absoluta CD4 + T-linfocitos entre el subtipo C del VIH-1 seropositivos temas utilizando única plataforma FACSCount (Becton Dickinson y, Immunocytometry Sistemas, San Jose, CA, EE.UU.) como el método predicado.

Métodos

Un total de 150 del VIH-1 seropositivos temas se incluyeron en el ejercicio de evaluación. Cincuenta y ocho especímenes fueron recogidos de embarazadas VIH-1 en las mujeres seropositivas (subtipo C estudio de la resistencia a los fármacos). Veinte y siete especímenes fueron recogidos de las mujeres y sus cónyuges con el SIDA en seguidas un estudio para evaluar la respuesta inmunológica y virológica a las respuestas genéricas ART (Stalanev, Varichem Labs, Harare, Zimbabwe) que comprende Stavudine, Lamivudine y Nevirapine. Sesenta y cinco especímenes fueron recolectados de pacientes con SIDA matriculados en un curso Sarcoma de Kaposi (KS) estudio para investigar el impacto de ART en la progresión de KS. Enumeración de CD4 + T-linfocitos utilizando FACSCount se llevó a cabo rutinariamente para todos los tres estudios. En la actual evaluación de la Cyflow contra, la FACS contador utilizado es así como el "método predicado". El Consejo de Investigación Médica de Zimbabwe y la Autoridad de Control de Medicamentos de Zimbabwe aprobó los estudios.

Toda la sangre se recogió en tubos vacutainer con EDTA (Becton-Dickinson, Mt View, California) y aliquoted en dos tubos (200 μ l en cada una). Un tubo se envió al Departamento de Inmunología y el segundo para el Departamento de Obstetricia y Ginecología de la enumeración de CD4 + T-linfocitos Cyflow utilizando un contador y un FACSCount, respectivamente, en las 6 horas de flebotomía según las instrucciones del fabricante. Los dos médicos independientes de laboratorio los científicos en los dos departamentos que llevó a cabo la enumeración de los CD4 + T-linfocitos fueron cegados a los demás resultados.

Cyflow reactivos y consumibles se han utilizado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. En resumen, 20 μ l de sangre todo el EDTA se pipeta Partec en un tubo de ensayo. Diez microlitros de CD4-phycoeryrthrin anticuerpo monoclonal conjugado con suministrados por Partec se añadió al tubo que contiene toda la sangre y los reactivos se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, 800 μ l de buffer no lyse, facilitados por Partec se añadieron al tubo y suavemente vórtice-mixta. El tubo fue conectado a la Cyflow contador automático para contar. El histograma y absoluta cuenta se muestran y se imprimen automáticamente. El histograma muestra conteo directo resultado en términos absolutos de CD4 + T-linfocitos / μ l. El CD4 + T-linfocitos con alta fluorescencia aparecen en un lugar destacado en el pico derecho del histograma, mientras que los más débiles, sino también monocitos CD4 + aparecen a la izquierda sin ningún tipo de solapamiento con CD4 + T-linfocitos.

Por FACSCount análisis, 50 μ l de sangre todo el EDTA se añadió a los CD4 FACSCount reactivo tubo que contiene anti-CD3 y CD4 anti-anticuerpos monoclonales, diluyente de muestra y referencia bolas. Las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente durante 60 minutos y posteriormente se ejecutan en el FACSCount.

El análisis estadístico

Coeficiente de correlación y análisis de regresión lineal se utilizaron para comparar los resultados obtenidos por FACSCount y Cyflow. CD4 + T-linfocitos cuenta obtenidos por FACSCount se dibujan en el eje X contra los cargos obtenidos por Cyflow situado en el eje de ordenadas. Bland y Altman parcelas [14] se utilizaron para poner a prueba el acuerdo entre los dos métodos de representar la media de los valores obtenidos por los dos métodos en el eje de abscisas y la diferencia entre los dos métodos en el eje. La diferencia de medias entre los dos métodos (sesgo) y su 95% intervalo de confianza, y los límites de acuerdo, que se define como sesgo de ± 2 desviación estándar se calcularon. Sub-análisis de los datos también se realiza por separado para los tres estudios independientes de que los sujetos fueron reclutados. El análisis de los datos también fue estratificado de acuerdo con el rango (0-250, 251-500 y 501-1200 células / μ l), de absoluta CD4 + T-linfocitos cuenta para determinar cualquier rango que dependen de las diferencias entre los dos métodos.

Resultados

Un total de 150 muestras de pacientes VIH seropositivos con CD4 + T-linfocitos los cargos que van desde 1 a 1200 células / μ l fueron evaluados. La media general de CD4 + T-linfocitos de la cohorte utilizando la FACSCount fue 371 células / μ l (rango intercuartil (IQR: 240-513), mientras que la de contrarrestar Cyflow fue 362 células / μ l (IQR: 244-530).

Regresión lineal parcela de absoluta CD4 + T-linfocitos obtenidos por Cyflow y FACSCount se muestra en la Figura 1. Análisis de correlación absoluta de CD4 + T-linfocitos obtenidos por los dos métodos se muestra en la Tabla 1. Hubo una fuerte correlación (r = 0,995, R 2 = 0,991) entre el total CD4 + T-linfocitos cuenta obtenidos por FACSCount y la obtenida por Cyflow contador (Cuadro 1].

Cuando los datos de análisis se estratificó por grupos de estudio, hubo una fuerte correlación entre la FACSCount y Cyflow contrarrestar CD4 + T-linfocitos de los sujetos que cuenta en los tres estudios independientes; Subtipo C resistencia (R = 0,993, R 2 = 0,987), Duke ARTE (R = 0,990, R 2 = 0,980) y SK (R = 0,997, R 2 = 0,994), Cuadro 1. Del mismo modo correlaciones fuertes se observaron cuando el análisis de los datos se estratificó por CD4 + T-linfocitos gama; 0-250 (R = 0,983, R 2 = 0,966), 251-500 (R = 0,948, R 2 = 0,898) y 501-1200 ( R = 0,984, R 2 = 0,968) células / μ l.

La Figura 2 muestra el de Bland y Altman parcela comparar CD4 + T-linfocitos obtenidos por Cyflow y FACSCount. En general, absoluta linfocitos T CD4 + obtenidos por los dos métodos se encuentran en excelente acuerdo (diferencia media = 1,21, 95% intervalo de confianza (IC: -2,1 a 4,5). Por el 0-250 CD4 + T-linfocitos gama, el CD4 los cargos obtenidos mediante FACSCount también se encuentran en buen acuerdo con los resultados obtenidos utilizando Cyflow contra (diferencia media = 2,6 células / μ l, IC 95%: -1,1 a 6,3), Cuadro 2. Del mismo modo, en el 251-500 (diferencia media = 0,96, células / μ l, IC 95%: -3,7 a 5,6) y el 501-1200 (diferencia media = -0,29, células / μ l, IC 95%: -8,1 a 8,7) CD4 + T-linfocitos tiempo, buen acuerdo se observó ( Cuadro 2].

La OMS recomienda que los adultos VIH seropositivos con CD4 + T-linfocitos ≤ 200 células / μ l debería comenzar a ARTE [3], por lo tanto, evaluó la exactitud de la Cyflow contador en la identificación de estas personas. El Cyflow contrarrestar concordantly identificado todos menos uno de los temas tratados (26/27), con CD4 + T-linfocitos cuenta de ≤ 200 células / μ l según lo determinado por FACSCount. El CD4 + T-linfocitos cuenta para el tema con resultados discordantes fueron 210 y 199 células / μ l de FACSCount y Cyflow respectivamente.

Discusión

ARV se han convertido en cada vez más disponibles en los países con pocos recursos en los últimos años, principalmente debido a reducciones drásticas en los precios de las especialidades y medicamentos genéricos. Sin embargo, el costo de enumerar absoluta CD4 + T-linfocitos necesarios para la toma de decisiones para iniciar los individuos infectados por el VIH en tratamiento antirretroviral y el seguimiento a las respuestas ART sigue siendo inasequibles para la mayoría de los países con pocos recursos. Recientemente, el desarrollo de tecnologías asequibles para la práctica enumeración absoluta de CD4 + T-linfocitos pueden desempeñar un papel fundamental en la toma de ART a disposición de todos aquellos que lo necesitan en los países en desarrollo.

En el presente estudio, hemos demostrado que la única plataforma Partec Cyflow contador puede identificar con precisión los sujetos VIH seropositivos con menos de 200 células CD4, que son elegibles para ART, y por el contrario, aquellos con> 200 células CD4 que no podrá exigir continuación Co - trimoxazole profilaxis. Por otra parte, también hemos demostrado que Partec Cyflow puede contrarrestar con precisión CD4 + T-linfocitos cuenta para los pacientes que están en tratamiento antirretroviral.

Nuestros resultados están de acuerdo con lo informado de un reciente multicéntrico de evaluación de ocho hospitales en Europa, África y Asia [12], así como las evaluaciones independientes en varios otros los países con pocos recursos que han evaluado Partec Cyflow para contrarrestar enumeración absoluta de CD4 + T cuenta de linfocitos-aunque utilizando diferentes versiones de Cyflow contador. En Senegal, donde los subtipos A y D del VIH-1, registrando una excelente correlación fue observada cuando Partec Cyflow SL azul (dotado con 3 fluorescencia y 2 detectores de dispersión de luz) se comparó con FACScan y FACSCount [15]. En otro país de África occidental, Nigeria, con similares co-epidemias, la Cyflow técnica se informó a ser más precisa y coste-efectiva que el método Dynabead [6]. Un estudio realizado en Malawi, donde predomina el subtipo C, evaluación de campo de Cyflow informó de un coeficiente de correlación de 0,92 (95% CI 0,89-0,95) en comparación con FACSCount tecnólogos formados con la búsqueda de contrarrestar Cyflow procedimientos sencillos de ejecutar el instrumento y fácil de manipular [16 ]. Una buena correlación entre CD4 + T-linfocitos cuenta obtenidos por Cyflow y FACSCount se ha observado también en Tailandia, donde los subtipos B del VIH-1 y predomina FCI AE_01 [17]. Lo que es más importante, cuando se comparan dos métodos de medición clínica, en todos estos estudios, de Bland y Altman parcelas mostraron buen acuerdo entre Cyflow y el "método predicado".

Existe una urgente necesidad de desarrollar, evaluar e implementar más asequibles y fáciles de utilizar la tecnología para enumerar CD4 + T-linfocitos cuenta para iniciar los pacientes en tratamiento antirretroviral, así como para el seguimiento de las respuestas inmunológicas a ART para hacer arte a disposición de todos aquellos que lo necesitan , Sobre todo en los países con pocos recursos.

Actualmente, en Zimbabwe, el costo de CD4 + T-linfocitos EE.UU. es $ 56. Este costo se revisa al alza trimestral. De acuerdo con el fabricante de Cyflow, CD4 + T-linfocitos usando su máquina y los reactivos deben EE.UU. cuesta sólo $ 2,50 (2 euros). A pesar de que el precio de compra de FACSCount y contrarrestar Cyflow son comparables (dólares de los EE.UU. 30 000-50 000), la FACSCount reactivos son más caros que los de la Cyflow. El contador Cyflow también tiene un alto rendimiento y tantos como 200 ejemplares se puede ejecutar por día, lo que lo hace ideal para su utilización en Zimbabwe, un país con una de las más altas de prevalencia de VIH en todo el mundo.

En conclusión, el contador Cyflow es tan exacta como la FACSCount absoluta en la enumeración de CD4 + T-linfocitos en el rango 1-1200 células / μ l. Cyflow citometría es relativamente asequible, fácil de usar tecnología que es útil no sólo en la identificación de los individuos VIH seropositivos que requieren tratamiento antirretroviral, sino también para el seguimiento de las respuestas inmunológicas al TAR.

Agradecimientos

El apoyo de los Institutos Nacionales de Salud, NIAID R01 AI060399-01 A1 se reconoce y damos las gracias a la investigación enfermeras, consejeros de la comunidad y los temas que en los tres estudios.