Relación con otros nocturna aumento de serotonina y la melatonina aparición de roedores en la glándula pineal

Ritmo circadiano estudios han utilizado las fases de inicio rítmica productos, tales como las actividades del aparato locomotor de roedores de laboratorio [1], la temperatura y la secreción de melatonina [2, 3], como marcadores del reloj circadiano. La fiabilidad y la coherencia de estos marcadores circadiano de salida son esenciales para un análisis preciso marcapasos circadiano a través de múltiples ciclos de los mismos individuos, entre los distintos individuos de la misma cepa de animales, entre las diferentes cepas de la misma especie animal, y entre individuos de diferentes especies [ 4]. Este estudio analiza las características circadiano pineal de 5-HT y la secreción de melatonina en ratas y hámsters arrastrado en virtud de condiciones.

La glándula pineal de todos los animales vertebrados produce melatonina de 5-HT en respuesta a la noradrenalina liberada de la ganglio cervical superior (SCG) [5, 6]. La producción y secreción de 5-HT y la melatonina se rigen por el reloj circadiano situado en el suprachiasmatic núcleos, y son elevados por la noche en ratas [7]. Debido al apretado asociación de la melatonina pineal en libertad con la actividad del reloj, la melatonina ha sido considerado como un marcador exacto de los marcapasos circadiano de ambos animales y humanos ritmo circadiano estudios [8 - 12]. En estudios humanos, por ejemplo, la aparición del calendario de liberación de melatonina por la noche se ha utilizado ampliamente para determinar el ángulo de fase de arrastre marcapasos circadiano [13]. Análisis comparativo de MT-a partir de diferentes individuos se lleva a cabo habitualmente en estudios humanos, que está vinculado a rasgos circadiano como morningness y eveningness [13]. Estos análisis son en gran medida ausente de los estudios en animales para inter-ciclo, entre individuos, entre cepa, y entre las especies diferencias de MT-a. Esto es debido a las dificultades con alta resolución de muestreo y análisis de la melatonina en los pequeños roedores de laboratorio utilizando los métodos convencionales. Estas dificultades son ahora superar con nuestros pineal técnica de microdiálisis, que permite alta resolución de análisis de la secreción de melatonina pineal en cada uno de los animales durante largos períodos de tiempo en tiempo real [2, 3, 7, 14]. Mediante esta técnica, este estudio ha sido diseñado para proporcionar perfiles detallados de 5-HT y la melatonina en libertad bajo condiciones arrastrado en los roedores.

Pineal melatonina se produce durante la noche del 5-HT, que se sintetiza en la glándula pineal y muestra dinámica de los ritmos circadianos tanto la síntesis y la liberación [7]. A diferencia de la melatonina, cuya síntesis en los roedores requiere la activación transcripcional de la enzima clave de serotonina N-acetiltransferasa [15], el aumento nocturno de 5-HT producción y liberación controlada posttranscriptionally en la glándula pineal [7]. Datos anteriores indican que tanto la síntesis y liberación de 5-HT se desencadenan por la noradrenalina liberada de las terminales nerviosas SCG [7]. En comparación con el tiempo de alrededor de 1 h para la producción de melatonina, parece haber un retraso mínimo de 5-HT en libertad cuando noradrenalina es infundido directamente en la glándula pineal a través de tubos de microdiálisis [7, 14]. Estos datos indican que el aumento de 5-HT en libertad en la noche la glándula pineal emisiones el calendario de liberación de noradrenalina la SCG y, por tanto, llegada la oportunidad de reloj circadiano central de señales. Inicio de la producción de melatonina, sin embargo, podría depender de los mecanismos pineal abajo de la 5-HT aumento, que podría variar entre los distintos animales de la misma cepa, ser único para cada cepa de ratas, o sea específico de diferentes especies de animales. En este documento, los perfiles de secreción de 5-HT y su relación con la melatonina se estudian a través de múltiples ciclos circadianos en múltiples animales de la misma cepas, en múltiples outbred así como cepas puras de ratas, y en ambas ratas y hámsters.

Adultos (2-4 meses) los machos de varias cepas de outbred y puras ratas, hámsteres y outbred fueron analizados en este estudio. Sprague Dawley (SD, outbred) ratas, ratas Wistar que son transgénicas para per1-luc construcciones (Wistar, outbred), PVG ratas (puras), Lewis (Lew, puras) ratas, hámsteres y Siria (outbred) fueron utilizados. Los transgénicos son ratas Wistar la amabilidad de siempre y por el doctor Michael Menaker. Todas las ratas, con excepción de la rata Wistar, se compraron de Harlan (Indianapolis, IN), mientras que el sirio hámsters fueron de Charles River Laboratory (Wilmington, MA). Los animales fueron alojados en una temperatura controlada con una cámara de luz y oscuridad (LD) ciclo de 12:12 h (luces a las 6 horas).

Antes de en-línea de análisis de 5-HT y la melatonina, los animales fueron implantados con las sondas de microdiálisis directamente en sus glándulas pineal, tal como se describe [14], y que se les permita recuperarse de 1-3 días. Tras la recuperación, los animales fueron trasladados a la sala de diálisis en sus jaulas individuales. La diálisis es la cámara de temperatura controlada, ventilación, luz y la prueba. La iluminación es suministrada por lámparas fluorescentes de color blanco (250 lux a nivel de jaula).

Protocolos detallados de la implantación quirúrgica de las sondas de microdiálisis pineal, en línea microdiálisis, y análisis automatizado de HPLC fueron tal y como se describe [14]. En pocas palabras, después de la anestesia profunda, la cabeza del animal fue colocado en un instrumento stereotaxic. Una circular del cráneo apertura fue creada utilizando un taladro dental disco, y la glándula pineal fue expuesto por levantar ligeramente la confluencia de los senos sagital superior, junto con la duramadre asunto con un gancho fijado a la stereotaxic marco. La punta de la guía cánula (CMA / MD, N. Chelmsford, MA, EE.UU.), se coloca al lado de uno y otro lado de la pineal antes expuesto el cráneo, fue cerrado con cemento dental. Los animales operados se les permitió recuperar 1-3 días antes de la experimentación.

Pineal microdiálisis se llevó a cabo como sigue. Inmediatamente antes de la toma de muestras, los animales fueron anestesiados con halotano brevemente; el stylet (dummy o sonda) fue sustituida por una sonda de microdiálisis (CMA12, 20 kD de corte, la membrana de 4 mm de longitud) (CMA / MD, N. Chelmsford, MA) y fijo de plástico con pegamento. La sonda de diálisis fue continuamente infundido a través de tubos microbore PEEK (0,65 mm OD, 0,12 mm ID) a un caudal de 2 μ l / min con artificial líquido cefalorraquídeo (LCR; Harvard Holliston, MA). Se tomaron muestras a intervalos de 10 minutos a través de PEEK en un tubo de 20 - μ l bucle de un polen 8 inyector automático (BAS, West Lafayette, IN), que fue en línea con la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La muestra bucle se estableció que deben conservarse en la posición de carga durante los 10 minutos y los ciclos se cambiará automáticamente a la posición de inyección brevemente, después de que el ciclo se repitió. Los animales estaban vinculados con el aparato de diálisis a través de un cuarzo de doble canal giratorio (Instech, Boston, MA) para evitar que el tubo de enredo.

La condición de análisis para la detección simultánea de 5-HT y la melatonina se basa en Drijfhout et al. [16], con ligeras modificaciones. Una bomba de Shimadzu (Shimadzu, Columbia, EE.UU.) se utilizó en combinación con un detector de fluorescencia Shimadzu (FD, de excitación: 280 nm, emisión: 345 nm). Las muestras fueron inyectados en el sistema a través de una válvula de inyección Valco con un controlador de BAS y posteriormente separados en una fase reversa C18 columna (250 × 4,6 mm; Supelco Bellefonte, PA), conjunto a una temperatura constante de 30 ° C utilizando un calentador de Shimadzu columna , Controlado por un sistema de controlador de Shimadzu. La fase móvil consistió en una mezcla de 10 mM de acetato de sodio, ajustada a un pH de 4,5 con ácido acético concentrado, 0,01 mM Na _2-EDTA, 500 mg / l de ácido sulfónico heptano y 22% (v / v) acetonitrilo. El caudal de la bomba HPLC se fijó en 1,5 ml / min durante todo el experimento. Soluciones patrón de la melatonina se utiliza para calibrar el sistema. El control automatizado del sistema de HPLC, la programación de la tasa de flujo, y la manipulación y el almacenamiento de los cromatogramas se llevaron a cabo con un ordenador externo utilizando la Shimadzu Class-VP 5,03 cromatografía de software.

Perfiles de secreción de 5-HT, NAS, y la melatonina son estudiados en una Lew rata para varios ciclos circadianos (Figura 1], utilizando el largo plazo pineal técnica de microdiálisis [14]. Durante cada ciclo, 5-HT secreción incrementó en las primeras la noche, que precede a la aparición de ambos NAS y la melatonina (Figura 1A]. El pico de secreción de 5-HT muestran una disminución gradual durante los 3 primeros días, y se mantuvo estable durante el resto del período de muestreo (3 semanas, los datos no presentados). A pesar de la diferencia en la amplitud de 5-HT, NAS y la secreción de melatonina, sin embargo, el calendario de los tres productos circadiano fue notablemente coherente desde el día a día, cuando se normalizaron a sus niveles máximos nocturnos. No detectable diferencias en la realización de 5HT-a (evaluado en un 80% de los niveles máximos), NAS inicio (20%), y MT-a (20%) sobre el período experimental (Figura 1B]. El mismo cuadro se obtuvo para NAS y compensar la melatonina (fase de descenso), excepto para el primer día de análisis (día 1). Similares datos se obtuvieron a partir de todos los animales analizados (datos no presentados). Cuando los tres productos se normalizaron a sus niveles máximos nocturnos y en comparación lado a lado, a 50 minutos de desfase entre 5HT-y MT-a se encuentra constantemente durante todo el período de muestreo (Figura 1C]. Curiosamente, NAS salida se retrasó unos 20 minutos en comparación con el MT-a.

En contraste con la constante día a día los perfiles de circadiano pineal secretora productos dentro de un mismo animal (Figura 1], grandes entre las diferencias individuales cuando se encontraron múltiples ratas de la misma outbred cepas fueron analizados y comparados (Figura 2]. En esta y todas las cifras, cada perfil circadiano, ya sea de 5-HT o la melatonina era el patrón representante de cada uno de los animales bajo LD (12:12 h) arrastrado condiciones. Seis individual SD ratas fueron analizados para arrastrado perfiles de 5-HT y la secreción de melatonina (Figura 2]. La fecha de inicio de 5-HT osciló entre 25 a 131 minutos, mientras que la de melatonina varía desde 60 a 188 min (Figura 2A]. Outbred ratas Wistar, transgénicos para per1-luc construir [17], también se analizó el contenido de sus perfiles de 5-HT y la secreción de melatonina. A diferencia de las ratas SD, las ratas Wistar muestran retraso en la aparición de ambos de 5-HT (120-387 min) y la melatonina (185-425 min) la secreción. La cepa de características específicas de SD y ratas Wistar se ve claramente cuando los perfiles secretoras de 5-HT y la melatonina se compararon al lado de la otra (Figura 2C]. El intervalo de tiempo entre 5HT-y MT-a, sin embargo, parece que deben mantenerse para cada animal, tanto en SD y ratas Wistar (Figuras 2A y 2B; véase más adelante).

Para descartar la posibilidad de que las diferencias en MT-a se deben a la diferencia de los mecanismos de activación de la melatonina pineal en el, nos estimuló la producción de melatonina utilizando norepinefrina a través de la infusión directa en la pineal a través de tubos de microdiálisis durante el día. Dos ratas SD con diferentes ángulos de fase (intervalos de tiempo entre la oscuridad y la aparición de 5HT y MT-a) se eligieron para este estudio, la melatonina y sus patrones se superponen en la Figura 2D. Mientras que el MT-a entre ID2269 rata y rata ID2263 diferían de 60 min (a la izquierda y el lado derecho del panel), ninguna diferencia en la cinética de activación de farmacológicamente estimulado la producción de melatonina (área sombreada de color azul) se observó entre las dos ratas (Figura 2D] . También hemos infundido noradrenalina en la pineals de 6 adicionales que las ratas expuestas ángulos de fase variable de MT-a través de tubos de microdiálisis. Todas las ratas mostraron la prueba de activación a tiempo para la melatonina idénticas a las que se muestra en la Figura 2D (datos no presentados). Estos datos demuestran que el ángulo de fase en diferencias en MT-SD de ratas no son causadas por las diferencias en la respuesta dentro de la glándula pineal, sino que son controlados por un mecanismo central, en su mayoría de los marcapasos circadiano en el cerebro.

Además de las outbred animales, hemos analizado las puras ratas de PVG y Lew cepas para sus 5-HT y la secreción de melatonina utilizando perfiles en línea pineal microdiálisis. Múltiples ratas (n = 4) de cada cepa pura se analizaron siguientes arrastre en LD 12:12 h, y el arrastrado de 5-HT y la melatonina perfiles de cada rata se muestran como un porcentaje de la máxima por la noche. Como se muestra en la Figura 3A y 3B, los ángulos de fase, tanto en 5HT-y MT-a, ya sea para PVG Lew ratas o ratones son muy coherentes entre los individuos de la misma cepa. Por PVG ratas (Figura 3A], los 5HT-en varió de 38 a 52 min (panel superior), mientras que el MT-entre agrupadas en 42 min a 68 min entre el 4 ratas (panel inferior). Para Lew ratas (Figura 3B], los 5HT-en varió de 130 a 172 min (panel superior), y el MT-en abarcó de 159 a 179 min (panel inferior). Por lo tanto, dentro de cada cepa pura, entre las variaciones individuales de 5HT-y MT-a son relativamente pequeños.

Cuando las dos cepas puras se comparan unas con otras, sin embargo, la cepa de características específicas, de 5-HT y la secreción de melatonina se aparente (Figura 3C]. Ambos 5HT-y MT-en ratas de PVG precedida de que Lew ratas durante 110 minutos en LD12: 12h. Los datos de puras ratas fueron comparados con los de outbred ratas, lo que demuestra que las puras ratas mostraron mucho menor entre las diferencias individuales en los ángulos de fase 5HT-y MT-a (Figura 3D]. La cepa específica de los ángulos de fase 5HT-y MT-a para PVG y Lew ratas representan la extrema tipos de 5HT-y MT-por encontrarse en ratas SD, y son mucho antes que los de la rata Wistar (Figura 3D] .

Al igual que ocurre con las ratas SD en la Figura 2D, tratamos de determinar si el ángulo de fase diferencias de MT-a en la pura y PVG Lew ratas se debe a una diferencia en el reloj central de la actividad o, alternativamente, respuestas diferenciales dentro de la pineal. Si las diferencias se deben a diferencias intrínsecas en la pineal, la estimulación directa de la pineal debería causar diferencias en la secreción de melatonina demoras entre las cepas. Noradrenalina (NE, 20 μ M) fue infundido directamente en las glándulas pineal de dos ratas PVG (ID2293 y ID2297) y dos ratas Lew (ID2287 y ID2291) durante el día (Figura 3E]. Mientras que el MT-a principios de la noche a diferencia de alrededor de 2 h entre las dos cepas (panel izquierdo; Figura 3E], poco se encontraron diferencias cuando se melatonina inducida directamente por la noradrenalina en la infusión de las glándulas pineal de estas ratas (panel derecho; Figura 3E ). Estos datos indican claramente un origen de la diferencia de ángulo de fase entre las dos cepas.

5-HT y los perfiles de secreción de melatonina también se estudió en Siria en hámsters LD 12:12 h condiciones (Figura 4]. 5HT-y MT-en osciló entre 17-109 min min y 251-344, respectivamente (Figura 4A]. Se compararon los patrones de secreción de 5-HT y la melatonina de los hámsters con los de ratas (Figura 4B]. Mientras que el hámster que aparece muy temprano en 5HT-(panel superior) en comparación con las dos SD y ratas Wistar, su MT-a fue mucho retraso. De este modo, el intervalo entre 5HT-y MT-a para hámsters fue de 4 h, mientras que el desfase entre 5HT-y MT-en ratas fue de alrededor de 1 h. Una diferencia de 3 h en MT-a, a raíz de la aparición de 5-HT aumento, existe entre las ratas y hámsters.

La relación de la aparición de 5-HT con la secreción de la aparición de la melatonina de liberación fue analizada para cada uno de los animales descritos más arriba (Figura 5]. Una correlación lineal con r ² de 0,99 se encontró entre el 5-HT y la secreción de melatonina inicio para todos los individuos estudiados (Figura 5]. Por lo tanto, sin tener en cuenta las diferencias individuales dentro de un mismo cepas de ratas, o entre las diferencias de las cepas en ratas, la MT-a se encuentra en una relación fija con el 5HT-en el seno de la misma especie. La relación de 5-HT y aumento de la melatonina inicio, sin embargo, parece ser único para cada especie animal: mientras que el desfase entre 5HT-y MT-fue siempre en alrededor de 1 h (50 min) en ratas, el retraso en hámsters, Sin embargo, fue de 4 h (Figura 5].

El inicio del calendario comportamientos circadianos (sueño-vigilia, la actividad-descanso, la ingesta de alimentos, etc) y eventos fisiológicos diario (pineal 5-HT/NAS/melatonin secreción de cortisol o la liberación de hormona de crecimiento) representa una de las características más importantes de la circadiano marcapasos. A principios de inicio de la secreción de melatonina y el sueño en los seres humanos, por ejemplo, es indicativo de un corto período de reloj circadiano en los individuos con la avanzada fase de reposo síndrome, en comparación con individuos normales [18]. Debido a su apretada asociación con el marcapasos actividades, la melatonina es considerada como la más fiable marcador del marcapasos circadiano, especialmente en estudios circadiano humano [8]. Los últimos desarrollo de los parados de larga pineal técnica de microdiálisis de nuestro laboratorio ha abierto las posibilidades de utilizar hormonas circadiano pineal para marcar el centro de marcapasos en los estudios en animales [2, 3, 7, 14]. Este documento representa el primer análisis detallado de inter-ciclo (de la misma persona), entre individuos, entre cepa, y entre las especies características de pineal 5-HT y la secreción de melatonina en los roedores.

Cuando la actividad secretora pineal fue analizado en ratas la misma a través de múltiples ciclos circadianos, hemos encontrado que la aparición, así como compensar los tiempos de 5-HT, NAS y la secreción de melatonina son idénticos de un ciclo a otro no detectable con la fluctuación diaria. Este notable grado de coherencia sugiere que pacemaking circadiano puede ser una medida más precisa el proceso que anteriormente reconocidos. El controlados con precisión y compensar aparición de la melatonina (5-HT) permite la secreción de detección y análisis en profundidad de pequeños cambios en los ángulos de fase marcapasos circadiano siguientes turnos del ciclo de LD, farmacológicas o perturbaciones.

Los grandes entre las variaciones individuales en 5HT-y MT-a fueron identificados en la outbred SD ratas y hámsters sirios. Al igual que en un estudio anterior [19], entre una gran variación individual-de MT-a también se encontró para ratas Wistar en este estudio. De acuerdo con PVG y Lew ser puras animales, una proporción mucho menor entre la variación individual en 5HT-y MT-a se encontró en las cepas de animales. De este modo, el puras cepas son más adecuados para circadiano estudios que requieren un grupo similar de animales. En cada uno de estos animales, sin embargo, entre las variaciones individuales en MT-en forma directa y fueron invariablemente asociados a las variaciones de 5HT-a, que está controlada por el calendario de noradrenalina en libertad por la noche [7]. Estos resultados apoyan la idea de que el calendario (o ángulo de fase) de MT-en estos animales está controlado por un reloj circadiano a través de la reglamentación del calendario de liberación noradrenalina. Nos proponemos demostrar esta hipótesis de medir directamente la liberación de noradrenalina nuestros futuros estudios.

Además de los entre-las variaciones individuales descritos anteriormente, hemos encontrado la cepa características específicas de 5-HT y la secreción de melatonina. En comparación con las ratas SD, cuyo MT-a variaron entre 60-188 min, la rata Wistar mostró MT-a de 185-425 min. Por lo tanto, el SD ratas poseen ángulos de fase avanzada de MT-en comparación con las ratas Wistar. Del mismo modo, PVG ratas pantalla inicio más temprano de 5-HT y la melatonina en comparación con las ratas Lew. Es importante destacar que, sin embargo, el intervalo entre 5HT-y MT-a se mantuvo constante en cada persona de la misma cepa, y en cada cepa de ratas. Estos resultados sugieren que tanto en 5HT-MT-o en forma intercambiable puede servir como un marcador fiable del reloj circadiano cuando diferentes personas de la misma cepa o cepas diferentes de la misma especie de ratas se comparan.

En contraste con el 1 h tiempo que transcurre entre 5HT-y MT-a en ratas, a 4 h de retraso MT-a partir de la aparición de 5-HT en libertad se encontró en hámsters. La relativamente tardía MT-a de hámsters es posiblemente debido a un retraso en la activación de serotonina N-acetiltransferasa [20], la enzima clave en la síntesis de melatonina [5, 21]. En comparación con ratas, sin embargo, los hámsters que aparece relativamente pronto inicio de la 5-HT aumento. De este modo, el intervalo entre 5HT-y MT-a es probable que sea único para cada una de las especies.

El ángulo de fase arrastrado se piensa que es una función de la diferencia entre el período medio ambiente y el período circadiano [1, 22]. Cuanto más pequeño es el período, el anterior el ángulo de fase se convierte en. En seres humanos con un 3,5 h avanzadas aparición de la melatonina y el sueño [18], se constató que el circadiano período fue 23,3 h, que es alrededor de 1 h más corto que el período medio de seres humanos [23] con una fase normal de MT - a. Circadiano período de la SD ratas (24.05-24.13 h) [24] es conocido por ser más corto que el de las ratas Wistar (24,43 h) [25], al comienzo del aparato locomotor se estudió. Nuestro propio análisis de la SD ratas, usando MT-como en un marcador, ha demostrado el valor del período 24.07-24.22 h [3]. En consonancia con estos datos anteriores, la MT-en la SD de ratas era más avanzada que la de la rata Wistar en el presente documento. Del mismo modo, los 5HT-on es también anteriormente en ratas SD que en ratas Wistar. Estos resultados sugieren que cuando los animales de la misma especie se comparan, ya sea en 5HT-o MT-a puede ser usado como referencia fiable marcador del marcapasos. Cuando los animales de diferentes especies se comparan, sin embargo, nuestros datos sugieren que la MT-a no puede servir como inter-especies marcador de referencia, como los mecanismos que regulan la síntesis de melatonina difieren entre las distintas especies [21]. Estudios anteriores han determinado el período circadiano de hámsters sirios a ser más corto que el de las ratas, en o muy cerca de las 24 h [1]. Para ser coherente con el período de datos de las ratas, por lo tanto, el ángulo de fase arrastrado de un marcador circadiano en hámsters debería ser más avanzado que el de las ratas. La fase de inicio de 5-HT parece ser singularmente útil para este propósito, ya que su aparición era el momento anterior a los de ratas en nuestros estudios.

A diferencia de temperatura del aparato locomotor y ritmos, que muestran grandes diferencias entre diurnos y nocturnos animales [26], la melatonina es secretada en mayor abundancia en la noche en todos los animales vertebrados. Esta característica, combinada con el hecho de que la secreción de melatonina está estrechamente vinculada a las actividades centrales de reloj [27], hace que la melatonina un atractivo adicional marcador de modelos animales de ritmo circadiano estudios [8]. Utilizando la técnica de microdiálisis pineal, hemos encontrado que tanto NAS y 5-HT de la glándula pineal, además de melatonina, pueden servir como marcadores útiles para el análisis de marcapasos. Los resultados de este estudio demuestran que, si bien la melatonina es un excelente marcador del marcapasos circadiano cuando entre el ciclo, entre individuos, y entre los ritmos cepa de la misma especie animal se refiere, precaución debe ser utilizada cuando la melatonina se comparan los datos entre las diferentes especies . Cuando la técnica de microdiálisis pineal se utiliza en un ritmo de estudio, nuestros datos demuestran que la aparición nocturna de aumento de 5-HT en libertad puede ser más adecuado para inter-especies análisis comparativo de los ritmos circadianos. Nuestros estudios futuros incluirán la investigación de si el 5-HT y la melatonina inicio fases están directamente correlacionadas con la del animal circadiano períodos, y si las variaciones de 5-HT/melatonin inicio se asocian con circadiano variaciones en el comportamiento y la fisiología animal en sistemas modelo.

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

TL todos los experimentos realizados, que incluyen cirugías, la recogida de muestras a través de microdiálisis, HPLC y análisis de las muestras. JB dirigió el estudio, analizaron los datos, y escribió el manuscrito. Ambos autores leído y aprobado la versión final del artículo.