Malaria Journal, 2006; 5: 80-80 (más artículos en esta revista)

Detección e identificación de especies de Plasmodium humanos con tiempo real para la cuantificación de secuencias de ácido nucleico basada en la amplificación

BioMed Central
Petra M Mens (p.mens @ kit.nl) [1], Gerard J Schoone (g.schoone @ kit.nl) [1], Piet Una Kager (Pakager@amc.uva.nl) [2], Henk DFH Schallig (H.schallig @ kit.nl) [1]
[1] Koninklijk Instituut voor de Tropen (KIT) / Royal Tropical Institute, KIT de Investigación Biomédica, Meibergdreef 39, 1105 AZ Amsterdam, Países Bajos
[2] Centro Médico Académico de la División de Enfermedades Infecciosas, Medicina Tropical y el SIDA, Meibergdreef 9, 1105 AZ Amsterdam, Países Bajos

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.

Resumen
Fondo

Decisiones relativas a tratamiento de la malaria dependen de la identificación de las especies causando enfermedad. Microscopía se utilizan con más frecuencia, pero a baja parasitemia (<20 parásitos / μ l) la técnica se vuelve menos sensible y una pérdida de tiempo. Pruebas de diagnóstico rápido basado en la detección de antígenos de Plasmodium hacer a menudo no permitir la discriminación para las especies como la microscopía hace, sino también convertirse en insensible a <100 parásitos / μ l.

Métodos

En este trabajo se reporta el desarrollo de una sensibilidad y especificidad en tiempo real cuantitativos Secuencia de Ácido Nucleico base de amplificación (en tiempo real QT-NASBA) ensayos, sobre la base de la pequeña subunidad 18S rRNA gen, para identificar las cuatro especies de Plasmodium humanos.

Resultados

El menor límite de detección del ensayo es 100 - 1000 moléculas de ARN in vitro para todas las especies, lo que corresponde a 0,01 - 0,1 parásito de diagnóstico por muestra (es decir, el 50 μ l de sangre procesadas). El tiempo real QT-NASBA se evaluó mediante 79 muestras clínicas de pacientes con malaria, es decir, 11 por Plasmodium. falciparum, 37 Plasmodium vivax, Plasmodium malariae siete, cuatro Plasmodium ovale y 20 infecciones mixtas. El diagnóstico inicial de 69 de las 79 muestras se confirmó con los países desarrollados en tiempo real QT-NASBA. Re-análisis de siete diapositivas originales disponibles resuelto cinco desajustes. Tres de ellas fueron inicialmente identificados como P. malariae mono-infección, pero después de releer las diapositivas p. falciparum fue encontrado, lo que confirma el tiempo real QT-NASBA resultado. Los otros dos diapositivas eran de mala calidad no permite la identificación de las especies verdaderas. Los cinco restantes resultados discordantes no puede ser explicado por microscopía, pero puede ser debido a la extrema bajo número de parásitos presentes en las muestras. Además, el 12 de Plasmodium berghei cepas de ratones y 20 muestras de sangre de donantes sanos no muestran ninguna reacción en el ensayo.

Conclusión

En tiempo real QT-NASBA es muy sensible y técnica específica con un límite de detección del parásito Plasmodium 0,1 por diagnóstico muestra (50 μ l de sangre) y puede ser utilizado para la detección, identificación y medición cuantitativa de baja parasitemia especies de Plasmodium, por lo tanto, por lo que es una herramienta eficaz para el diagnóstico y útil para epidemiológica y estudios de drogas.

Fondo

La malaria es una de las principales enfermedades infecciosas en el mundo, con 300-500 millones de casos clínicos y 1-3 millones de muertes cada año [1]. Tradicionalmente el diagnóstico de malaria se basa en la detección microscópica de parásitos Plasmodium en Giemsa-manchados de sangre diapositivas. En las últimas décadas, los ensayos de detección de antígenos y detección molecular ensayos se introdujeron como alternativa a la microscopía [2]. Detección de antígenos ensayos tienen como objetivo principal la identificación de Plasmodium falciparum. Sólo muy pocos ensayos son capaces de identificar las infecciones causadas por otras especies de Plasmodium humanos [2, 3]. Por otra parte, la sensibilidad y especificidad de estas pruebas es baja y la cuantificación del parásito no es posible [3, 4]. La aplicación de técnicas moleculares elude las limitaciones convencionales de diagnóstico de malaria. Basado en la PCR en los ensayos son sensibles y pueden ser convertidos a un formato cuantitativo si SYBR verde o sondas moleculares (por ejemplo, una sonda Taqman o una baliza molecular) se utilizan en los ensayos en tiempo real [5 - 7]. Por otra parte, en tiempo real cuantitativos Secuencia de Ácido Nucleico base de amplificación (en tiempo real QT-NASBA) la tecnología puede ser aplicada, que tiene algunas ventajas por encima de PCR en tiempo real ensayos. El tiempo real QT-NASBA ensayo es simple y rápido en comparación con PCR en tiempo real ensayos que puede tomar hasta cuatro horas en comparación a 60 minutos en el caso de NASBA [8, 9]. Por otra parte, en tiempo real QT-NASBA detecta ARN ribosomal de varios ejemplares que están presentes en el genoma por un parásito que el ADN correspondiente a PCR que se basa. Esto hace que NASBA un diagnóstico muy sensible ensayo. Por otra parte, NASBA se basa en una reacción isotérmica a 41 grados que no requieren un paso de desnaturalización del ADN resuelve la prevención de amplificación de ADN genómico en caso de contaminación [8]. En tiempo real QT-NASBA, utilizando un modelo molecular como la detección de la sonda, se ha desarrollado para p. falciparum y ha demostrado ser muy sensible con un límite de detección de 20 parásitos / ml [9]. La detección de los otros parásitos que causan la malaria humana, es decir, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y el Plasmodium ovale, es de importancia clínica con el fin de decidir sobre el tratamiento adecuado. En este artículo se describe el desarrollo de un tiempo real QT-NASBA para la detección, identificación y cuantificación de estas especies de Plasmodium.

Métodos
Primer / sonda y selección in vitro RNA producción

Generic Plasmodium adelante (5'-TCAGATACCGTCGTAATCTTA-3 ') e invertir (5'-TTCGCGCAAGCAGAAAGTT-3') se utilizaron cebadores para amplificar una región de 180 bp de p. vivax, P. ovale y P. malariae 18S rRNA gen por PCR tal como está descrita anteriormente [10]. Los fragmentos amplificados fueron clonados en el plásmido pCR2 en Escherichia coli INValphaF (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.). A continuación, in vitro RNA fue producido con la transcripción SP6/T7 kit (Roche, Mannheim, Alemania) y el fragmento clonado fue secuenciado (Base Borrar, Leiden, Países Bajos). La producción de p. 18S rRNA falciparum in vitro basado en el ARN se realizó con anterioridad [10]. Primers fueron seleccionados sobre la base de las secuencias de ADN de las tres especies (Figura 1]. Homología de estas secuencias con las secuencias publicadas y la especificidad de los cebadores se analizó con la explosión de bases de datos para la búsqueda de homología [15]. El NASBA primers adelante se eligieron a su especificidad de las especies. P. falciparum: 5'GTCATCTTTCGACGTGACTT-3 '; p. vivax: 5'-TTTCTCTTCGGAGTTTATTC-3 '; p. ovale: 5'-CGACATTGTCATTCCATTTAC-3 '; p. malariae: 5'-GAGTGTTTCTTTTAGATAGC-3 '. Un promotor T7 secuencia se añadió al genérico Plasmodium NASBA primers invertir; 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGAACTTTCTCGCTTGCGCGAA-3 '. El publicada pf18S molecular faro 5'-6-carboxifluoresceína-CGATCGGAGAAATCAAAGTCTTTGGGCGATCG-dimethylaminoazosulfonic ácido-3 'era utilizado como una sonda de detección [9].

El trabajo molecular se realizó en virtud de 02-080 permiso concedido el 22 de febrero de 2002 To Kit de Investigación Biomédica de los Países Bajos Ministerio de Ordenación del Territorio, Vivienda y Medio Ambiente.

En tiempo real - QT-NASBA

En tiempo real QT-NASBA para 18S rRNA del P. falciparum, P. vivax, P. y P. malariae ovale se realizó en un IQ5 Real-Time analizador (Bio-Rad). Las reacciones fueron ejecutadas con el Nuclisens kit básico para la amplificación (BioMerieux), con arreglo a las instrucciones del fabricante con una concentración de KCl 80 mM de p. falciparum, P. vivax y P. malariae y 70 mm de p. ovale. La mezcla de reacción (5 μ l), que contiene los primers (100 pmol / μ l) baliza molecular (20 μ m) y plantilla de ARN (2,5 μ l) se incubaron a 65 ° C durante dos minutos seguidos por dos minutos a 41 ° C. Posteriormente, 2,5 μ l de la enzima de la mezcla básica kit se añadió a cada reacción. La amplificación fue supervisado durante 60 minutos después de que los resultados fueron analizados. Una muestra que contiene sólo agua y mezcla de reacción se utilizó como blanco y sirvió como control para el fondo de fluorescencia. La señal producida por las muestras en blanco es automáticamente restará de las muestras de análisis (Bio-Rad IQ5 software v. 1.0). Con el fin de cuantificar el número de parásitos en una muestra clínica, a 10 veces la dilución de serie 10 9 a 10 2 moléculas de ARN in vitro de amplificación por reacción de cada especie Plasmodium se ha ejecutado por triplicado en cada prueba, donde 10 4 moléculas corresponde a un parásito Plasmodium [10].

Muestras clínicas

Las muestras de sangre para la validación (n = 79) fueron obtenidos de pacientes con diagnóstico de la malaria mediante la detección y diferenciación de los parásitos Plasmodium en Giemsa-manchado diapositivas con microscopía estándar de acuerdo con las recomendaciones de la OMS [11] o métodos de PCR tal como se establece en el que contribuyen los centros médicos. Las muestras se obtuvieron de los viajeros regresaron con síntomas clínicos que visita la clínica del paciente fuera del Centro Médico de la Universidad de Leiden (Países Bajos) y el Centro Médico Académico de Amsterdam (Holanda) y en curso de estudios de campo en Vietnam, Turquía y Kenia (Tabla 1] . Las muestras fueron cegados a prueba de diagnóstico de los resultados. La especificidad de los ensayos se puso a prueba in vitro contra el RNA de las cuatro especies de Plasmodium y ARN aislado de Plasmodium berghei aislamientos (12 muestras). Por otra parte 20 muestras de holandés sanos donantes de sangre se probaron como controles negativos. Las muestras de sangre (50 μ l) se mezclan con 950 μ l guanidium isotiocianato de amortiguador de lisis y se aisló ARN, tal como se describe anteriormente [12].

El análisis estadístico de la prueba de rendimiento

Microscopía realizado en el diagnóstico inicial fue considerado como el patrón oro para este fin y NASBA todos los resultados se compararon con estos resultados. El acuerdo entre la microscopía y en tiempo real QT-NASBA ensayo se determinó mediante el cálculo de valores de Kappa con un 95% intervalo de confianza (Altman, 1991). Kappa valores expresar el acuerdo más allá de oportunidad y un valor de kappa 0.21-0.60 es un moderado, un índice kappa del valor de 0.61-0.80 y una buena kappa> 0,80 casi perfecto acuerdo más allá de azar.

Resultados
Los resultados analíticos del ensayo

El menor límite de detección del ensayo desarrollado según lo determinado por el análisis de diluciones seriadas de ARN in vitro de P. vivax, P. o P. ovale malariae, respectivamente, 100 - 1000 moléculas de ARN in vitro para cada especie, correspondientes a 0,1 - 0,01 parásito de diagnóstico por muestra (es decir, el 50 μ l de sangre procesadas) (Figura 2, 3 y 4]. N transversal de hibridación de los primers con el RNA in vitro de las otras especies y ninguno con p. berghei ARN aislado de ratones (n = 12) se observó. Las muestras de sangre formulario de donantes sanos (n = 20) no mostró una reacción en cualquiera de los ensayos.

Rendimiento clínico del ensayo

El desarrollados en tiempo real QT-NASBA se evaluó mediante 79 muestras clínicas (Tabla 2]. En tiempo real QT-NASBA confirmó el diagnóstico inicial con microscopía de 69 de las 79 muestras clínicas. El 37 p. vivax se encontraron muestras que se p. vivax con microscopía, así como con NASBA. Sin embargo, una clínica dio una muestra más débil p. ovale con la señal en tiempo real QT-NASBA. Los cuatro p. ovale muestras fueron identificadas como tales por tiempo real QT-NASBA. Sin embargo, dio una muestra más débil p. vivax señal. Dos de los siete p. malariae mono-infecciones se encontraron negativos de NASBA. Por otra parte, tres de las siete p. malariae mono-infecciones fueron identificadas en tiempo real QT-NASBA como p. falciparum / P. malariae infección mixta. Sólo 11 p. falciparum muestras fueron analizadas en tiempo real QT-NASBA en el presente estudio, como un análisis exhaustivo de esta especie ya se ha hecho [9]. El diagnóstico microscópico p. falciparum de la clínica muestras analizadas en el presente estudio fue confirmada por NASBA. De los 20 p. falciparum / P. malariae infecciones mixtas, 19 fueron identificados como una infección mixta con NASBA: 17 es una infección mixta de P. falciparum / P. malariae y dos muestras dieron una débil p. vivax reacción en lugar de p. malariae. Una muestra fue identificado en tiempo real QT-NASBA como p. falciparum mono-infección.

De los 10 resultados discordantes, siete muestras fueron objeto de un nuevo examen de re-lectura de la sangre se desliza por un experto microscopista que era ciego de la original microscopía y NASBA resultados. No hubo back-up diapositivas o PCR muestras disponibles de los otros tres resultados discordantes. El estudio microscópico nuevo análisis resuelto cinco resultados discordantes. En las tres P. malariae mono-infecciones que se identificaron como una infección mixta por tiempo real QT-NASBA, un muy bajo número de p. falciparum se encontró después de releer las diapositivas. En las dos diapositivas que fueron inicialmente diagnosticados de microscopía como p. falciparum / P. malariae infecciones mixtas, pero con el tiempo real QT-NASBA como una p. falciparum / P. vivax infección mixta, los resultados de re-lectura se desliza la sangre no fueron concluyentes de la presencia de P. malariae y / o otras especies de Plasmodium.

El análisis estadístico

Un alto grado de acuerdo se observó entre el tiempo real QT-NASBA ensayo y microscopía en el presente estudio. Un valor de kappa de 0,926 (95% CI 0.872-0.967) indica un muy buen acuerdo más allá del cambio.

Discusión

El objetivo del presente estudio fue desarrollar un tiempo real QT-NASBA para la detección de las cuatro especies de Plasmodium humanos. Sobre la base de la evaluación analítica de los países desarrollados prueba, se concluyó que la sensibilidad de los ensayos desarrollados es de 0,1 a 0,01 por parásitos diagnóstico muestra. Esto es comparable a la desarrollada anteriormente NASBA para p. falciparum [9] y aproximadamente 50 veces más sensible que la microscopía estándar [2]. El desarrollado ensayos moleculares identificados en 69 de 79 muestras de la misma especie como la inicial de diagnóstico microscópico. Después de verificar de nuevo los toboganes, el diagnóstico molecular parece ser correcta en tres casos discordantes, lo que deja sin resolver cinco resultados. La aparente discrepancia entre las dos pruebas de diagnóstico puede deberse a un muy bajo número de parásitos en la muestra por debajo del límite de detección de microscopía, pero aún detectable en tiempo real QT-NASBA. El hecho de que en una muestra ninguna señal se obtuvo con el tiempo real QT-NASBA podría ser debido a la degradación de la extracción de RNA o fracaso. Lamentablemente no se dispone de copia de seguridad muestra a repetir la extracción y el análisis. En principio, la cuantificación de los parásitos es posible en tiempo real QT-NASBA, pero la comparación con los datos microscópicos de las muestras clínicas no ha sido posible desde parásito cuenta de las diapositivas no estaban disponibles. Un parásito in vitro era la cultura no está disponible también para p. vivax, P. ovale y P. malariae, lo que hace difícil hacer cálculos exactos. El parásito cálculos utilizados en el presente estudio se basan en el número de moléculas de ARN in vitro, que se correlaciona con el número p. falciparum parásitos [10]. Se parte del supuesto de que estas cantidades son comparables a las de otras especies. En general hay poca relevancia clínica para la cuantificación de la p. ovale, P. y P. malariae vivax ya que los pacientes normalmente tienen <2% parasitemia [13] y se da tratamiento a base de infectar a las especies y no en la parasitemia. En contraste, la parasitemia en P. la infección por P. falciparum es un factor importante para el régimen de tratamiento y el seguimiento de la eficacia del tratamiento. Se ha demostrado que QT-NASBA es una herramienta valiosa para evaluar la dinámica del parásito en los estudios donde la eficacia de los medicamentos es de control o combinaciones de fármacos se comparan [10, 14]. El submicroscopic límite de detección de la técnica NASBA ofrece la posibilidad de controlar incluso las pequeñas diferencias que no son percibidas por microscopía e incluso puede ser un predictor de fracaso del tratamiento [14].

Conclusión

El desarrollados en tiempo real QT-NASBA para la detección de las cuatro especies de Plasmodium humanos basada en el gen 18S rRNA de Plasmodium que se mostró muy sensible y técnica específica con un límite de detección de parásitos por 0,1 diagnóstico muestra. El ensayo puede ser utilizado para la detección, identificación y medición cuantitativa de todas las especies de Plasmodium humanos, incluso a niveles bajos de parásitos, convirtiéndolo así en una herramienta eficaz para el diagnóstico y útil para epidemiológica y estudios de drogas.

Autores de las contribuciones

PFM: Desarrollo y diseño de la NASBA ensayos, la validación del análisis molecular y análisis de las muestras. Análisis e interpretación de los datos, la redacción y la preparación del manuscrito.

GJS: Clonación y expresión de ARN in vitro, Secuenciación de Plasmodium y plantillas de diseño de primers y análisis molecular.

PAK: Facilitación y coordinación de la recogida de muestras clínicas. La interpretación de los datos y la revisión crítica del manuscrito.

HDFHS: Concepción del estudio y la participación en su diseño y la coordinación. Interpetation de los datos, la lectura crítica del manuscrito

Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este trabajo recibió apoyo financiero del Conocimiento y Fondo de Innovación de la Koninklijk Instituut voor de Tropen (KIT) / Royal Tropical Institute (Amsterdam, Países Bajos). Damos las gracias al Dr J Verweij de la Leiden University Medical Centre (Leiden, Países Bajos), Dip. de Microbiología Médica (Universidad Radboud, Nijmegen, Holanda) y Yusuf Özbel de la Ege University Medical School (Izmir, Turquía) para que nos proporciona muestras clínicas, que se utilizaron en la validación de este estudio. También damos las gracias al Dr C. Janse de la Leiden University Medical Centre (Leiden, Países Bajos) para que nos proporciona la p. berghei muestras y Nel Kroon cuidadosamente para volver a leer las diapositivas.