Reloj circadiano mutación afecta a la regulación de células de la sangre circulante

El número de distribuir los glóbulos blancos (WBC) que participan en la defensa inmune está sometido a alta amplitud de los ritmos circadianos [1, 2]. Determinados cambios periódicos en el número de leucocitos circulantes en la sangre periférica podría ser el resultado de varios factores. Estos incluyen la distribución de distribuir y componentes marginales de células de los tejidos y órganos, el influjo de los lugares de almacenamiento, la proliferación celular, la liberación de novo en células de la circulación, y la destrucción de células y la eliminación [2]. Los mecanismos subyacentes circadiano de los cambios en las células circulantes en sangre no han sido completamente aclarada, aunque el número de monocitos, natural killer (NK), células T y células B variar de manera circadiana [3 - 5].

Reloj fue el primer reloj de genes identificados en los vertebrados utilizando N-etil-N-nitrosourea mutagénesis selección [6]. Reloj mutantes exposición anormalmente largo periodicidad de comportamiento para los primeros 5 a 15 ciclos y, posteriormente, perder la ritmicidad circadiana en constante oscuridad, aunque los ritmos de comportamiento son completamente arrastrado a la luz del medio ambiente bajo una luz-oscuridad ciclo [6]. Sin embargo, informó de que la periodicidad de largo Reloj ratones mutantes en un JCL: ICR antecedentes dura más de un mes en constante oscuridad [7, 8]. El reloj gen codifica una base hélice-loop-hélice (bHLH)-PAS factor de transcripción que juega un papel importante en el circuito de retroalimentación negativa del reloj circadiano [9, 10]. Al igual que otros factores de transcripción bHLH, el reloj se une el ADN y modula la transcripción después de la dimerización. A medida que el reloj alelo está truncado y es causa de una deleción de 51 aminoácidos, la mutación de suponer que no afectan significativamente la N-terminal bHLH y PAS dominios, dejando RELOJ dimerización y el ADN intacto vinculante [9, 10]. De hecho, la proteína mutante RELOJ puede todavía forma heterodimers con BMAL1 (a bHLH-PAS factor de transcripción) que se une al ADN, pero estos son deficientes en la actividad transcripcional [9, 10]. RELOJ proteína está implicada en la regulación transcripcional de varios genes circadianos de salida, así como en el núcleo del reloj circadiano [11, 12].

Para determinar si la proteína intacta RELOJ es necesaria para que el circadiano cambios en las células de sangre periférica, se examinaron WBC y distribuir los glóbulos rojos (RBC) y se evalúan los niveles plasmáticos de corticosterona (CS) en homocigotos Reloj ratones mutantes.

Reloj mutantes se obtuvieron a partir de ratones suministrados por JS Takahashi (Northwestern University, Evanston, IL.). Los ratones tenía originalmente el reloj en un alelo BALB / c C57BL/6J y antecedentes. Una colonia de cría se estableció por más retrocruzas con JCL: ICR ratones y la nueva cepa fue posteriormente mantenida por cruce de al menos 10 generaciones [13]. Los genotipos fueron determinados utilizando PCR, tal como se describe [14]. Los ratones fueron estudié en 8-10 semanas de edad. Los animales fueron alojados en virtud de un 12 h luz-12 h oscuridad ciclo [LD 12:12; luces a las 0:00 h]. Una lámpara fluorescente de color blanco fue utilizado como una fuente de luz durante el día (150-200 lux a nivel de las jaulas).

Para determinar la sangre periférica de células que circulan en cada momento y el genotipo, los ratones fueron muertos por decapitación, el tronco de sangre se recogió en heparinized tubos capilares, células de la sangre se contó automáticamente (Sysmex F-820 de sangre contra, Toa Medical Electron Inc, Japón), y la diferencia fue determinada por Wright-tinción de Giemsa seguido por microscopía de luz.

Para determinar CS y la OEP en cada momento y el genotipo, los ratones fueron muertos por decapitación y el tronco de sangre se recogió en heparinized tubos capilares. La sangre fue recolectada en la oscuridad bajo una tenue luz roja para evitar cualquier posible influencia de la luz sobre el perfil de corticosterona [15]. El plasma fue inmediatamente separado de muestras de sangre mediante centrifugación a 3000 rpm durante 10 min a 4 ° C y almacenarse a una temperatura de -80 ° C. Mouse CS plasma y los niveles de EPO se determinó utilizando un kit para la evaluación del impacto ambiental rata CS (Diagnostic Systems Laboratories, Inc) y un kit ELISA para ratón EPO (R & D Systems, Minneapolis, MN), respectivamente.

El bazo fue homogeneizada en agua destilada. Después de centrifugación a 3000 rpm durante 15 min, HGB concentraciones de los sobrenadantes se determinaron utilizando la hemoglobina B-prueba Wako (Wako Pure Chemical Industries Ltd, Osaka, Japón).

Se utilizó un no lineal de mínimos cuadrados (NLLS) Marquardt-Levenberg algoritmo para ajustar una curva a las observaciones, y se decidió la acrophase (la fecha de celebración del coseno como máximo) de los números del total de glóbulos blancos, linfocitos y glóbulos rojos, hemoglobina y los niveles de corticosterona. Nosotros definimos la función como f (x) = M + A cos (2p / P * (x - T)) y configurar las variables M (MESOR, con una media de las estadísticas de ritmo), A (amplitud) y T (Acrophase) como la parámetros de ajuste. P se fijó en 24, debido a que el presente estudio se procedió en virtud de LD 12:12. Acrophases se compararon mediante Welch's t-test, y p <0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Todos los valores son expresados como medias ± SEM. De Scheffé para comparaciones múltiples pruebas evaluaron las diferencias entre los genotipos.

Figura 1A muestra que el número total de WBC fluctuó en un patrón circadiano que llegó a su máximo durante la primera hora de la mañana, tanto en la naturaleza y tipo de reloj en ratones mutantes, aunque la acrophase del ritmo se retrasó de 3,7 ± 1,3 h en el medio silvestre tipo de ratones 5,5 ± 0,7 h en el reloj mutantes. El acrophase del ritmo de linfocitos también se retrasó considerablemente de 4,9 ± 1,1 h en el medio silvestre de tipo ratones a 7,3 ± 0,5 h en el reloj mutantes (Figura 1B]. El patrón temporal del número de neutrófilos en ratones mutantes Clock fue bimodal, mientras que el patrón de linfocitos fue similar a la del tipo silvestre ratones (Fig. 1C]. El reloj mutación reducido el número total de glóbulos blancos, linfocitos y neutrófilos durante el período de luz (Fig. 1A - C].

La Figura 2 muestra que los niveles plasmáticos de CS fluctuado de manera circadiana en tanto de tipo salvaje y Reloj ratones mutantes, pero la acrophase difería significativamente entre los genotipos (p <0,01). En el de tipo salvaje ratones, plasma CS llegaron a un máximo de 9,8 ± 0,4 h, justo antes de la luz-oscuridad de transición [4]. En contraste, los niveles plasmáticos CS Reloj en ratones mutantes llegaron a un máximo de 16,4 ± 0,3 h, en la mitad del período oscuro. El pico CS niveles fueron similares en los dos genotipos.

Figura 3A muestra que el número de glóbulos rojos llegaron a un máximo de 9,5 ± 0,3 h. justo antes de la luz-oscuridad en transición de tipo salvaje ratones. Sin embargo, la amplitud y se redujo la acrophase adelantó significativamente a 4,5 ± 1,0 h (p <0,05) en ratones mutantes Clock (Fig. 3A]. Los niveles sanguíneos de HGB estrechamente correlacionado con el número de glóbulos rojos (Fig. 3]. El acrophase HGB fue de 10,0 ± 0,4 h en el medio silvestre de tipo ratones y 4,5 ± 1,0 h en el reloj mutantes (p <0,05).

Plasma OEP niveles fueron ligeramente pero significativamente mayor en Clock mutante (77,2 ± 0,09 pg / l) que en los de tipo salvaje (68,8 ± 0,07 pg / l), ratones (p <0,01). Plasma los niveles de EPO no se rítmica, ya sea en el genotipo (datos no presentados).

Examen de Anatomía de ratones mutantes Clock puesto de manifiesto la hinchada roja del bazo (Fig. 4A]. El peso húmedo del bazo por peso corporal de Reloj mutantes fue aproximadamente 1,5 veces mayor que la de tipo silvestre ratones (p <0,01) (Fig. 4B]. El contenido HGB esplénica fue también significativamente mayor en los ratones mutantes Clock (p <0,01) (Fig. 4C].

El ritmo circadiano en el número de células circulantes en sangre en los mamíferos es muy regular y reproducible [16]. Sin embargo, la naturaleza compleja de este reglamento ha impedido esclarecimiento de los mecanismos subyacentes de los cambios circadianos en células de la sangre circulante [2]. El presente estudio encontró que una mutación homocigótica del gen reloj circadiano, del reloj, afecta a la fluctuación circadiano de leucocitos circulantes y RBC a los ratones. Este hallazgo sugiere que el ritmo circadiano en el número de células de la sangre depende de los componentes fundamentales del reloj circadiano.

Hormonas esteroideas desempeñan un papel importante en la generación de ritmo circadiano de células de la sangre circulante [17]. Los pacientes con una insuficiencia suprarrenal o con la hiperplasia suprarrenal tienen alta y baja los niveles de cortisol endógeno junto con altos y bajos de linfocitos cuenta, respectivamente [18, 19]. Los corticosteroides causa el flujo de salida de algunos linfocitos de la vasculatura y su retención en la circulación linfática [20]. El mecanismo mediante el cual los corticosteroides causa estos movimientos puede implicar la expresión de moléculas de adhesión celular (CAM) [21, 22]. La expresión los niveles de leucocitos (incluyendo los linfocitos, neutrófilos y monocitos) y de la CAM son más altas cuando las concentraciones plasmáticas de cortisol sean las mejores [23]. Curiosamente, previamente demostrado que los niveles de mRNA expresión de ICAM1 se reducen en ratones mutantes Clock [11]. En el presente estudio se encontró que el total de acrophase WBC y los números de linfocitos fue demorado por unas horas, de conformidad con la de los niveles plasmáticos CS Reloj en ratones mutantes. Nos informó anteriormente de que el acrophase de otros parámetros fisiológicos como la temperatura corporal (17,2 ± 0,2 h y 19,9 ± 0,3 h en el de tipo salvaje y los mutantes del Reloj, respectivamente) y la actividad espontánea (17,5 ± 0,4 h y 19,9 ± 0,3 h en el medio silvestre Reloj tipo y mutantes, respectivamente) también se retrasó en ratones mutantes Clock [13]. Nuestros resultados actuales sugiere que el reloj circadiano reguladas diurna CS secreción de la glándula suprarrenal se trata en efecto de la mutación de genes del reloj circadiano en los cambios en el número de periféricos que circulan WBC.

La fluctuación circadiano de la concentración plasmática CS es mitigado en los bajos niveles en los ratones mutantes Reloj con un fondo CBA/6CaH bajo condiciones LD [24]. Sin embargo, el presente estudio identificó un ritmo circadiano CS Reloj en ratones mutantes con un JCL: ICR fondo bajo condiciones LD, aunque la acrophase se retrasó en ratones mutantes. Estas notables diferencias de las cepas del efecto de una mutación de genes del reloj circadiano en la secreción de CS son muy similares a los de comportamiento, como el comportamiento del ritmo circadiano de homocigotos ratones mutantes Clock es totalmente abolida bajo la constante oscuridad en ambos C57BL/6J [6] y CBA / 6CaH [25] orígenes, pero mantuvo durante al menos 2 meses en el JCL: ICR fondo [7]. Un estudio reciente utilizando la cre-LoxP sistema ha encontrado que el reloj no es esencial para generar el ritmo circadiano del aparato locomotor en ratones [26]. RELOJ proteína mutante podría provocar ganancia de función de los efectos en ratones mutantes, ya que el alelo del reloj se trunca y provoca una supresión de la transactivation de dominio, lo que deja intacto el ADN vinculante. Las diferencias fenotípicas (como CS ritmo, actividad locomotora [7], y el metabolismo [27]] entre el reloj de ratones mutantes con diferentes orígenes puedan reflejar los niveles de expresión de la proteína truncada RELOJ, que en el JCL: ICR fondo interferiría con menos circadiano y otros procesos fisiológicos. El presente estudio demostró que el reloj intacto no es esencial para circadiano, ya sea CS o la secreción circadiana de fluctuación de leucocitos circulantes en ratones, por lo menos en virtud de una condición de LD.

Por otra parte, un estudio de muestras de sangre retirado durante un período de 24 h ha establecido un ritmo circadiano en E-formadora de roseta (T) in vitro de células que persiste en 4 días de edad cultivos celulares [28]. Este hallazgo sugiere que las fluctuaciones en algunas subpoblaciones linfocitarias dependen de un oscilador circadiano celular [2]. Nos reveló que muchos genes circadianos de salida, así como los que están en el núcleo del reloj circadiano, se rigen por el reloj de proteínas a nivel de transcripción [11]. En el presente estudio, el ritmo circadiano de los neutrófilos circulantes es un proceso de amortiguamiento bimodal en ratones mutantes Clock, que aunque de linfocitos fue sólo la fase de retraso. Granulocitos emigrar del torrente sanguíneo a los tejidos y no pueden recirculación, mientras que los linfocitos continuamente recirculación de los tejidos linfáticos a través de la vuelta a la sangre. Por lo tanto, el reloj mutación podría afectar a la proliferación de neutrófilos en la médula ósea y / o apoptosis de neutrófilos en los tejidos periféricos.

Mostramos aquí que la variación circadiana de glóbulos rojos circulantes está regulada no sólo por la consecuencia de los ritmos fisiológicos tales como la alimentación y del sueño, sino también por el reloj circadiano endógeno. El acrophase de la RBC ritmo diurno está cerca de la luz-oscuridad nocturna transición en ratones. El acrophase de distribuir RBC diurnally activa en los seres humanos es también en el momento de la luz-oscuridad de transición [16]. Así, la relación entre circulante WBC de cerca de 180 ° entre los ritmos circadianos en los seres humanos diurnally activa y activa nocturnally roedores no se aplica a la RBC ritmo. Esto se asemeja a la expresión de genes del reloj circadiano en el núcleo suprachiasmatic (SCN), que es el capitán marcapasos circadiano que controla la mayoría de los ritmos circadianos fisiológicos de los mamíferos. La fase de expresión de genes reloj (Per1 y Per2) en el SNC es casi idéntica entre los roedores que están activas durante la noche [9, 10] y durante el día [29 - 31]. Por lo tanto, el SNC puede regular perfectamente la fase circadiana de glóbulos rojos circulantes en los mamíferos, mientras que la fase de WBC parece ser afectada por los ritmos fisiológicos como los de alimentación, actividad locomotora y la sangre los niveles de CS.

Las amplitudes de RBC ritmos son muy pequeñas y son de interés desde un punto de vista fisiológico [32]. RBC números que circulan están determinados no sólo por su remoción de la circulación periférica en el bazo y el hígado, sino también por su producción en la médula ósea. En realidad, reticulocitos circulantes tienen un ritmo circadiano, lo que sugiere su periódico circadiano de liberación de la médula ósea [16]. El principal regulador erythropoietic OEP RBC controles de producción. También se encontró que los niveles plasmáticos de EPO fueron ligeramente, pero aumentó significativamente en los ratones mutantes Clock a lo largo del día. De este modo, el reloj mutación puede afectar a la regulación diurna de la producción de glóbulos rojos en la médula ósea.

La media del volumen celular (MCV) de los eritrocitos en el presente estudio no parecen exhibir ritmicidad circadiana o para mostrar las diferencias genotípicas. La Figura 3 muestra que HGB niveles en la sangre están estrechamente correlacionado con el número de glóbulos rojos. Estos resultados sugieren que la disponibilidad de hierro erythropoietic se mantuvo intacta en el reloj de ratones mutantes.

La vida de los glóbulos rojos circulantes producidos en la médula ósea está determinada por su eliminación del bazo. El RBC y HGB niveles en el presente estudio se rítmica y todavía en fase avanzada de reloj en ratones mutantes, aunque el ritmo circadiano de RBC y HGB en la sangre circulante se vio gravemente amortiguamiento en los mutantes. Anatómico examen reveló hinchada roja y un bazo aumentado significativamente esplénica HGB contenido en ratones mutantes Clock. Estos hallazgos sugieren que los efectos de la mutación del Reloj en RBC resultados ritmo de aumento de la eliminación de glóbulos rojos de la sangre y / o una disfunción en la gestión de RBC el bazo.

Nuestros resultados también indicaron que la mutación del reloj circadiano afecta a la regulación de ambos niveles de CS sangre periférica y células de la sangre circulante, pero que intacto RELOJ no es esencial para generar el ritmo. Además esclarecimiento de las funciones de los genes del reloj circadiano debe revelar los mecanismos subyacentes de los cambios circadianos en los mamíferos funciones inmunitarias.

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

KO y NO participó en la recopilación de datos y redactó el manuscrito. KK llevado a cabo una fase de análisis circadiano. MK descubierto la hinchada roja bazo en ratones mutantes Clock. KS y SY ayudó con la recopilación de datos. JM, KM, SH, NI y supervisó el estudio. Todos los autores leído y aprobado la versión final del artículo.