Mediators of Inflammation, 2006; 2006(3): (más artículos en esta revista)

Regulado distribución espacial de Cyclooxygenases y Lipoxygenases en enfermedad de Crohn Úlcera

Hindawi Publishing Corporation
Yao Mao, Jian'an Ren, Jieshou Li

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Resumen

Antecedentes y objetivos. Metabolismo del ácido araquidónico participa activamente en la iniciación, culminante, y la resolución de las fases de inflamación, y su estrecha relación con enfermedades inflamatorias del intestino ha sido recientemente descubierto. El objetivo de aclarar el papel de las diferentes vías araquidónico y las interrelaciones entre ellos en la enfermedad de Crohn. Métodos. Diecisiete ejemplares de la enfermedad de Crohn fecha entre 2003/1/1 y 2005/1/1 se recogieron y se sometió a análisis inmunohistoquímico con cylcooxygenase 1, la ciclooxigenasa 2, 5-lipoxygenase, y 15-lipoxygenase-1 anticuerpos. Resultados. (1) La distribución espacial de los tres principales enzimas en ácido araquidónico vía de la ciclooxigenasa-2, 5-lipoxygenase, y 15-lipoxygenase-1-secuencial seguido acuerdo en enfermedad de Crohn úlcera: los neutrófilos muy expresando 5-lipoxygenase se encontraban en la máxima superficie que limita la banda de la ciclooxigenasa-2 expresión que se encuentra justo debajo de ella, y en los estratos más bajos y por debajo de la región de granulación se eosinófilos que transportaba a 15-lipoxygeanse-1. (2) La ciclooxigenasa-2 y 15-Lipoxygenase-1-células positivas formaron dos barreras como las estructuras que posiblemente inhibe la infiltración de neutrófilos. Conclusión. La distribución regulada indicó coordinada interacción entre las células inflamatorias y las células del parénquima, entre las vías del ácido araquidónico, y entre innata y la inmunidad adaptativa, y las barreras como las estructuras de protección se indica las funciones de la ciclooxigenasa 2 y 15-Lipoxygenase-1 en la enfermedad de Crohn.

INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Crohn (CD) es una enfermedad inflamatoria intestinal (EII) se caracteriza por transmural, segmentaria, y en general inflamación granulomatosa del intestino, con alternancia de remisión y recaídas en las fases de su evolución clínica. En general, se considera que dysregulated respuesta inmune a las bacterias luminal juega un papel causal en su patogenia. Nueva investigación es dilucidar los factores genéticos en el desarrollo de CD, entre los cuales la descubrir el gen Nod2 es especialmente emocionante [1, 2]. Sin embargo, a pesar de estos alentadores resultados y el éxito inicial de antitumorales factor de necrosis alfa-terapias, curación definitiva de esta enfermedad es todavía insuficiente.

En el ínterin, los avances en el campo de metabolismo del ácido araquidónico y la rápida expansión de la base de datos sobre la versatilidad de la ciclooxigenasa (COX) y lipoxygenase (LOX), tanto en las enzimas fisiológicos y patológicos condiciones y, en particular, las dos caras enzima COX2, que no sólo sirve como un índice sensible de inflamación aguda en virtud de diversas circunstancias inflamatoria y en una variedad de células y tejidos, sino que también tiene prohealing y antiinflamatorios funciones [3], nos llevó a sospechar papel fundamental para COX2 en CD's clínica de fluctuación entre activos e inactivos fases . Por otra parte, investigaciones recientes sobre la vía lipoxygenase también ha arrojado resultados interesantes, entre ellas la conclusión de que lipoxins pueden servir de potente "endógeno señales de parada" en la inflamación in vivo [4, 5]. En esta línea, algunos autores llegó a sugerir la existencia de un interruptor de proinflamatorias 5-LO vía a proresolution 15-LO vía en el metabolismo del ácido araquidónico como beneficiosa counterregulation en la inflamación [5]. La mayoría de excitingly, estudios recientes han demostrado claramente una estrecha relación entre el metabolismo del ácido araquidónico y la inflamación intestinal, en el que investigadores demostraron dramáticos efectos terapéuticos de lipoxin análogos en la EII experimental [6, 7]. Todos estos conducido a nuestro estudio sobre las expresiones del cycloxygenases y lipoxygenases en CD, un intento de aclarar ciertos componentes específicos del ácido araquidónico que las vías de hecho en función de CD en vivo, y las interrelaciones entre ellos, con la esperanza de que estos datos eventualmente dar lugar a una mejor comprensión de la patogénesis de la CD y, por tanto, más eficaces tratamientos.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se utilizó muestras elegidas al azar de una base de datos de archivo de tejidos en el Hospital Jinling fecha entre 2003/1/1 a 2005/1/1 compuesto de 17 la enfermedad de Crohn y 11 especímenes de control intestinal, que se había fijado en el 10% formalina tamponada y embebidos en parafina . El diagnóstico de la CD se basa en bien redondeado examen de la historia, la evaluación endoscópica, hallazgos histológicos, adjutant y pruebas de laboratorio. El CD especímenes fueron de pacientes que se sometieron enteroctomy para CD-asociados fístulas intestinales u otras complicaciones serias en el Departamento de Cirugía General, Hospital Jinling. Las localizaciones anatómicas de la enfermedad de Crohn 17 lesiones fueron los siguientes: nueve distal ileums, seis íleon-colon anastomosis, y dos colones. Entre las once de control de especímenes, cinco de colon a partir de tejidos fueron ajenos margen de resección de la colectomía en los pacientes de cáncer de colon y el íleon seis especímenes fueron obtenidos por biopsia intestinal de las cuestiones más de 15 centímetros de aguas arriba el íleon o fístula al margen de resección de margen en ileuctomy los pacientes de fístula intestinal aguda causada por la embolia mesentérica. El CD pacientes tenían entre 14 y 56 años de edad (media ± DE, 32,9 ± 12,6 años), 8 eran hombres y 9 eran mujeres.

Los especímenes fueron en rodajas 3 μ m secciones y montado en silano revestido con diapositivas. Las diapositivas se deparaffinized en xileno y deshidratados a través de alcoholes clasificado. Las secciones se deparaffinized autoclave a 10 mmol / L de citrato de solución salina tamponada (pH 6.0) durante 20 minutos para la recuperación de antígenos. Peroxidasa endógena fue bloqueada por la colocación en las secciones 3% peroxidasa de hidrógeno en metanol durante 20 minutos. Después de un enjuague de fosfatos en suero salino tamponado (PBS), inespecífico vinculante fue bloqueada durante 20 minutos con el 4% de suero fetal bovino y 0,1% de azida sódica, 0,1% Tritón X-100, 0,3 mol / L de cloruro de sodio, y el 5% nonfat leche descremada. Las diapositivas se incubaron durante la noche en una cámara húmeda a 4 ° C con el principal anticuerpo monoclonal COX1, COX2 anticuerpo monoclonal, 5-lipoxygenase antisuero policlonal, y 15-lipoxygenase-1 antisuero policlonal (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EE.UU.) diluido al 1 : 200, 1: 200, 1: 300, y 1: 600, respectivamente, en común Antibody Diluent (BioGenex, San Rarron, CA, EE.UU.). Selección de diapositivas también se incubaron con primaria CD68, Vimentin, CK-pan, los anticuerpos monoclonales (Maixin_Bio, Fuzhou, China). Después de 3 enjuagues en PBS, las diapositivas se incubaron con biotina-segundo anticuerpo conjugado (Maixin_Bio, Fuzhou, China) durante 30 minutos a 37 ° C. Después de otros 3 enjuagues, las diapositivas se incubaron con streptavidina-peroxidasa (Maixin_Bio, Fuzhou, China) durante 30 minutos a 37 ° C. 3-3'-diaininobenzidine continuación se aplicó como un cromógeno. Después de enjuagar, las diapositivas se counterstained con hematoxilina de Mayer, deshidratadas, limpiado, y coverslipped. Controles negativos se establecieron mediante la sustitución de primaria de anticuerpos con el mencionado Común Antibody Diluent.

El inmunoticción fue evaluada independientemente por dos patólogos ciego al experimento de diseño, analizando la intensidad, superficie, y el patrón de inmunoticción. En presencia de una discrepancia, se llegó a un consenso después de una nueva evaluación. La tinción fue clasificado en una escala de cinco grados: 1 = negativo, 2 = sospechosamente positivos; 3 = débilmente positivo, 4 = moderadamente positiva; 5 = muy positivo.

El software de SPSS (SPSS / PC + 10,0, Chicago, Ill, EE.UU.) y muestras independientes-T prueba se utiliza para comparar las expresiones de los cuatro enzimas en CD's con lesión en los tejidos de control y valores de p de menos de .05 y .01 se consideró estadísticamente significativo y muy importante, respectivamente.

RESULTADOS

Tinción inmunohistoquímica con anticuerpos anti-COX-1, anti-COX-2, anti-5-LO, y anti-15-LO-1 anticuerpos

La característica más notable expresión de la ciclooxigenasa en CD especímenes se marcó el tanto de inmunoticción COX1 y COX2 en la enfermedad de Crohn úlcera. COX1 se expresó principalmente en microvasos y algunos fibroblastos-al igual que las células en la superficie de la región ulcerada, en tanto que expresión COX2 se limitaba a los fibroblastos-al igual que las células en la superficie de la úlcera de Crohn. Tras inmunoticción experimentos en serie diapositivas mostró que estos COX2-células positivas también expresó Vimentin, pero no CKpan o CD68, por lo que podría ser el de origen mesenquimal. COX1 esporádicas expresiones también fueron vistos en las células endo crine en criptas intestinales y algunos de la lámina propia de células mononucleares, mientras que el epitelio intestinal también expresó COX2 a variados grados. El inmunoticción de 5-LO es con mucho la más fuerte entre los cuatro hemos examinado las enzimas, que encuentra principalmente en la infiltración de neutrófilos, epitelios intestinales, y en algunos de la lámina propia de células mononucleares, linfocitos submucosa, y así sucesivamente; 15-LO-1 expresión se suele detectarse en los eosinófilos en lámina propia intestinal y en Crhon la úlcera así como a los granulomas.

La comparación cuantitativa entre los grados de expresión para los cuatro enzimas en la úlcera CD's, CD's epitelios y lámina propia y los que están en control de los especímenes se pone de manifiesto en la Figura 1.

Distribución espacial de COX2, 5-LO, y 15-LO-1 expresiones en la úlcera de Crohn

Las expresiones de los tres principales enzimas en ácido araquidónico vía seguida especial disposición espacial. La 5-LO neutrófilos son positivos en la mayor superficie de la úlcera, que formaban una banda oscura con límites claros. Justo debajo de ella, COX2 células positivas alineados, una vez más que forman una banda con límites claros. Por debajo de esta banda de COX2, hubo una coloración relativamente negativo región-los tejidos de granulación que consta de numerosos microvasos y linfocitos, y debajo de él, una banda formada por eosinófilos que altamente expresado 15-LO-1 fue visto. Como se muestra en la Figura 2, las expresiones de las tres enzimas más o menos formado anillos concéntricos en torno a la forma de "U" úlcera, con 5-LO en el interior, seguido de COX2, y 15-LO-1 en el anillo ultraperiféricas.

Hay varios detalles que vale la pena señalar. En primer lugar, tanto la 5-LO-expresando su banda de neutrófilos y COX2 banda había fronteras claras, y el ex terminado exactamente donde se inició la última, lo que sugiere un efecto inhibidor de COX2 en la migración de neutrófilos a la úlcera de superficie, así que sólo hemos podido ver nada dispersos neutrófilos por debajo de la banda de COX2, y casi ninguno en la banda de COX2. Por otra parte, COX2 banda situado entre la superficie de los neutrófilos y los ricos microvessel granulación región. Como estos son los microvasos sitios esenciales para el reclutamiento de neutrófilos, la COX2 banda parecía que se había formado una barrera que prevenir eficazmente la migración de neutrófilos de los vasos sanguíneos al sitio de inflamación aguda.

En segundo lugar, por debajo de la banda de COX2, había dispersos distribuciones de 5-LO-positivo neutrófilos en el buque-rica región de granulación y por debajo de las regiones, donde se unieron 15-LO-1-positivos eosinófilos. Al mismo tiempo, 15-LO-1-positivas eosinófilos agregados derecho de granulación por debajo de la región, formando un medio círculo en torno a la forma de "U" de granulación región (Figura 2 (e)]. Estos eosinófilos parece a formar otra barrera para impedir que los neutrófilos de la circulación periférica de infiltrarse más en submucosa y posteriores capas del intestino.

En tercer lugar, la mencionada tinción negativa región es rica en vasos sanguíneos y linfocitos. La existencia de numerosos linfocitos en la adyacencia muy aguda de inflamación indica que se trata de un sitio para el cebado de la inmunidad adaptativa y crosstalk entre innata y la inmunidad adaptativa.

DISCUSIÓN

La distribución espacial secuencial de 5-LO, COX2, y 15-LO-1 expresiones de la úlcera de superficie a las capas debajo coincide con los informes sobre los lípidos mediador clase de conmutación durante la inflamación aguda; en el que los autores demostraron temporalmente secuencial pantalla de LTB4, PGE2, LXA4 y en el exudado inflamatorio en un murino dorsal modelo de bolsa de aire [5]. Como 5-LO, COX2, y 15-LO-1 son los principales enzimas responsables de LTB4, PGE2, y LXA4 síntesis, respectivamente, la secuencia espacial de estas enzimas podrían traducirse en secuencia espacial de los metabolitos del ácido araquidónico. Pero, ¿cómo hace esta distribución espacial se correlaciona con la secuencia temporal? Como sabemos, mucosa intestinal es el principal sitio donde se encuentra el organismo los antígenos extraños en forma de alimentos o luminal bacterias, y así sucesivamente, por lo que es el sitio donde se inicia la inflamación y la úlcera de superficie representa la fase inicial de inflamación aguda, donde abundantes células inflamatorias agudas de neutrófilos-se acumulan. Por debajo, sin embargo, la tendencia general de localización de la inflamación y la cicatrización se manifiestan, y representa a la crónica y la resolución de las fases de la inflamación. Y al parecer, se necesita más tiempo para mediadores lipídicos de capas debajo de secretar hacia la luz como exudados. Por lo tanto, las conclusiones de este estudio en humanos CD lesiones no sólo confirmó los resultados de trabajos anteriores en la bolsa de aire murino modelo, lo que sugiere que los lípidos mediador clase de conmutación ser un mecanismo universal en la inflamación, en roedores o humanos, o en el intestino subdermal tejidos, pero señaló los tipos de células que generan estos lípidos así como mediadores. Además, la mucho más corto el intervalo máximo entre PGE2 y LTB4 formación y cuanto más largo sea el intervalo entre la máxima PGE2 y LXA4 la formación de exudados yuxtapone a la perfección con la distancia espacial entre las enzimas correspondientes a este estudio.

Otro punto importante es la clara frontera compartida de 5-LO-positivo banda de neutrófilos y COX2-positivas mesenquimales banda, y la barrera-como la adaptación de la COX2-células positivas entre los neutrófilos y la sangre de armadores de barcos de ricos por debajo de la región, lo que indica firmemente la el efecto inhibitorio de COX2 en transendothelial la migración de neutrófilos de la sangre periférica. Si bien muchos autores concluyeron que COX2 derivados de PGE2 amplificado inflamación aguda [3, 5], nuestro estudio apoya el papel de los antiinflamatorios COX2 y sus metabolitos. Como puede verse en la Figura 2, contrariamente a los resultados de estudios ex vivo utilizando periféricos neutrófilos en medio de diversos agonistas, por métodos inmunohistoquímicos, que puso de manifiesto que los neutrófilos participan activamente en inflamación aguda no expresar COX2. Teniendo en cuenta el hecho de que la PGE2 es dominante metabolito de COX2 mediada por la vía, especialmente en el intestino [8], es probable que la COX2-observó células positivas en CD lesión producida PGE2, que ejerce efectos inhibitorios sobre la migración y otras funciones de neutrófilos.

Hay mucha evidencia que soporta la COX2 propiedades antiinflamatorias. Gilroy y compañeros de trabajo puso de manifiesto que COX2, mediante la generación de PGE2, podría ser proinflamatorias durante la fase temprana de la inflamación, pero puede ayudar a la resolución posterior fase de generación de 15deoxy Δ [9 - 11] PGJ2 [3]. Aunque estos autores traducen sus resultados en proinflamatorias funciones de COX2 y la PGE2 en la fase temprana de la inflamación, otros se refirieron a inmunosupresores y antiinflamatorios funciones de PGE2 [9, 10, 12 - 14]. De especial interés es que el aumento de COX2 inhibición de la adhesión de leucocitos al endotelio vascular gástrico y la inhibición COX1 reducido el flujo sanguíneo gástrico [11], que está de acuerdo con nuestros resultados. En un H pylori gastritis inducida por el modelo murino, COX1 inhibidor SC-560 MPO actividad aumentada y apoptosis de las células epiteliales con la reducción de la producción de PGE2, mientras que los inhibidores de COX2 NS-398 tienen los mismos efectos sin que ello afecte a la producción de PGE2 [15]. En otros estudios, COX2 inhibición de genes o perturbación exacerbado la inflamación asociados a lesiones de colon en la colitis experimental [16, 17], y COX2 inhibición tenido sólo un antiinflamatorio eficacia en carragenina airpouch inflamación [18]. COX2 inhibición también puede inducir enteropatía [19] y los AINE retrasar la curación de la úlcera gastrointestinal [20, 21]. En este estudio, COX2 expresión se detectó únicamente en la región superficial en enfermedad de Crohn con úlcera insignificante expresión en otros tejidos intestinales. En conjunto, estos datos nos insto a ver COX2 en una nueva luz: la expresión inducida de COX2 en la inflamación no debe interpretarse como proinflamatorias su naturaleza, por el contrario, su inducción puede ser una parte de un mecanismo universal para counterregulate la inflamación y promover la cicatrización .

El mecanismo exacto de esta función inhibidora de COX2 en el reclutamiento de neutrófilos es difícil de alcanzar. Serhan y compañeros de trabajo puso de manifiesto que PGE2 inhibe LTB4 pero moviliza lipoxin A4 (LXA4) en la sangre periférica PMNs humanos [5], LXA4 bloques y la migración de neutrófilos a través de postcapillary venules de neutrófilos e inhibe la entrada en inflammed tejidos en modelos animales [22]. Por ello, es posible que los COX2-células positivas producido abundantes PGE2, y este último no sólo suprimió la producción de LTB4, pero LXA4 inducida por la producción en los neutrófilos y, a su vez LXA4, con su bien apreciada antiinflamatorio papel [4, 22 - 25], inhibe la migración de neutrófilos y ejerce otros efectos proresolution. De hecho, se observó que la 5-LO patrón de expresión en superficie de los neutrófilos fue ligeramente distinta de la que dispersas en los neutrófilos por debajo de la banda-COX2 la tinción fue más débil y los lóbulos núcleos son algo indistinto en la superficie de los neutrófilos. No se observó notable 15-LO-1 de expresión en estas células, lo que, sin embargo, no excluye la posibilidad de que el perfil eicosanoid está experimentando un cambio de los poderosos chemoattractant leucotrienos de la resolución-la promoción de lipoxins. Es interesante mencionar que lo hicimos encontrar 15-LO-1 en la expresión necrotized neutrófilos en el lumen intestinal justo encima de la capa de COX2 expresión. PGE2 puede también inhibir la migración de neutrófilos por otros inmunosupresores rutas, COX2 y otros metabolitos, especialmente PGD2 [26], e incluso los metabolitos de mecanismos independientes podrían tener un papel. Pero la bien apreciada antiinflamatorio 15deoxy Δ [9 - 11] PGJ2 no podrán haber participado en este proceso, debido a su falta de efectos sobre la adhesión de neutrófilos y de neutrófilos selectivo de quimioquinas expresión [27, 28].

Hubo una segunda barrera-como la estructura formada por 15-LO-1-expresando eosinófilos, que se encuentra justo debajo de la sangre de armadores de barcos de ricos región, que probablemente ha impedido que los neutrófilos de más de infiltración en los tejidos intestinales por debajo. La coexistencia de 15-LO-1-expresando eosinófilos y dispersas 5-LO-expresando enérgicamente neutrófilos indica las interacciones de estos dos tipos de células en transcellular biosíntesis de lipoxins, que eventualmente formaron una barricada contra la infiltración de neutrófilos. Estos resultados mostraron que el clásico transcellular ruta de biosíntesis de lipoxins podría tener lugar en enfermedad de Crohn úlceras en vivo, y lipoxins así formado podría ser el factor clave en la limitación de neutrófilos asociada a lesiones en los intestinos. Recientemente, pruebas de la dramática proresolution efecto de los análogos de lipoxin y resolvins está cobrando en la EII modelos, lo que sugiere una excitingly nueva solución para el problema de difícil tratamiento de la EII [6, 7].

Para mejorar la imagen de la enfermedad de Crohn úlcera, esta pieza de información se añade: LTD4 y 5-oxo-ETE, dos 5-LO metabolitos, son de eosinófilos chemoattractants [29]. De este modo, el típico proinflamatorias 5-LO vía tiene su propia retroalimentación negativa: mediante la contratación de los eosinófilos de sangre periférica y la submucosa intestinal a la lesión inflamatoria, transcellular biosíntesis de lipoxins y, en consecuencia, counterregulation de inflamación sea posible. Además, uno de los 15-LO, 15-hydroxyeicosatetraenoic inhibe directamente el ácido 5-LO [30].

Por último, los linfocitos de sangre y armadores de barcos de granulación región rica en úlcera de Crohn podría ser el sitio de crosstalk íntima entre la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa. COX-eicosanoids derivados, al igual que PGE2, y posiblemente lipoxygenase derivados de eicosanoids, podría modular de linfocitos el desempeño de sus funciones de diversas maneras [31], y, por tanto, la inmunidad innata es la reconfiguración de inmunidad adaptativa. Viceversa, citocinas secretadas por las células T, como la IL-1 β, IL-4, IL-10, IFN, TNF α, hasta podría-o abajo-COX2 expresión regular [32, 33], e IL-4 e IL-13 podría inducir 15-LO expresión en los macrófagos y [34 - 36]. Por lo tanto, es muy posible que crosstalk entre los dos sistemas inmunes se encuentra en proceso de granulación en la región por debajo de Crohn úlcera superficie. PGE2 tiene la tendencia de sesgar el sistema inmune hacia Th2 y Th1 fuera de la respolnses [31], así dysregulated metabolismo del ácido araquidónico y subóptima COX2 inducción a la inflamación daría lugar a la supresión de las respuestas Th2 y exagerada de las respuestas Th1, lo cual podría resultar en CD.

En resumen, este estudio demostró espacial interrelaciones entre los tres principales enzimas en el metabolismo del ácido araquidónico-COX2, 5-LO, y 15-LO-1 en enfermedad de Crohn úlcera, y mediante la combinación de datos procedentes de trabajos anteriores, hemos descrito interacciones entre las distintas células inflamatorias ácido araquidónico y las vías, todos los cuales forman parte de los eventos de varias inflamatoria reconocido como enfermedad de Crohn úlcera. Nuestros resultados indican funciones de protección de COX2 y 15-LO-1 en CD y una nueva esperanza para el tratamiento de la CD, a saber, mediante la mejora y el 15 de la COX-lipoxygenase-1 mediada por la inhibición de las vías y 5-lipoxygenase mediada vía.

Damos las gracias al Dr Charles N Serhan útil para los debates sobre sus obras y el Dr Xinhua Zhang para la asistencia técnica de inmunohistoquímica en los experimentos.