BMC Evolutionary Biology, 2006; 6: 74-74 (más artículos en esta revista)

Pérdida del flagelo ocurrido una sola vez en el linaje de hongos: estructura filogenética de Reino Hongos deducirse de la RNA polimerasa II subunidad genes

BioMed Central
Yajuan J Liu (yajuan@u.washington.edu) [1], Mateo C Hodson (machrisod@gmail.com) [1], Benjamin Hall D (benhall@u.washington.edu) [1]
[1] Departamentos de Biología y Ciencias del Genoma de la Universidad de Washington, Seattle, WA 98195, EE.UU.

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Resumen
Fondo

En la actualidad, no hay un consenso ampliamente aceptado opinión con respecto a la estructura filogenética reino de los hongos, aunque dos grandes phyla, y Ascomycota Basidiomycota, están claramente delineadas. En cuanto a la parte inferior hongos, y Chytridiomycota Zygomycota, una variedad de propuestas han sido avanzadas. Los microsporidios pueden o no ser hongos; las Glomales (micorrizas vesiculares-arbusculares hongos) pueden o no constituir un quinto filo de hongos, y la pérdida del flagelo puede haber ocurrido una o varias veces durante la evolución de hongos. Todas estas cuestiones pueden ser resueltas por un análisis filogenético molecular que logra fuerte apoyo estadístico para las principales ramas. Hasta la fecha, no por hongos filogenia molecular basado en caracteres se ha satisfecho este criterio.

Resultados

El uso de la traducción secuencias de aminoácidos de la RPB1 y RPB2 genes, hemos deducido una filogenia de hongos que consiste en gran medida de estar bien fundamentadas monofilético phyla. Nuestros principales resultados, cada uno con un peso significativo en el apoyo estadístico, son los siguientes: (1) Los microsporidios son a la hermana reino Hongos y no son miembros de Zygomycota, es decir, microsporidios y hongos procedían de un antepasado común. (2) Chytridiomycota, los hongos sólo filo con una etapa de desarrollo con un flagelo, es paraphyletic y es el linaje basal. (3) Zygomycota es monofilético sobre la base de muestreo de Trichomycetes, Zygomycetes, y Glomales. (4) Zygomycota, Basidiomycota, Ascomycota y forman un grupo monofilético independiente de Chytridiomycota. (5) y Ascomycota Basidiomycota se monofilético hermana grupos.

Conclusión

En general, este documento pone de relieve la posición evolutiva y la importancia de los hongos más bajos (y Chytridiomycota Zygomycota). Nuestros resultados sugieren que la pérdida del flagelo ocurrido sólo una vez durante las primeras etapas de evolución por hongos; en consecuencia, la mayoría de los hongos, a diferencia de las plantas y los animales, son nonflagellated. La filogenia se infiere a partir de secuencias de genes es el primero que es congruente con la amplia aceptación basadas en la morfología de la clasificación de hongos. Nos parece que, contrariamente a lo que se ha publicado en otra parte, los cuatro morfológicamente definidas phyla (Ascomycota, Basidiomycota, Zygomycota y Chytridiomycota) no se superponen entre sí. Los microsporidios no están incluidos dentro de Hongos reino, sino que son un grupo de hermanos a los hongos. Nuestro estudio demuestra la aplicabilidad de las secuencias de proteínas procedentes de grandes instalaciones, lentamente-la evolución de genes para la obtención del bien resuelto y muy apoyado phylogenies evolutivo a través de grandes distancias.

Fondo

El 9 + 2 flagelo es una importante característica de los organismos eucariotas [1]. De las tres corona eukaryote taxones, sólo los hongos en general, carecen de flagelos, tanto en forma vegetativa y sexual etapas. Entre los hongos más bajos, sin embargo, flagelado gametos se encuentran en un número de taxones. Estos organismos, casualmente, son los hongos que filogenéticos para determinar que es más problemático. Este documento se dirige a la meta de obtener una mayor firmeza el apoyo filogenia molecular con el fin de determinar si la pérdida de un solo evento puede haber sido responsable de la falta de flagelos en la mayoría de los hongos.

Los hongos son uno de los más antiguos y diversos grupos de organismos eucariotas [2]. Si bien sus restos fósiles prorrogar de nuevo a 600 mya [3], reloj molecular estimaciones lugar el origen de los hongos en o antes de 1,5 bya [4]. El reconocimiento, delimitación y tipificación de hongos han sido formidables problemas desde el descubrimiento de estos organismos. La presencia de quitina en la pared celular es un personaje común, pero no es exclusivo de hongos [5]. Muchos hongos son saprobes; otros son patógenos o simbiontes mutualistas de las plantas y los insectos [5, 6]. A pesar de esta gran variabilidad en forma y función, estudios sistemáticos sobre la base de la morfología y ciclo de vida producida, a mediados del siglo 20, un número manejable de las principales phyla. Ascomycota (levaduras y mohos), Basidiomycota (hongos, royas y obscenidades), y un número de taxones considerarse como formas más ancestrales constituyen el grupo de organismos que se consideraban verdaderos hongos [5].

Enfoques moleculares para el estudio de eukaryote evolución comenzó con el estudio de genes para las pequeñas (5 S), grande (18S y 28 S) moléculas de ARN ribosomal. Las principales contribuciones a principios de ADNr estudios a la circunscripción de la monofilético Reino Hongos puso de manifiesto que los organismos como Oomycetes (es decir, Phytophthora y Achyla) tenían poca similitud con los verdaderos hongos [7 - 11]. Posteriormente, estos organismos se han agrupado con las algas marrones y otros Stramenopila [12]. Por el contrario, ADNr estudios fueron los primeros en identificar Pneumocystis carinii, el agente infeccioso de SIDA asociados a la neumonía, como un hongo perteneciente a la Ascomycota [13]. Como hongos clasificación basada en las secuencias de ADN pasó a ser ampliamente utilizado herramienta taxonómica, secuencias de las moléculas de ARN ribosomal y sus secuencias fueron también demostrado ser útil para resolver muy estrechamente relacionados con especies fúngicas el uno del otro [14 - 16].

Una profunda comprensión de los hongos y sus interrelaciones exige el conocimiento de la topología de ramificación entre los grupos principales de hongos. Phylogenies de hongos sobre la base de secuencias de ADNr están ampliamente de acuerdo con la morfología de taxonomía basada en los conceptos y para Ascomycota Basidiomycota, pero no son coherentes con ellos para los primeros linajes de hongos, es decir, la Chytridiomycota Zygomycota y [9, 17 - 23]. Con pocas excepciones, las especies en Chytridiomycota han flagelado zoospores, cada uno en su hábitat nativo acuosa, mientras que Zygomycota, al igual que Ascomycota Basidiomycota y, sin son flagelos. Los estudios filogenéticos de Chytridiomycota Zygomycota y sobre la base de ADNr han encontrado repetidas veces que estos dos phyla se polifilético [20, 24, 25]. En concreto, Basidiobolus ranarum (Entomophthorales, Zygomycetes) consistentemente agrupado con el Chytridiomycota y es el más cercano a los miembros de Neocallimasticales mientras que otros miembros de la Entomophthorales están estrechamente relacionadas con Allomyces y otros Blastocladiales [20, 24, 25]. Un estudio más reciente, sobre la base de una combinación de 18S y 28S rDNA conjunto de datos de un menor número de taxones, llegó a una conclusión similar [23]. En ninguno de estos estudios fueron las conclusiones firmemente apoyado por los datos. El Glomales, un cuarto importante zygomycete taxón, salió como hermana a la ASCO-Basidiomicetos linaje [20, 23]. Otros estudios utilizando rDNA han elevado el Glomales a la posición de un quinto filo de hongos, Glomeromycota [23, 26 - 28]. Una interpretación literal de estos y otros estudios de rDNA podría llevar a cuestionar la validez de la tradicional subdivisión de hongos en basal y Chytridiomycota Zygomycota. Por esto plantea varias preguntas. ¿Hay estructurales, fisiológicas o genéticas atributos de rRNA genes que comprometer su utilidad para la determinación filogenética en el ordinal y categorías superiores? En caso afirmativo, ¿el árbol filogenético de hongos rRNA genes reflejan con precisión las relaciones organismal? Las respuestas a estas preguntas son esenciales para una comprensión general de hongos, de su historia evolutiva y del grado en que vegetativa y sexual etapas en sus ciclos de vida son homólogas. Por ejemplo, si Chytridiomycota es, en efecto, polifilético, esto significaría que flagelos se perdieron en varias ocasiones durante la adaptación evolutiva de los hongos de agua a la tierra.

Aunque la amplia mayoría de los estudios filogenéticos amplio de hongos se han hecho con ADNr, un trabajo similar con más limitado muestreo ha utilizado el genoma mitocondrial o, alternativamente, varios nuclear genes de codificación de proteínas, como la EF-1 α, pequeñas porciones de RPB1, y los genes de tubulina [9, 19, 20, 23 - 25, 29 - 31]. Ninguno de los estudios con estos genes de codificación de la proteína Glomales incluidos en la muestra. En general, los estudios moleculares sobre la base de estos genes o polifilético muestran Chytridiomycota paraphyletic a causa de la colocación de la blastocladialean chytrids con la Zygomycota. [9, 20, 23 - 25, 31]. Un reciente estudio filogenético mostró que, en general, hongos phylogenies sobre la base de EF-1 α secuencias fueron mal resueltas [31].

Para obtener una comprensión más completa de las relaciones entre los órdenes de hongos y phyla, hemos utilizado las secuencias de genes nucleares RPB1 y RPB2 a inferir una filogenia de estos organismos. Estos genes codifican la más grande (210 kd.) Y la segunda más grande (140 kd) de subunidades nuclear RNA polimerasa II. Debido a que estos genes tienen un papel funcional que es esencialmente general, transcribir todos los ARNm de codificación de los genes del núcleo, su evolución es muy limitada y lenta correspondientemente. En los estudios de otros hongos phyla [32, 33], RPB1 y RPB2 hecho posible el estudio profundo de las ramas filogenéticas con un alto grado de confianza. La resolución y el apoyo estadístico pone de manifiesto en RPB1 y RPB2 phylogenies, en comparación con los que ofrece la mejor alternativa disponible, ADNr 18S, se muestra por un tercer análisis que presentamos aquí. Por la misma taxones incluidos en el análisis filogenético RPB, han obtenido una filogenia 18S rDNA para la comparación.

La filogenética datos a través de Reino Hongos para RPB1 y RPB2 ha permitido a examinar otro informó de que la relación es de extrañar, que la de microsporidios a los hongos. Sobre la base de un análisis filogenético de α-y β-tubulina secuencias de genes, se ha propuesto que Los microsporidios son los hongos y que son un taxón hermana a determinados Zygomycetes [34, 35]. Esta conclusión debe ser evaluada cuidadosamente porque tubulins son especialmente susceptibles a los cambios convergentes. El macromolecular propiedades de tubulina que reflejen su secuencia de aminoácidos puede desempeñar un papel importante en determinar la forma de células, una propiedad que es muy variable entre los hongos más bajos. Elegimos, por tanto, a examinar la microsporidian RPB1 y RPB2 secuencias en relación con los de muchos taxones de hongos, para saber si la posición inferirse [35] para microsporidios en Reino Hongos pueden ser confirmadas.

Resultados
RPB1 y RPB2 secuencias en hongos

Taxa de cuatro hongos phyla con diversas estructuras reproductivas están incluidos en la muestra en este estudio (Figura 1]. Para cada taxón, secuenciado por lo menos 3,1 kb de RPB1 (AG) y 2,7 kb de RPB2 (3-11) (Figura 4]. Cuando la superposición de múltiples productos de PCR fueron secuenciados de los distintos taxones, no hubo pruebas para más de una copia de RPB1 o RPB 2 en la mayoría de las especies fúngicas examinados. Sin embargo, dos RPB1 genes con secuencias ligeramente diferentes se encontraron en Allomyces macrogynus, y dos copias RPB2 similares fueron detectados en Glomus mosseae, Neocallimastix frontalis, Allomyces macrogynus y Chytriomyces hyalinus. Dos secuencias RPB2 también fueron recuperados por una búsqueda de la secuencia genómica de Rhizopus oryzae [36]. Para aquellas especies con paralogous copias de genes, la diferencia porcentual en secuencia de nucleótidos oscilaron entre 2,2 a 9,8, mientras que las correspondientes secuencias de aminoácidos que había intraspecies variación de sólo 0,2 a 3,8%, ya que la mayoría de los nucleótidos diferencias entre ellos eran sinónimo sustituciones. En tanto el RPB1 y RPB2 análisis filogenéticos, paralogs de la misma especie, agrupados en estrecha colaboración (Figura 2], por lo que un solo RPB1 y un solo gen RPB2 fueron escogidos para cada una de estas seis especies que componen en el conjunto de datos combinados (Figura 3].

Codificación de las regiones del RPB1 y RPB2 genes de los principales taxones de hongos entran en un patrón muy distinto en lo que respecta a la composición base. Para tres de los phyla, el rango fue similar, siendo de 39 a 55% G + C para Ascomycota, 48 a 57% para Basidiomycota y 37 a 54% para Zygomycota (Figura 3]. En el Chytridiomycota la difusión fue mucho mayor, que van desde un número bajo de 33% G + C en Neocallimastix frontalis y un máximo de 66% a los miembros de Blastocladiales (Figura 3]. Estudios anteriores han demostrado que los análisis filogenéticos realizados por norma máxima verosimilitud o la distancia a base de algoritmos basados en las secuencias de nucleótidos dan los árboles de genes que difieren notablemente de unos a otros cuando la GC contenido varía mucho entre los taxones [37]. Por esta y otras razones, optamos por utilizar las secuencias de la proteína codificada para el análisis filogenético en este estudio.

Relaciones filogenéticas entre los principales linajes de hongos sobre la base de RPB1 y secuencias de proteínas RPB2

En los análisis filogenéticos con el predicho secuencias de aminoácidos de RPB1 y RPB2, la mayoría de los puestos informativos se basa en el criterio de parsimonia (Tabla 1]. El único árbol más parsimonious obtenidos a partir de RPB1, RPB2, o la combinación de datos es en cada caso en gran parte congruentes con los de análisis Bayesiano (Figuras 2 y 3]. El RPB1 y RPB2 phylogenies También se suele corresponder (Figura 2], con diferencias principalmente en lo que respecta a la ramificación en Taphrinomycotina y Chytridiomycota. En ninguno de estos casos es este aspecto de la topología muy apoyado (Figura 2].

La filogenia de análisis de parsimonia de la combinación de RPB1 y RPB2 de datos fue muy resuelto, como es el de inferencia bayesiana (Figura 3]. Nuestro criterio para estadísticamente significativa apoyo de un nodo individual requiere que el valor de arranque parsimonia ser> 70% y la probabilidad Bayesiana posterior, al menos, 0,95 [38]. Ambos métodos de análisis determinó que monofilético Ascomycota, Basidiomycota, Zygomycota y todos recibieron un decidido apoyo (Figura 3]. La mayoría de parsimonious árbol y el árbol de inferencia bayesiana son muy congruentes, ambos incluidos los árboles Glomales, Zygomycetes y Trichomycetes Zygomycota en el clado (Tabla 2, Figura 3]. En el SH prueba, la filogenia obtenida por análisis Bayesiano tiene la mayor puntuación entre lnL la prueba topologías, mientras que para la mayoría de parsimonious árbol lnL fue menor, pero no de manera significativa (Tabla 2, Figura 3]. Por lo que respecta a la monofilia de Zygomycota, menos probable la hipótesis alternativa de Glomales ser hermana a Dikaryomycota y la Zygomycota está paraphyletic no fue rechazada (Tabla 2, Figura 3].

Ascomycota como una hermana para Basidiomycota grupo había un fuerte apoyo (Figura 3]. Basal para el clado de Ascomycota Basidiomycota-(Dikaryomycota) fue monofilético Zygomycota, con un grupo altamente no uniforme morfología (Figura 3]. Apoyo para el nodo que separa Chytridiomycota de la clade de Zygomycota-Dikaryomycota fue notablemente fuerte (84% arranque, 100% Bayesiano, Figura 3].

Todos los phylogenies sobre la base de RPB1 y RPB2 indicó que se Chytridiomycota paraphyletic y que era el taxón basal de Reino Hongos (Figuras 2 y 3]. Dentro de los dos Chytridiomycota bien apoyado linajes: Blastocladiales, que se hermana a la Zygomycota-Dikaryomycota clade (Figura 3] y Chytridiales, la mayoría de clado basal de los hongos (Figura 3]. Monoblepharis era hermana ni a la Blastocladiales clado en parsimonia análisis o para Chytridiales en el análisis Bayesiano (Figura 3], mientras que Neocallimastix invariablemente ocupado una posición entre los clados de Blastocladiales y Chytridiales. Aunque phylogenies basado en secuencias de 18S rDNA han encontrado tanto Chytridiomycota Zygomycota y que se polifilético (Figura 2A], esta hipótesis alternativa es rechazada en nuestro SH criterio, basado en el conjunto de datos combinados de RPB genes (Cuadro 2]. Reino Hongos se apoya firmemente como un grupo monofilético (Figura 3]. Los microsporidios son hermana a los hongos en todos los phylogenies sobre la base de RPB1 y RPB2 secuencias (Figuras 2 y 3]. Todas las alternativas para las posiciones de microsporidios fueron rechazadas (Cuadro 2], con excepción de la posibilidad de que el grupo Los microsporidios con la mayoría de los miembros basal de Chytridiomycota (sin incluir Blastocladiales).

Nuclear 18S rDNA en secuencias de hongos

Para cada taxón incluidos en la muestra, se analizaron 1,8 kb (NS1-NS8) o más de 18S rDNA alineados. En el caso de stegomyiae la Coelomomyces 18S rDNA bp 2346 es largo y tiene muchas inserciones. El 18S rDNA contiene la alineación de las regiones fuertemente conservadas secuencia intercalados con breves regiones propensas a mayores tasas de sustitución. 18S rDNA nuclear mostraron una mayor tasa de heterogeneidad que hacer RPB1 y RPB2, según lo indicado por la mayor proporción de sitios invariables en el 18S rDNA (32% invariable sitios, Tabla 1], y el interior relativamente corto y largo ramas terminales de las ramas en el 18S rDNA filogenia (Figura 2A].

Relaciones filogenéticas entre los principales linajes de hongos sobre la base de secuencias de 18S rDNA

El 18S rDNA phylogenies inferirse Bayesiano Parsimonia o análisis fueron muy similares (Figura 2A]. Veintidós parsimonious la mayoría de los árboles se obtuvieron en el análisis de Parsimonia. En el 18S rDNA filogenia (Figura 2A], hubo un apoyo importante para la monofilia de ambos y Ascomycota Basidiomycota y una hermana de relación entre ellos. Estos resultados fueron consistentes con los RPB1 y RPB2 phylogenies. El principal conflicto entre el 18S rDNA y RPB1 + RPB2 phylogenies en cuestión las relaciones entre los miembros de Chytridiomycota Zygomycota y (Cuadro 3]. En el primer caso, ambos Chytridiomycota Zygomycota y se polifilético, con miembros de Zygomycota caer en tres clados. Uno de ellos, los Glomales, era hermana de Dikaryomycota, incluido otro de Mucor Zygomycetes y los miembros de Trichomycetes, mientras que en el tercer clado Basidiobolus de Zygomycetes se agrupan con los miembros de Chytridiomycota (Figura 2A]. Chytridiomycota se dividió entre dos clados, uno de ellos sea el Blastocladeales, y el otro entre ellos todos los demás miembros de Chytridiomycota y Basidiobolus de Zygomycetes (Figura 2A]. Ninguna de las anteriores relaciones filogenéticas en el 18S rDNA filogenia fue apoyada estadísticamente (Figura 2A].

Las pruebas de congruencia entre el gen 18S rRNA genes y RPB

Pairwise partición de pruebas de homogeneidad entre los tres conjuntos de datos se indica que ADNr 18S no era ni congruentes con la RPB1 ni RPB2 el conjunto de datos, mientras que el RPB1 y RPB2 conjuntos de datos son congruentes entre sí.

Se han comparado los principales clados entre phylogenies sobre la base de 18S rRNA genes y RPB y sus respectivos Bayesiano de arranque y apoyo valores para los nodos que subtiendan ellos (Tabla 3]. En nuestra RPB1 y RPB2 phylogenies, Chytridiomycota ha demostrado ser el taxón basal en los hongos y las propuestas de otros hongos con alto apoyo (Figura 3, 100% bayesiano y el 84% de arranque). Por lo tanto, la posibilidad de que Zygomycetes formaban parte de los primeros hongos linaje divergentes a lo sugerido por el 18S rDNA filogenia no se consideró aún más.

Los debates y la conclusión

Los genes más ampliamente utilizado para una amplia escala de hongos filogenia son, además de RPB1 y RPB2: EF-1 α, 5.8S, 18S y 28S rRNA genes. De ellos, el gen 18S rRNA más de cerca los enfoques RPB1 y RPB2 su eficiencia en la prestación de resolución filogenética a este nivel. En consecuencia, hemos incluido en este estudio para hacer posible una comparación directa de la resolución que ofrece, para facilitar las pruebas de congruencia entre el 18S rDNA y RPB y árboles para buscar cualquier bien mutuamente apoyados por los conflictos entre los dos.

Para rendimiento eficaz información acerca de lugares filogenia dos requisitos sobre los genes empleados. En primer lugar, debe haber suficiente variación de secuencias a través de la taxa estudiados para resolverlos. En segundo lugar, el grado de variación debe ser lo suficientemente bajo y lo suficientemente amplia para que distribuye múltiples cambios al mismo sitio será raro. Estas consideraciones implican que los estudios a través de largas distancias filogenéticos, como los que aquí se relacionan los principales taxones de hongos, son las mejores llevarse a cabo utilizando los genes con el lento pero apreciable tasas evolutivas.

El conflicto entre los conjuntos de datos, es decir, entre ADNr, RPB genes y otras proteínas de los genes de codificación como tubulins y EF-1 α, puede ocurrir por diversas causas. En primer lugar, el poder de resolución varía dependiendo del conjunto de datos. Por ejemplo, tanto rDNA y EF-1 α falta poder de resolución para interior ramas en el árbol debido a la falta de información y / o incertidumbre en la alineación [23, 31]. Por lo tanto, para muchas partes del árbol filogenético, la diferencia es entre un nodo que se resuelva con el apoyo de la RPB de datos frente a un no-resultado (polytomy sin resolver) o no para el nodo rDNA/EF-1 α datos.

En segundo lugar, el papel funcional del gen puede determinar su utilidad en filogenia. Neutral o casi neutral mutaciones que ocurren durante un largo período de tiempo en los genes en virtud de purificación de selección son la fuente más confiable de información filogenética. Las dificultades inherentes a los genes en la evolución adaptativa puede constituir un serio impacto en la rama de la topología de profundidad en una amplia escala filogenética estudio. Por ejemplo tubulins, elementos importantes en las estructuras celulares, pueden someterse a la evolución de adaptación a diferentes problemas ambientales en el curso de la evolución de hongos / especiación. No son buenos candidatos para estudios filogenéticos, especialmente para gran escala filogenia. Por el contrario, RPB1 y RPB2 han proporcionado la estructura básica de catalizador para ARN polimerasa II, una enzima que ha tenido la misma relación con su plantilla de ADN y ARN producto durante todo el lapso de eukaryote evolución.

Aunque las secuencias de ADN son útiles en la solución de la relaciones topológicas en las puntas de la filogenia, no son tan útiles como las secuencias de proteínas en la determinación de la topología de ramificación más profunda en un estudio de este tipo. Esto se debe a que, a lo largo de toda la gama de organismos que hemos estudiado, hay saturación de los cambios mutacionales en la 3 ª posiciones de los codones, con la consiguiente homoplasy si esta información está incluida. Si, para evitar ese problema, sólo el primero y segundo codón posiciones están incluidos, algunos datos se perderán, ya que ciertas 3 ª posición de hacer cambios debido a cambios de aminoácidos. El análisis de la secuencia de aminoácidos con un JTT matriz es el mejor solución no sólo porque elimina el ruido en 3 ª posición, sino también porque toma en cuenta las diferencias de presión selectiva ejercida por diferentes sustituciones de aminoácidos.

Chytridiomycota es paraphyletic basal y el taxón de los hongos

La determinación de la relación filogenética entre Chytridiomycota Zygomycota y es un tema central en la biología evolutiva de hongos y un controvertido. Se refiere tanto a la cuestión del filo que es basal en Reino Hongos y el modo de evolución del flagelo, la falta de que la diferencia de la mayoría de los hongos y metazoos flagelado protists. Los miembros del Chytridiomycota se consideran el linaje basal de los hongos, ya que, como metazoos, que utilizan glucógeno para almacenar energía y se han flagelado esporas (zoospores), pero, al igual que otros hongos, que tienen paredes celulares chitinous, aplanado mitocondrial cristae, y utilizar la AAA lisina vía de síntesis [39, 40].

El RPB1 y RPB2 phylogenies mostrar Chytridiomycota a ser el taxón basal en la Hongos (Figuras 2 y 3]. Chytridiomycota es paraphyletic en el combinado RPB1 y RPB2 filogenia y consta de dos grandes linajes; uno de ellos sea el Blastocladiales, incluidos los demás Chytridiales-Spizellomycetales-Monoblepharidales con Neocallimasticales como atípicas (Figura 3]. Estos resultados están en consonancia con las tradicionales morfológicas y ultraestructurales de estudios Chytridiomycota. Un análisis cladístico de la morfología del talo y ultraestructura mostró tres clados dentro de la Chytridiomycota: Blastocladiales, Neocallimasticales, y Spizellomycetales-Chytridiales-Monoblepharidales [41]. Un examen de ambos molecular y morfológica prueba identifica la línea que contiene la Monoblepharidales, Chytridiales y sus parientes cercanos como los más basal en Reino Hongos.

La transición del agua a la tierra que ocurrió sólo una vez durante la evolución de los hongos

Los miembros del Chytridiomycota puede existir en cualquiera de unicelulares o filamentosos. Ellos son los únicos hongos que se reproducen normalmente por la formación de zoospores flagelado como parte del ciclo de vida. Chytridiomycota se consideran acuáticos debido a que sus unwalled y flagelado zoospores exigir agua para la dispersión, aunque algunos de ellos han perdido a sus flagelos y producir en lugar de amebas zoospores (es decir, Amebochytrium).

Un ensamble que contiene todos los Ascomycota, Basidiomycota, Zygomycota y es un buen apoyo clado en estos estudios (Figura 3]. Todos los taxones dentro de ella la falta flagelos, en contraste con el Chytridiomycota que son principalmente flagelado. Por lo tanto, el flagelo se perdió como un solo evento, coincidiendo con la pérdida de 9 +2 microtúbulos centrioles, la aparición del huso polo organismo (SPB) como la organización de microtúbulos centro de mitótico y meióticas división nuclear y el cambio de acuosa a terrestre hábito de crecimiento .

Con la pérdida de células móviles, métodos alternativos de liberación de gametos y difusión evolucionado en los hongos. Ambos mitótico y meióticas esporas de actuar para facilitar a larga distancia de dispersión y la resistencia a condiciones ambientales adversas. Sporangiospores y zygospores formado internamente se mantienen en la mayoría de Zygomycota [42]. Nuevos mecanismos de conidium y meiospore formación y ballistosporic la aprobación de la gestión han evolucionado en los Ascomycota y Basidiomycota.

Zygomycota es monofilético con un importante apoyo estadístico

La unificación de Zygomycota características son las siguientes: la mayoría de coenocytic hifas (falta regular septation), formación de alta resistencia cigotos de la fusión de gametangia, y la ausencia de células y flagelado centrioles [5]. El Zygomycota constará de dos clases, los Trichomycetes y Zygomycetes [5]. Todos los miembros de Trichomycetes son obligately asociados con artrópodos que viven [43]. Tradicionalmente Zygomycetes consisten en muchos órdenes incluidas las Glomales, asexually reproducción de los hongos del suelo con gran esporas que forman Endomicorrizas con muchas plantas vasculares [27, 44, 45]. Anteriormente publicado molecular phylogenies sobre la base de ADNr, β-tubulina, y EF-1 α encontrado Zygomycota a ser no monofilético [9, 20, 21, 23 - 25, 27, 29, 34, 46, 47].

La filogenia inferirse en este documento de RPB1 y RPB2 secuencia de datos apoyado una monofilético Zygomycota que abarca Zygomycetes, Trichomycetes, y Glomales (Tabla 3 y Figura 3]. Un rasgo compartido derivados unir a los Zygomycota es la producción asexual de nonflagellate mitospores en esporangios (Figura 3]. Nuestro SH pruebas muestran que una monofilético Zygomycota incluidos Glomales tiene mayor probabilidad de que un clado de Glomales con Ascomycota Basidiomycota y, sin embargo, esta última hipótesis no es rechazada (Tabla 2].

La relación de microsporidios a los hongos

Los microsporidios son generalizadas, obliga a los parásitos intracelulares de animales [48]. La opinión de microsporidios que pertenecían a un antiguo grupo, los Archaezooans, que es anterior mitocondrial endosymbiosis se basó en el pequeño tamaño de sus ribosomas y su falta de típicos orgánulos eucariotas citoplásmica [49]. Los primeros estudios filogenéticos, utilizando secuencias de 18S rDNA microsporidial [50], EF-1 α y EF-2 [51, 52] también parece coherente con una divergencia muy temprana de este taxón. Otros análisis, sin embargo, atribuirse a esta conclusión a las altas tasas de divergencia en la secuencia 18S rRNA microsporidial y EF-1 α secuencias de genes y la consiguiente atracción rama larga, conduce a una asignación incorrecta de la posición filogenética [53 - 55].

Relación de los Hongos de microsporidios fue sugerido por posteriores estudios filogenéticos utilizando los genes RPB1, PDD, ATPasa vacuolar subunidad A, Valyl-tRNA sintetasa, 28S rDNA nuclear, y dos genes que codifican tubulins [53, 55 - 62]. Especializada características de la microsporidial RPB1 y EF-1 α genes microsporidios enlace a la "corona" eukaryote grupo [53, 63] y una relación a los hongos también es sugerido por la presencia de quitina en las esporas durante la reproducción de microsporidios. Pruebas sólidas en contra de la hipótesis Archaezooan llegó a partir de la comprobación, en el genoma de Encephalitozoon cuniculli, de los genes que son claramente de origen mitocondrial [58, 59, 62], lo que implica que una segunda pérdida de las mitocondrias se produjeron durante la evolución de microsporidios.

Si bien estudios anteriores sugieren una estrecha relación entre microsporidios y hongos, que dejó abierta dos posibilidades: o bien que microsporidios son un taxón en Reino Hongos o que Hongos y Los microsporidios son hermanos entre sí. Estos siguen abiertas porque, en el estudio inicial, no se incluyeron representantes de los dos basal taxones de hongos, y la Chytridiomycota Zygomycota [53, 55 - 62]. Un posterior estudio filogenético, sobre la base de α-y β-tubulina secuencias hizo incluir a representantes de los grupos basales de hongos y Chytridiomycota Zygomycota. La filogenia inferirse de estos datos colocan dentro de microsporidios Zygomycetes, en una situación próxima al Entomophthorales y Zoopagales [34, 35]. Debido al papel que desempeñan las proteínas tubulina en la determinación de células forma, existe una fuerte posibilidad de que en este caso, la afinidad entre microsporidios y Zygomycetes resultados de respuestas comunes al desarrollo o los problemas ambientales y no de ascendencia común. Entre los diferentes grupos de organismos, la tasa de cambio evolutivo de los genes de tubulina es muy variable. Por ejemplo, a los miembros de Chytridiomycota, secuencias de genes de tubulina son relativamente conservadas, mientras que tanto en Zygomycetes y microsporidios estos genes divergieron rápidamente [34, 35, 55]. Una probable consecuencia de esta diferencia de tasas es de larga rama atracción entre Zygomycete y Microsporidial secuencias.

Se ha propuesto por Cavalier-Smith [48] Los microsporidios que evolucionó a partir de harpellalean hongos (Trichomycetes). Tres taxa de Harpellales (Trichomycetes) y otros Zygomycota se incluyen en este estudio; pruebas SH rechazó la hipótesis de un harpellalean o zygomycete origen de microsporidios (Cuadro 2].

Los resultados que hemos obtenidos demuestran definitivamente que microsporidios ocupar una posición filogenética fuera de Reino Fungi. Phylogenies inferirse de RPB1, RPB2, y sus secuencias de todos los combinados muestran que microsporidios son la hermana taxón a los hongos (Figuras 2 y 3]. En contraste con todas las demás asociaciones filogenéticas sugerido anteriormente para microsporidios [34, 35, 64], este recibe un excelente apoyo estadístico de los datos. Las nodo tiene 100% de probabilidad Bayesiana posterior y el 99% de apoyo bootstrap en la Figura 3. Pruebas estadísticas de diversas alternativas derivaciones de microsporidios (SH prueba, el cuadro 2] no sólo rechazó la hipótesis de un origen de microsporidios en Zygomycota, pero también rechazó una estrecha relación, ya sea a Dikaryomycota o para Metazoa.

Nuestros resultados sugieren que la pérdida de sus flagelos y microtúbulos 9 +2 estructura en los miembros de microsporidios es un caso aparte de la pérdida caso que llevó a Zygomycota, y Ascomycota Basidiomycota. Contemplamos el ancestro común de Hongos, Los microsporidios y metazoos como unicelulares, flagelado Nutrición heterótrofa, sobre la base de comparaciones entre basal hongos, microsporidios, metazoos basal y sus grupos asociados como Choanoflagellates. Nuestros resultados sugieren que la pérdida del flagelo ocurrido en un solo punto en la evolución de los hongos que permiten la deriva por hongos phyla de adaptar el medio acuático a uno terrestre.

Métodos
Materiales

Cincuenta y ocho taxa se utilizaron, entre ellos cuatro microsporidios, nueve miembros de Chytridiomycota, ocho zygomycetes, nueve basidiomicetos, treinta y dos ascomycetes. Como outgroups, diez taxones de animales, plantas y protists se incluyeron en los análisis. Estamos incluidos en la muestra cuatro de las cinco órdenes de la Chytridiomycota, así como cuatro órdenes en representación de todas las clases de Zygomycota [5]. Las fuentes de cepas de hongos y GenBank números de adhesión nuclear 18S rDNA, 1 y RPB RPB 2 secuencias de genes se enumeran en el cuadro complementario [véase la archivo adicional 1]. Las diversas estructuras reproductivas de algunos representantes de los principales linajes de hongos se muestran en la Figura 1.

Las técnicas moleculares y los análisis filogenéticos

Los métodos de cultivo de hongos, aislamiento del ADN, amplificación por PCR, clonación y secuenciación del ADN se han descrito [65]. Primers NS1 a través de NS8 se utilizaron en este estudio para ampliar nuclear rDNA 18S [66]. El conjunto general de oligonucleótidos utilizados en este estudio para amplificar regiones de la A a la G, de RPB1 y las regiones 3 al 11 de RPB 2 genes se enumeran en la Figura 4. Todos los pares de cebadores se utilizaron en la primera amplificación por PCR. Por RPB1, Dfor y Frev suelen funcionar bien en la mayoría de los hongos. Especies primers específicos fueron diseñadas en el DF y la región junto con Afor y Grev para posteriores ampliaciones de algunos hongos (Figura 4]. Por RPB2, las regiones 5-7 y 7-11a se suelen amplificado por PCR fácilmente. Especies primers específicos fueron diseñados en la región de 5-7 y emparejado con 3bF, 3.1f-adaptador, 3.2F-adaptador y 11aR para posteriores ampliaciones de algunos hongos (Figura 4]. Para ciertos hongos, PCR anidado con el primer adaptador de secuencia y de las especies de primers específicos se realizaron para amplificar la región de 3-5 RPB 2.

Las secuencias de nucleótidos del 18S rDNA nuclear y las secuencias de aminoácidos de RPB1 y RPB2 traducido de secuencias de ADN fueron alineados utilizando Clustal X [67], con la consiguiente ajuste visual, por lo que en 2388, 1119 y 944 puestos alineados, respectivamente, incluidas las lagunas. Las regiones que no pueden ser alineados con fiabilidad se retiraron dejando un total de 1739 puestos de ADNr 18S, 1061 puestos de RPB1 y 901 posiciones para RPB2 para su uso en los análisis filogenéticos. Inferencia bayesiana y la máxima parsimonia análisis filogenéticos se llevaron a cabo para 18S rDNA, RPB1, y RPB2 individual, y para el conjunto de secuencias de proteínas. Para detectar topológica incongruencia entre los datos de particiones 18S rDNA, RPB1 y RPB2, pairwise partición de pruebas de homogeneidad entre los tres conjuntos de datos se llevaron a cabo usando PAUP * 4.0b10. [68] con parsimonia y criterio de búsqueda heurística (10000 repeticiones).

El modelo de selección, el Criterio de Información de Akaike (AIC), se utilizó para calcular el ajuste óptimo para el modelo utilizando métodos Bayesianos MODELTEST 3,7 [69, 70]. Un tiempo general reversible (GTR), incluido un modelo de invariante sitios y una distribución gamma parámetro fue seleccionado como el mejor ajuste para el modelo 18S rDNA conjunto de datos. Para cada conjunto de datos, análisis Bayesiano filogenética con la cadena de Markov Monte Carlo (MCMC) el muestreo se realizó utilizando MrBayes v3.1 [71]. Seis independiente corre MCMC se llevaron a cabo utilizando el modelo GTR para la sustitución de nucleótidos y JTT modelo de sustitución de aminoácidos. Además, la proporción de sitios invariable y una distribución gamma de parámetros para permitir la tasa de heterogeneidad entre los sitios (seis categorías) y uniforme antes de probabilidades y topologías de árboles se llevaron a cabo en los análisis. Las seis carreras incluyó una carrera con 3 × 10 6 generaciones, dos carreras con 2 × 10 6 generaciones y tres carreras en contra y 1 × 10 6 generaciones para garantizar un número suficiente de generaciones y de toma de muestras de la misma probabilidad posterior paisaje. Cada plazo se inició con los árboles al azar para cada una de las cuatro cadenas simultánea, como resultado concordante conjunta posterior distribuciones de probabilidad para la topología. El muestreo se realizó cada 100 ª generación para cada plazo. Las muestras antes de la convergencia de la cadena de Markov se han descartado para cada plazo. El resto de las muestras de cada ejecución se combinaron en un solo archivo, con un total de 97830, 98095, 98876, 98970 y árboles filogenéticos para los conjuntos de datos de ADNr 18S, RPB1, RPB2 y combinado RPB1 y RPB2, respectivamente. Estos fueron importados en PAUP * 4.0b10 para calcular el 50% el gobierno de la mayoría de árboles consenso. Los porcentajes de las ramas en el árbol de consenso representan el Bayesiano posterior probabilidades son que el equivalente aproximado de una búsqueda de máxima verosimilitud con bootstrapping [71]. El árbol de consenso resultante de los análisis Bayesiano para cada conjunto de datos fue evaluada para la rama usando longitudes TREE-PUZZLE 5,0 por algoritmo de máxima verosimilitud con una distribución gamma-, el modelo GTR de nucleótidos y la sustitución de JTT modelo de sustitución de aminoácidos [72].

Parsimonia los análisis se realizaron utilizando PAUP * 4.0b10. [68] con la igualdad de pesos para las secuencias de ADNr 18S y una matriz ponderada paso de convertirse JTT la matriz [73, 74] para RPB1, RPB2 y su conjunto de datos combinados. Las deficiencias fueron anotadas como desaparecidas. La búsqueda heurística usando el azar Además de taxón opción se realizó con 1000 repeticiones para aumentar las posibilidades de encontrar todos los parsimonious la mayoría de los árboles. Para evaluar la fuerza de las conclusiones filogenéticas, 500 repeticiones de arranque parsimonia se realizaron mediante la búsqueda heurística con la adición de azar taxón opción (10 veces por repetir).

Con el fin de probar otros hipótesis filogenéticas, los análisis se realizaron utilizando PAUP para construir la mayoría de parsimonious árboles bajo la condiciones limitadas, y los árboles resultantes fueron evaluados junto con la mayoría de parsimonious árbol y el árbol de la inferencia bayesiana en TREE-PUZZLE 5,2 usando el SH criterio, basado en el conjunto de datos combinados de RPB1 y RPB2 [72, 75]. TREE-PUZZLE 5,2 incorpora la matriz de JTT para las sustituciones de aminoácidos y gamma-distribuido tasas para permitir la tasa de heterogeneidad entre los sitios. La distribución gamma parámetro α de 0,33 fue estimada sobre la base de nuestro conjunto de datos combinados de RPB1 y RPB2. Ocho tasa categorías fueron utilizados en los análisis.

Abreviaturas

RPB1: la subunidad más grande de ADN nuclear dependiente de la RNA polimerasa II

RPB2: la segunda más grande de la subunidad de ADN nuclear dependiente de la RNA polimerasa II

rRNA: RNA ribosomal

rDNA: ADN ribosomal

EF-1 α: traducción alargamiento factor 1 α

Autores de las contribuciones

YJL llevó a cabo el diseño de este estudio, la adquisición de datos, la alineación de secuencias, y se lleva a cabo la filogenética y análisis estadísticos. YJL también interpretó los datos, redactado y revisado el manuscrito. SMI participó en la clonación molecular y la secuenciación y anotada intrón posiciones de ciertos genes. BDH participado en su diseño y ha participado en la escritura manuscrita. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Material complementario
Archivo Adicional 1
Cuadro Suplementario
Las muestras utilizadas en este estudio y el GenBank números de adhesión para su RPB1,
RPB
2 y 18S rRNA secuencias de genes.
Agradecimientos

Estamos agradecidos al Dr Howard Whisler y el doctor Joseph Ammirati para comentarios sobre el manuscrito. Damos las gracias a Ellen Duffield de asistencia con hongos culturas, el doctor Scott Baker para búsqueda en bases de datos de secuencias del genoma Syngenta de Fusarium y Botrytis, el doctor Lijun Ma base de datos para la búsqueda de genoma del Instituto Broad secuencias de Rhizopus, y D. Kari Fitzsimmons para la clonación molecular y secuenciación de algunos de los genes RPB1. Esta investigación fue apoyada por las patentes ingresos de regalías a la Universidad de Washington de Washington Research Foundation.