Nucleic Acids Research, 2006; 34(15): 4216-4224 (más artículos en esta revista)

Mecanismos de un anillo en forma de helicasa

Oxford University Press
Ilker Donmez, Smita S. Patel [*]

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Resumen

Bacteriófago T7 helicasa (T7 gen helicasa 4-primase) es un miembro prototípico de la forma anular de la familia helicases, cuya estructura y mecanismos bioquímicos han sido estudiados en detalle. T7 helicasa monta en un homohexameric anillo que se une un solo ADN hundidos en su canal central. El uso de Reca-tipo de nucleótidos y vinculante de detección motivos, T7 helicasa y se une hidroliza varios PNT, entre los que dTTP apoya óptima de proteínas de montaje, el ADN y vinculante anulación actividades. Durante la translocación único varados a lo largo de ADN, las subunidades del anillo a través de ciclos de hidrólisis dTTP uno a la vez, y esto probablemente ocurre también durante la anulación de ADN. Es interesante señalar que la anulación de velocidad T7 helicasa es un orden de magnitud más lento que su tasa de translocación único varados a lo largo de ADN. La lenta tasa de anulación es estimulado en gran medida cuando la síntesis de ADN T7 ADN polimerasa se une al ADN anulación. El uso de la helicasa T7 a modo de ejemplo, destacamos los resultados de crítica y discutir posibles mecanismos de acción de la helicasa.

INTRODUCCIÓN

La forma estable de ADN en la célula es el doble hundidos cuyos complementarias existir como annealed el uno al otro para garantizar la estabilidad de la información genética almacenada. Con el fin de utilizar la información codificada en la secuencia de ADN, los distintos capítulos necesidad de ser abierto. Helicases son las enzimas que catalizar este capítulo separación de reacción utilizando la energía de NTP vinculante y la hidrólisis (1 - 3]. El carácter fundamental de esta reacción y la exigencia de helicases en el metabolismo celular y la propagación de hacer helicases componentes esenciales del proteoma celular. De hecho las mutaciones en muchos helicases dar lugar a enfermedades humanas como el cáncer y el envejecimiento prematuro (4, 5].

A pesar de la separación de las ramas de un dúplex de ADN para la replicación, reparación y recombinación es la más común la reacción catalizada por helicases, estas proteínas actúan también durante la transcripción, traducción, empalme y en diversos procesos que requieren la reorganización estructural de los ácidos nucleicos o ácido nucleico-proteína complejos (1 - 3, 6]. Esta es probablemente la razón por la cual las mutaciones en helicases dar lugar a enfermedades no relacionadas patológicamente. Tan diversos como sus funciones fisiológicas pueden ser, muchas de las actividades de helicases puede explicarse por la capacidad de helicases a translocate a lo largo de los ácidos nucleicos como motores de ácido nucleico. Algunos helicases tienen la capacidad de translocate a lo largo de largos tramos de ácido nucleico, mientras que otros operan dentro de sólo unas pocas bases.

Los avances en la comprensión del papel de helicases proceden de la identificación de nuevas proteínas con funciones helicasa, su caracterización, la correlación de sus mutaciones con las enfermedades y la obtención de nivel molecular a través de detalles estructurales, bioquímicos y biofísicos métodos. En esta revisión, nos centramos en el mecanismo de un anillo en forma de helicasa de bacteriófago T7. Tenemos el esquema estructural común de aclarado temas de diversos grupos y discutir nuestra interpretación de los hallazgos bioquímicos con el objetivo de construir un modelo de trabajo de cómo el ADN anulación es catalizada por la presente miembro del anillo en forma de clase de helicases.

INSIGHTS ESTRUCTURALES
Cuaternario organización

Bacteriófago T7 códigos para la mayoría de las proteínas que requiere para la replicación de su genoma (7]. T7 GP4 transcripción de genes codifica para dos proteínas: gp4A, la larga duración del producto GP4, ha primase helicasa y las actividades y gp4B, una proteína truncada que el resultado de una traducción iniciación a la metionina codón 64 en la secuencia de codificación GP4, sólo ha helicasa actividad (8 - 11]. La actividad helicasa no se puede distinguir en las dos proteínas (12, 13] y, por tanto, por lo general se refiere a como T7 helicasa. En presencia de dTTP, T7 helicasa monta en un anillo en forma de hexamer un anillo con diámetro de 13 nm y un canal central de diámetro de 2,5 nm de acuerdo a estudios de microscopía electrónica (14]. Estas dimensiones, aunque adecuado para la celebración de ssDNA en el centro del anillo, también puede acomodar dsDNA (15]. Crystal estructuras revelan que los cofactores de nucleótidos se unen a las interfaces entre los monómeros (16, 17]. Además de esta pequeña región de interacción, cada subunidad hace la mayoría de sus contactos con una subunidad de vecinos intercalante uno de sus hélices en una hélice conjunto de los vecinos subunidad (16, 17].

El anillo en forma de T7 helicasa muestra dramática flexibilidad estructural y la hexamer puede apartarse de un 6 veces estructura simétrica (17]. Las subunidades del anillo puede adoptar diferentes conformaciones relativa en función de sus nucleótidos ligadura de estados (17]. T7 helicasa anillo adopta una conformación más compacta cuando se une el ADN y dTTP (18]. Un total de siete por tres estructuras diferentes helicasa fragmentos se han resuelto (16, 17, 19]. La estructura de gp4D, un fragmento de dominio helicasa, se resolvió como trimer y modelado como un anillo en forma de hexamer (17]. Los 56 kDa gp4B proteína (G317V, K318M) cristalizado como un anillo en forma de heptamer (19] y un corto fragmento de dominio helicasa cristalizado como un filamento helicoidal (16]. Esta flexibilidad, junto con la tendencia del anillo de subunidades para formar estructuras asimétricas anillo hace factible la apertura de un mecanismo de auto-montaje de alrededor de ADN. De hecho, estudios bioquímicos indican que la helicasa preformados anillo de ADN vincula a través de un mecanismo de anillo de apertura (20]. Si la ruptura de la helicasa anillo persiste después de que el anillo se monta en torno a la ADN y la forma en que afecta su processivity y translocación de anulación no se conocen.

La conclusión de que T7 helicasa puede existir como un anillo heptameric plantea cuestiones interesantes en cuanto a su importancia biológica. Se ha sugerido que la helicasa heptameric ampliada con su canal central podría ser la forma que a lo largo de translocates dúplex de ADN que forma los hexameric sólo puede translocate a lo largo de ssDNA (19]. Un estudio reciente ha demostrado que la fracción de heptameric anillos es mayor en presencia de dTDP, y hexamers siguen siendo la especie dominante en presencia de dTTP (21]. Por otra parte, el heptameric especies no se une al ADN de manera eficiente, a pesar de que la subunidad adicional podría tener un papel distint en la asamblea de la helicasa anillo alrededor de ADN.

Monómero veces

Helicases posee una topología de dominio que es similar al de la proteína Reca (22 - 24]. De obligar a un nucleótido, helicases emplear todos los Walker A (P-loop) y B motivos, además de un número variable de otras secuencias de la firma. En cada subunidad T7, dos residuos de aminoácidos (R504, Y535) están involucrados en el apilamiento de nucleótidos base y alrededor de cinco (S314, G317, K318, S319, T320) de la Walker Un motivo de contribuir a la estabilización o la coordinación de los cargos en los grupos fosfato de nucleósidos (Figura 1A]. D424 de la B Walker motivo actos como el principal estabilizador de la Mg 2 + ion. Se ha propuesto que un residuo (E343) sirve como el iniciador de la hidrólisis, otro (H465) es un componente crítico de la conexión entre el puente de nucleótidos del ADN y sitios de unión (Figura 1B] y arginina dedo (R522) participa en la coordinación la inter-subunidad cooperativity (16, 17, 25]. Entre estas, las funciones críticas de R522, K318, D424 y E343 han sido corroboradas a través de mutagénesis dirigida sitio (25 - 28].

T7 helicasa hidroliza varios PNT, pero es sorprendente que sólo apoya anulación dTTP (29]. ¿Cuál es la base para la discriminación de otros dTTP de nucleótidos (12)? Parece que el 2'-OH grupo de ribosa podría desempeñar un papel desde ribonucleótidos son especialmente desfavorecidos (UTP dTTP versus, versus ATP dATP). Sin embargo, las razones para la función inhibidora de la 2'-OH grupo y la base de especificidad no están claras.

Una estructura del anillo con el ADN helicasa obligado sigue siendo un reto importante como el modo de unión a ADN es la clave para el mecanismo que emplea a helicasa translocate para relajarse y ADN. Aunque los estudios están en consonancia con el ADN obligatorio en el canal central del anillo, la exacta residuos que unen el ADN no se conocen. Mutagénesis y estudios bioquímicos han identificado las regiones y los residuos que son posibles candidatos para la interacción con el ADN. Mutación de la R487 o tres Lysines K467, K471, K473 y se muestra a un compromiso vinculante de ADN (27, 30]. Además secuencia y análisis de la estructura de motivos se indica que el H4 y tres bucles (424-439, 464-475, 503-513) que se enfrentan al canal central del anillo podrían participar en el ADN obligatorio (17] (Figura 1C, verde subunidad ).

Mecanicista RESULTADOS
Vinculante de nucleótidos e hidrólisis

T7 helicasa hexamer cuenta con un total de seis sitios de unión de los nucleótidos. Cooperativa de interacciones entre los protomers son observables como el sitio activo por la unión y la hidrólisis de nucleótidos reside cerca de una hendidura entre las subunidades. Bioquímicas estudios indican que tanto en la ausencia y en presencia de ADN, una hexamer es capaz de obligar a un máximo de cuatro dTTPs (31]. El <6 nt vinculante observado se atribuye a la negativa cooperativity también se observa en otros hexameric helicases (29, 32 - 35]. Pre-el estado de equilibrio cinético análisis ha demostrado que hidroliza T7 helicasa ~ 4 dTTP / hexamer (32]. Tener un sitio catalítico número superior a los tres disminuye la probabilidad de que algunos sitios no catalítica en todo momento, como podría haber sido en analogía con el F1 ATPasa (36, 37]. Por lo tanto, se ha propuesto que la NTPase ciclos de propagar a través de los seis helicasa subunidades. El lento paso durante cada ciclo de dTTP hidrólisis es la liberación de Pi a saturar dTTP concentración de nucleótidos y vinculante a bajas concentraciones de dTTP (32, 38]. ADN obligatorio dTTPase estimula la tasa de incrementar tanto la dTTP hidrólisis y la liberación las tasas de Pi (32]. Una mirada más cercana a un solo ciclo NTPase revela que el acto de translocating ADN se realiza en el acoplamiento dTTP paso, cuando la primera unión de los nucleótidos es seguido por un cambio conformacional en la subunidad helicasa que redundaría en un fortalecimiento del carácter vinculante de dTTP (32] . De este modo, la energía de hidrólisis dTTP los ciclos que se utiliza para mover el ADN proviene de la dTTP vinculantes y medidas del producto en lugar de venir directamente de la hidrólisis de paso, paralelamente a la observación en otro hexameric helicasa (39].

El número de concebir mecanismos para completar un ciclo de NTP hidrólisis es grande si la evolución espacial y temporal de regulación de seis subunidades se considera (Figura 2]. Cinética y estudios de simulación han determinado el número de subunidades que participan en dTTP hidrólisis y la naturaleza cooperativa de hidrólisis en las subunidades del anillo. Un mecanismo estocástico de dTTP hidrólisis o disparando al azar por el anillo de subunidades fue eliminado como un posible mecanismo debido a la intoxicación experimentos mutante (30, 32]. Los datos experimentales, así como el modelado computacional de apoyo parcial o una estricta orden secuencial para la hidrólisis dTTP ciclos (30, 32]. Como los ciclos dTTPase propagar a través de cada subunidad, se propuso que el ADN de una subunidad se transfiere al siguiente, mientras que el resto de sus subunidades recarga dTTP estados y prepararse para su turno.

De interés es el arreglo espacial de subunidades que están siguiendo unos a otros en el mecanismo secuencial (Figura 2]. Las estructuras de los diferentes estados conformacionales de un anillo en forma de helicasa en el proceso de hydrolyzing NTP o translocating ácido nucleico todavía no se han caracterizado. Se puede postular que el movimiento direccional del ácido nucleico se logra mediante la polar vinculante de la helicasa a los ácidos nucleicos y de la direccionalidad de la helicasa de dominio mociones que podrían actuar como trazos de energía. De hecho, una de las estructuras de T7 helicasa resuelto proporciona pistas para estas mociones de dominio (17]. Encuadernación de NTP produce una rotación de 15 ° de que las subunidades (Figura 1D]. Así, entre los seis protomers algunos serán rotados uno respecto al otro, mientras que otros se rotan en la dirección opuesta para mantener cerrada la conformación del anillo. Análisis estructural indica que la dirección de la rotación obligatoria cuando NTP no encuadernado de un estado es hacia el N-terminal de parte del anillo (visto desde el interior del canal) (17]. Junto con la observación de que la PNT-estado tiene una mayor afinidad por el ADN (31] y que NTP de acoplamiento es el poder paso accidente cerebrovascular (32], esto implica que los 5 'finales de filamento de la DNA debe ser frente a la carretera N-terminal lado del canal, a fin de extrusión de ese lado. Esto es coherente con los 5 '→ 3' direccionalidad de la helicasa y translocación de que el N-terminal primase sitio senderos a los 5 'finales del ADN (14]. Según este modelo, el ADN se pasó de una subunidad NTP obligado a los vecinos que los suministros de dedo de arginina (17]. De este modo, una mano fuera entre dos subunidades vecinas es el más probable secuencia (Figura 1C y D].

Translocación a lo largo de ADN

Aunque no hay consenso sobre un mecanismo detallado anulación de helicases, unidireccional translocación de la helicasa a lo largo de ssDNA debe desempeñar un papel fundamental en el proceso de anulación de la mayoría de los helicases. Las comparaciones entre la translocación parámetros, especialmente el tipo de cambio, y los de anulación proporcionan importantes pistas sobre los mecanismos utilizados por helicases para separar complementarias. Tan importante como es, no existe una forma sencilla de medir tasa de translocación y processivity. La razón es que helicases puede obligar a cualquier lugar en un ácido nucleico y algunos función de distribución tiene que ser asumido. También un helicasa puede comportarse de forma distinta en los extremos del ADN, lo que aumenta la complejidad de los análisis. Además, las posibles estructuras secundarias de ssDNA deben tenerse en cuenta para evitar cualquier tipo de complicaciones.

T7 helicasa es capaz de viajar a lo largo de ssDNA con una velocidad comparable con la tasa de anulación en vivo, y se constató que se mueve alrededor de tres bases por dTTP hidrolizado (40]. Su processivity (probabilidad de hacer un paso adelante en oposición a disociar del ADN) es prácticamente 1. La anulación de los parámetros T7 helicasa en dsDNA, por otra parte, están muy por debajo de sus valores óptimos (41]. T7 helicasa unwinds unas 10 veces más lento, y tiene un processivity que puede bajar a 0,9 en función de la secuencia de propiedades del ADN. La razón de un ritmo más lento de anulación dúplex de ADN en contraposición a lo largo de la translocación ssDNA probablemente radica en la tendencia del ADN para permanecer varados doble. Clausura de la complementarias pueden actuar como una fuerza para oponerse a ralentizar la helicasa, que es coherente con la observación de que la tasa de defectos y processivity se incrementan con el aumento de GC contenido en el ADN (I. Donmez, YJ Jeong y Patel SS, no publicados datos).

Modelos de ácido nucleico anulación

Después de haber una clara línea de separación actividad requiere la helicasa de interactuar no sólo con el capítulo que es a lo largo de translocating, sino también con los desplazados capítulo o tal vez con el ADN dúplex cerca del cruce. Alta resolución estructural información no está disponible para cualquiera de los modos de ADN vinculante de T7 helicasa, y estudios bioquímicos no han detectado fuertes vinculante para ambas vertientes del ADN o de dsDNA. El capítulo de exclusión modelo o cuña modelo es más coherente con los datos disponibles y que postula que el anillo interactúa principalmente con el capítulo de ADN, y ya que translocates a lo largo de ese capítulo, se excluye la línea complementaria de su interior canal (Figura 3A]. La fuerza direccional de producción a lo largo de la translocación ssDNA puede dar lugar a la separación de las hebras complementarias de ADN sin invocar base de un elaborado mecanismo par de fusión. A pesar de que este es el modelo más simple anulación de dar cuenta de nuestras observaciones, más estructural y biofísicos Se necesitan estudios para establecer la translocación de ADN y los mecanismos de anulación. Hay muchos otros helicasa translocación y anulación mecanismos que se han propuesto en la literatura (Figura 4 y su leyenda). Si helicases con estructuras similares se emplean mecanismos similares que queda por determinar.

La dependencia de T7 helicasa tasa de anulación en la asistencia a las proteínas

T7 helicasa se mueve a su máxima velocidad a lo largo de ssDNA, pero disminuye considerablemente cuando se disipación un duplex de ADN (41]. Síntesis de ADN T7 DNA polimerasa en la horquilla de replicación cruce acelera la tasa de anulación de T7 helicasa, con indicación de acoplamiento funcional de las dos proteínas de motor (42, 43]. Una parte de la razón por la que se observa una mayor actividad de helicasa T7 es probable que el cambio de la ssDNA-dsDNA equilibrio de la síntesis de ADN actividad de la polimerasa (44]. Sin embargo, otros factores deben estar involucrados basado en el resultado observado que la aceleración de la tasa de helicasa ADN-polimerasa tasa dictado. Un factor que podría ser que la ADN polimerasa impide el deslizamiento de apoyo de la helicasa. Prueba de helicasa desvío proviene de la identificación de un mutante que tiene una mayor eficiencia NTP hidrólisis pero un ritmo más lento, lo que apunta a un compromiso evolutivo entre la eficiencia y la tasa (45]. Si la eficiencia puede ser sacrificado en el medio silvestre-T7 tipo helicasa, entonces el deslizamiento sería una de las principales causas para la observación de las tasas inferiores al óptimo. La presencia de la DNA polimerasa detrás de la helicasa impediría helicasa deslizamiento contribuir a la mejora de la eficiencia termodinámica y la tasa de anulación. Por otra parte, helicasa tipo de mejora puede deberse a empujar de la helicasa de la ADN polimerasa, helicasa, siempre que tiene una conformación que le permita diapositiva (difusa, no a través de interacciones específicas) a lo largo de ADN. Si arquitectónicamente las dos proteínas están avanzando juntos en las correspondientes bases de las complementarias en lugar de ser estrictamente una detrás de otra, entonces la DNA polimerasa puede ser simplemente proporcionando ssDNA a la helicasa de sterically desplazando el dsDNA-ssDNA equilibrio en el cruce, debido a sus limitados (y no auto-suficientes) la línea de separación actividad. La determinación del mecanismo exacto y todos los factores que intervienen en la tasa observada helicasa estimulación se requieren más estructurales y estudios bioquímicos.

Los eventos son más complicadas en vivo (Figura 3B], ya que hay potencialmente dos ADN polimerasas que es necesario trabajar con la helicasa. Eficaz la replicación del genoma requiere la principal y quedando capítulo de síntesis que será coordinado, que se logra mediante la colocación de la rezagada línea a fin de que la progresión paralela de los dos polimerasas (46]. Capítulo único de proteínas de unión (ya sea T7 gp2.5 o de acogida SSB) son conocidas por ser críticas para el acoplamiento de estos dos procesos (47]. El mantenimiento simultáneo de progresión de la síntesis de los dos capítulos también requiere un mecanismo de reciclaje de los menos capítulo de ADN polimerasa (47, 48]. Quedándose capítulo se sintetizan discontinua y los fragmentos de Okazaki un tamaño medio de bases de 3000 se sintetizan a encontrarse con la primase reconocimiento a los sitios adecuados distancias a partir de la secuencia GTC (49, 50]. La coordinación podría estar mediado por la interacción física entre las distintas proteínas. T7 DNA polimerasa del thioredoxin vinculante dominio tiene afinidad para ambos helicasa y gp2.5, mientras que helicasa y gp2.5 parecen interactuar a través de sus ácidos C-terminal de residuos (51 - 56]. Un reciente informe llevado pruebas por la forma en conmutadores se hacen en nuevos fragmentos de Okazaki (57]. Parece que toda la maquinaria de replicación puestos como el primase sintetiza el ARN necesaria primer tipo y se reanudará a primer término. Además de sintetizar tetraribonuclotide primers y anulación de ADN, T7 helicasa línea media también el intercambio y la recombinación homóloga con la ayuda de gp2.5 (58, 59]. Esta funcionalidad independiente es probable que sea importante para la replicación del bacteriófago T7, que es, probablemente, hacer recombinational a través de un mecanismo (60, 61].

PERSPECTIVA

El sistema de replicación bacteriófago T7 es una de las más simples para estudiar la acción de una helicasa durante la replicación y, en particular, para el estudio de los mecanismos de translocación y base par la separación de un anillo en forma de helicasa. La capacidad de reunir T7 proteínas y la replicación a reconstituir eficaz la replicación del ADN in vitro sin ningún tipo de accesorio y factores hydrolyzable sustratos permitir estudios para abordar las cuestiones que son más difíciles de investigar en otros sistemas. Los estudios futuros se prevé que la participación de determinación de la helicasa anillo en diferentes estructuras de ácidos nucleicos y nucleótidos ligadura de los estados; determinar la naturaleza de acoplamiento de la NTPase reacción y la reacción helicasa; cooperativity el entendimiento entre la DNA polimerasa y la helicasa; determinar la arquitectura del complejo en el ADN y la comprensión de los efectos de un solo hundidos ADN proteínas de unión a las actividades de la helicasa y la replisome.

Los autores se agradecen a los anteriores y actuales miembros de la Patel laboratorio que contribuyeron a los estudios de helicases y T7 proteínas y la replicación a todos los miembros de los debates críticos. Los autores reconocen el apoyo del NIH (GM55310). La financiación para pagar la publicación de acceso abierto las tarifas para este artículo fue proporcionada por NIH subvención GM55310.

Conflicto de intereses declaración. Ninguno declarado.