Genética determina la respuesta de fondo a la hemostasia y trombosis

La historia familiar [1] es el más fuerte factor de riesgo para enfermedades cardiovasculares (ECV). Si bien una serie de mutaciones genéticas han sido identificados, estos representan sólo un pequeño porcentaje de las enfermedades cardiovasculares en las poblaciones humanas. La formación de un trombo en fisurada placas ateroscleróticas es el evento que precipitó en la transición de una estable o subclínica de enfermedad aterosclerótica y conduce a infarto agudo de miocardio, accidente cerebrovascular isquémico o la oclusión arterial periférica. Arteriales y la trombosis venosa son complejas y las respuestas están influenciadas por múltiples factores genéticos y ambientales [2 - 5]. Polimorfismos y mutaciones en los factores de coagulación, fibrinolítico factores, los receptores de la superficie plaquetaria, methylenetetrahydrofalate reductasa, endotelial de óxido nítrico sintasa, y enzimas antioxidantes han sido implicados como los determinantes genéticos de susceptibilidad a la trombosis [6, 7]. Grandes pasos se han realizado en el diagnóstico y el tratamiento de la trombosis en la última década. Sin embargo, las estrategias para prevenir la trombosis han quedado muy rezagado debido, en parte, a la contribución de múltiples, y todavía indefinido, los factores genéticos que conducen a riesgo trombótico. Por otra parte, aún no está claro cómo los antecedentes genéticos influyen en la función de las moléculas y las vías conocidas para regular la formación del trombo y la lisis y, por consiguiente, contribuye al riesgo de enfermedad trombótica.

Muchos de los disponibles puras cepas de ratón, como C57BL/6J (B6) y A / J, han sido clasificados como resistentes o susceptibles a determinadas enfermedades complejas (Tabla 1]. Estas dos cepas tienen diversas respuestas a la dieta inducida por la obesidad [8] (B6 sensibles; A / J resistentes), inducida por dieta aterosclerosis (B6 sensibles; A / J resistentes) [9], la ligadura arterial inducida por la hiperplasia neointimal (B6 resistentes ; A / J resistentes), y la ligadura de los vasos inducidos por la remodelación (B6 resistentes; A / J sensibles) [10]. Estas condiciones son predisponentes para trombosis per se, sino que estos ratones no han sido evaluados sistemáticamente de trombosis. La formación del coágulo y la lisis, que en última instancia, determinar trombosis, requiere la agregación plaquetaria, la coagulación y fibrinolítico funciones. Las interacciones entre estas vías puede ocurrir y factores adicionales podrán modular estos procesos. Identificación de nuevos moduladores y los factores de estas vías se pueden identificar por asociar el fenotipo con una ubicación (s) en un cromosoma específico, un rasgo cuantitativo locus (QTL).

Un panel del cromosoma sustitución cepas (CSS), se ha generado [11] de un "marcador con ayuda de" programa de reproducción en donde la descendencia de una B6 × A / J cruz fueron sucesivamente backcrossed a los ratones B6. Marcadores genéticos se utilizan para identificar homozygosity en el fondo (B6) y el individual A / J cromosoma. Estas cepas tienen un cromosoma de A / J ratones B6 en un segundo plano. Esto permite la identificación de un rasgo en uno o varios CSS y que implica al menos un QTL se encuentra en este cromosoma. El uso de este panel requiere un menor número de ratones para determinar el QTL que hace un genoma a nivel de exploración. Otra ventaja es la capacidad para la detección de QTL en presencia de otros QTL. Además, las pantallas iniciales con la CSS simplificar la multa de cartografía de QTL. Varios estudios de este panel CSS, B6 Chr1-19, X, Y ^{A / J,} se ha informado de comportamiento [12], aumento de peso [13], esteroles [13], plasma y los niveles de aminoácidos [13, 14], y han identificado muchos más estudios de QTL de los mismos rasgos del genoma utilizando una escala de exploración.

El objetivo de este estudio fue evaluar los dos cepas puras de ratones de riesgo protrombóticos, utilizando un cloruro férrico modelo de lesión vascular, hemorragia cola de ensayo, así como las medidas de la coagulación y fibrinólisis. Los resultados de este estudio indican que las dos cepas puras, B6 y A / J ratones, tienen diversos fenotipos protrombóticos, que no guardan relación con la coagulación o la agregación plaquetaria. Además, en la CSS, la expresión de A / J fenotipos, nuevas hemorragias tiempo y la oclusión arterial, se modificó en el fondo B6, y sugirió que la interacción se produjo entre la A / J QTL. Por lo tanto, debería ser posible identificar independiente determinantes genéticos de susceptibilidad a patológico hemostasia y trombosis.

Las cepas puras, B6 (# 000664), Lep ^ob (# 000632), A / J (# 000646) y el gen de orientación del plasminógeno (Plg) inhibidor de activador de ratones deficientes (PAI-1-/ -) (# 002507) [15 ] Ratones B6 en un fondo se obtuvieron a partir de Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) a las 6 semanas de edad. El Plg-/ - se han generado ratones tal como está descrita anteriormente [16] y mantenerse en el fondo B6, generado por el cruce de los ratones original mixta (B6: 129) antecedentes de ocho generaciones de ratones B6. El Plg-/ - ratones no se reproducen bien y Plg heterocigotos pares fueron utilizados para la reproducción. Genotipos (Plg + / +, Plg + / -, Plg-/ -) de las crías fueron determinados por un ensayo de PCR en 3-4 semanas de edad a partir de una oreja pegada [17]. Parejas reproductoras de la CSS ratones fueron trasladados del doctor Nadeau del laboratorio. Todos los ratones fueron alojados y criados en la Unidad de Recursos Biológicos en la Cleveland Clinic Foundation (CCF). Los animales fueron alojados en jaulas de aislamiento esterilizados, mantenido en un 14 hr light/10 hr oscuro ciclo, y se proporcionaron alimentos esterilizados y agua ad libitum. Los ratones fueron alimentados con una autoclave de laboratorio estándar de la dieta consistente en: un 23% de proteínas, 4,5% de materia grasa, el 6% de fibra, (Purina, St Louis, MO), y la prueba entre 7 y 9 semanas de edad. Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con un protocolo aprobado por el Cuidado de Animales Institucional y Comité Asesor de Investigación en marco de cooperación.

Para inducir la formación de trombosis en la arteria carótida, un cloruro férrico (FeCl ₃₎ el modelo del buque lesiones [18, 19], fue empleada. Los ratones fueron anestesiados con ketamina / xylazina (80 mg / kg, 5 mg / kg), una línea media del cuello del útero se hizo la incisión y la izquierda arteria carótida común aislado de romo disección. La sonda de flujo (Transonic Systems, modelo 0.5PSB) fue puesto bajo la arteria y cuando una línea de base estable se llegó a un 0,5 × 2 mm tiras de papel de filtro saturado con un 10% de FeCl ₃ solución se aplicó a la superficie de la arteria carótida para 3 min. Oclusión tiempo se determinó a partir de la adición de la solución de FeCl ₃ a la oclusión de la arteria (como mínimo el flujo de sangre). El flujo sonda se encontraba en el lugar de establecimiento de la línea base hasta varios minutos después de la oclusión estable se ha llegado o se detuvo en 30 minutos si no hubiera oclusión. El flujo de sangre se registró cada 10 segundos (Transonic Systems, modelo TS420). No hubo diferencias en el peso corporal entre los ratones que fueron probados en el modelo de lesión vascular.

Por la cola sangrado ensayo, los ratones fueron anestesiados con ketamina / xylazina (80 mg / kg, 5 mg / kg), la cola prewarmed durante 5 min a 10 mL de solución salina a 37 ° C en un baño de agua. La cola se levantó de la salina y un 5 mm segmento de la cola amputada y de inmediato regresó a la solución salina. El tiempo de sangría se midió como el tiempo transcurrido entre el inicio del sangrado a la cesación de sangrado. Con la cola que permanecen en la misma solución salina, las nuevas hemorragias tiempo se midió el tiempo de sangrado entre el cese y el comienzo de la segunda hemorragia.

Los ratones fueron anestesiados con isoflurano (Abbott), sangrado de los orbitales en los senos sin tubos capilares, y una gota de sangre inmediatamente colocado en una tira de reactivo (Simbióticos) para el tiempo de protrombina (TP) o tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA), y se incluirán las determinaciones precalibradas en el analizador de coagulación (SCA2000, Simbióticos). PAI-1 actividad se determinó según el método de Chandler et al [20]. PAI-1 antígeno concentración se determinó por ELISA [21] utilizando ovejas ratón anti-PAI-1 (Diagnóstica de América) como la captura de anticuerpos de ratón y PAI-1 (Diagnóstica de América) como estándar (0-3.5 ng / mL). Plg se determinó con un ensayo cromogénico [22] y la actividad fibrinolítica determinado por la degradación de fibrina [23]. Para los controles negativos en estos ensayos, a partir de plasma PAI-1 o Plg ratones deficientes se utilizó. Funcionalmente activa ratón α _{2-antiplasmin} se determinó con un ensayo de plasmina de captura y detección con un ratón de anticuerpos (Molecular Innovations, Southfield, MI), y fibrinógeno con un ensayo ELISA con anticuerpos que reconocen ratón fibrinógeno (Hyphen BioMed, Francia).

Las colas congeladas o heridos en carotids PTU se seccionaron a 5 μ m de espesor y teñidos con tricrómico de Masson (HT 15, Sigma Diagnostics). Para el análisis cuantitativo de colágeno en la zona de cola secciones, cuatro secciones de 2-3 sitios se midieron utilizando asistida por ordenador de análisis de imagen (Image-Pro Plus, cibernética). Para la determinación del área de los heridos carotídea lumen, 3-4 secciones de diferentes lugares alrededor de 100 μ m de separación y se analizaron en promedio para cada ratón.

Los datos se presentan como media ± SEM. El análisis estadístico para las comparaciones entre A / J y B6, así como entre los ratones de tipo salvaje (WT) y Plg-/ - littermates se comparó con una cola de dos t-test. Las diferencias entre B6, Lep ^ob, PAI-1-/ - Los animales fueron determinados por un ANOVA de un factor y una Newman-Keuls post-test. Un valor de p <0,05 fue considerado significativo. El análisis estadístico de la comparación entre ratones B6 y CSS se determinaron con dos cola-t-pruebas y el nivel significativo de la P-valores (véase la figura leyendas), determinado con una corrección de Bonferroni para tener en cuenta las pruebas multihypothesis [13].

La FeCl ₃ cartoid lesión de la arteria modelo [24], bien caracterizado la trombosis arterial modelo, se utilizó para inducir un trombo oclusivo en la B6 y A / J cepas de ratón bajo investigación. Una marcada diferencia en el trombo oclusión arterial tiempo se encontró entre la B6 y la A / J mice (Figura 1A]. La oclusión de vez en la A / J ratones fue de 2 veces inferior al de los ratones B6. Un 5% de la dosis de FeCl ₃ fue probado en el A / J ratones y B6 y la oclusión tiempo fue inferior en el A / J que los ratones B6, los mismos resultados que con el 10% de la dosis. La oclusión de tiempo (min para ambos B6 (15 ± 3, n = 3) y A / J (8 ± 1, n = 3) en un 5% más largo que eran en un 10% para B6 (10 ± 1, n = 17 y A / J (5 ± 2, n = 14). Las curvas de flujo de sangre después de la aplicación FeCl ₃ se indica un patrón con una disminución gradual antes de la oclusión para ratones B6 (Figura 1B], pero para el A / J mice el flujo sanguíneo disminuyó abruptamente a cero (Figura 1C], lo que demuestra una marcada diferencia de la cepa B6. La media de la oclusión veces fueron significativamente diferentes entre las dos cepas (Figura 1A]. El tamaño de la carotids en las dos cepas era notablemente diferente. La zona ( mm ²⁾ del lumen (0,066 ± 0,007, n = 6) fue significativamente menor en el A / J para que los ratones B6 ratones (0,128 ± 0,007, n = 6). Sin embargo, la proporción de trombo a la luz fue similar para A / J (0,63 ± 0,03) en comparación con B6 ratones (0,67 ± 0,09). Calculada enorme estrés tasas [25] fueron un 14% menos en el A / J ratones en comparación con ratones B6.

El tiempo de sangría, un indicador de actividad hemostática, fue determinada después de prewarming la cola, un recorte de 5 mm del segmento, situando en la cola caliente y salina midiendo el tiempo para el sangrado de la parada. Encontramos este procedimiento fue coherente y reproducible en diferentes cepas de ratón y no era dependiente de género. Tiempo de sangrado no fue diferente en A / J ratones en comparación con ratones B6 (Figura 2A]. Con el fin de determinar si existen ramas específicas fueron alteradas por la B6 y A / J cepas, los ratones con alteraciones conocidas en la hemostasia, Lep ratones ^ob, o trombosis, Plg-/ - y PAI-/ - ratones, también fueron probados. Los ratones ^ob Lep han mermado la agregación plaquetaria [26] y fueron evaluados como referencia para la función plaquetaria. En los ratones ^ob Lep (Figura 2A] hubo casi 10 veces más en el tiempo de hemorragia en comparación con ratones B6. El tiempo de sangría fue también significativamente (P = 0.0001) aumentó en un 66% en el Plg-/ - ratones en comparación con los ratones WT littermates. Tiempo de sangrado no fue diferente en PAI-1-/ - ratones en comparación con ratones B6. En contraste con el ^ob Lep ratones con un defecto de plaquetas y 10 veces más en el tiempo de hemorragia, no hubo diferencia en el tiempo de sangrado entre B6 y A / J ratones y sugirió la agregación plaquetaria no está alterado en estos dos cepas.

Nuevas hemorragias tiempo, un indicador de la estabilidad del trombo, se midió como el tiempo transcurrido entre el cese de la hemorragia y el comienzo de la segunda hemorragia (Figura 2B]. Nuevas hemorragias veces fueron significativamente mayores en A / J (2.6 veces, p <0,001) que los ratones ratones B6. En contraste, las nuevas hemorragias tiempo fue casi 8.5 veces menos en los ratones ^ob Lep que los ratones B6. Para determinar cómo las alteraciones en el sistema fibrinolítico pueden afectar a las nuevas hemorragias tiempo, Plg-/ - y PAI-1-/ - Los ratones también fueron probados (Figura 2B]. Nuevas hemorragias tiempo no fue diferente en Plg-/ - en comparación con los ratones WT littermates, pero PAI-1-/ - ratones tenían una significativamente (P <0,05) redujo las nuevas hemorragias tiempo, que fue de 1,8 veces inferior al de los ratones B6. A pesar de que una deficiencia de Plg no dio lugar a un prolongado tiempo nuevas hemorragias según lo previsto, un PAI-1 como resultado deficiencia en un tiempo abreviado. El notable aumento de nuevas hemorragias vez en la A / J puede sugerir diferencias en la regulación de la red Plg.

Para determinar si las diferencias en la coagulación son factores que contribuyen a la hemorragia y nuevas hemorragias resultados, tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA) se midieron. PT es una medida de la coagulación vía extrínseca (activación del factor VII de factor tisular), mientras que TTPa es una medida de la vía intrínseca (activación de los factores XII, XI, VIII y IX). Los productos de ambas vías de activación del Factor X, el cual inicia la vía común para la generación de trombina y la formación del coágulo de fibrina. PT y TTPa se midieron en la B6 y A / J ratones y los valores no fueron diferentes entre las dos cepas de ratón (Tabla 2]. Estos resultados sugieren que la vía de coagulación no es diferente en las dos cepas puras.

Plg concentración fue 34% mayor en el A / J ratones que en ratones B6. Además, la actividad fibrinolítica, PAI-1 actividad, y α _{2-anitplasmin} se incrementaron, asimismo, en el A / J ratones en comparación con los ratones B6 (Cuadro 2]. Las consecuencias funcionales de estas diferencias no están claras, ya que el fibrinógeno es también mayor en el A / J mice. Para determinar si existen cambios en la estructura de la proteína de la Plg de A / J mice, plasma de la B6 y la A / J ratones fueron sometidas a electroforesis en virtud del reducido, no reducido, y no las condiciones de desnaturalización. No hay diferencia en la migración de immunostained Plg bajo estas condiciones se observó (datos no presentados). La densidad de la Western blot de SDS-PAGE en virtud de la reducción de las condiciones de plasma de diferentes volúmenes de B6 y A / J ratones y se comparó la densidad de las bandas era de 56% mayor en el A / J que los ratones B6 (seis ratones se pusieron a prueba al menos en dos ocasiones) de la misma cantidad de plasma (Fig. 1B]. Por lo tanto, la concentración de Plg en el plasma de A / J ratones fue superior a la del plasma de ratones B6 determinada por dos métodos y ninguna diferencia en la migración después de electroforesis se observó, lo que sugiere que no marcados cambios en la estructura de Plg en los dos ratón cepas.

Las colas de los ratones fueron examinados por las diferencias que podría explicar las variaciones en las nuevas hemorragias y sangrado valores. Secciones de la cola de la B6 y A / J ratones fueron teñidas con hematoxilina / Eosin o tricrómico de Masson y representante secciones se muestra en la Figura 3. No obvio cualitativo se observaron diferencias en los folículos pilosos, glándulas sebáceas, o centro de hueso / cartílago en hematoxilina / Eosin (Figura 3A] manchadas secciones. Secciones de las colas fueron teñidas con tricrómico de Masson (Figura 3B] que detecta el colágeno, el principal sustrato de plaquetas adhesivo para la iniciación de la formación de trombo. El colágeno contenido (zona de la cola%) se cuantificó (Figura 3C] de 3-4 secciones de las zonas 2-3 / ratón. La cantidad de colágeno fue mayor en el A / J que los ratones B6 (P <0,05). El colágeno en los vasos en el tejido adiposo en el A / J ratones también está aumentado en comparación con los ratones B6 (datos no presentados).

El uso de la cola de sangrado o hemorragias recurrentes ensayo como un sustituto para el marcador de la hemostasia y la trombosis, la CSS fue tamizada. El sangrado veces (Figura 4A] para la B6 y la A / J ratones no eran diferentes, pero 6six de las cepas, B6-Chr5, 6, 8, 14, 15, Y y ^{A / J,} tuvo menor (P < 0.002) veces el sangrado (49-79 segundos) en comparación con el valor de la B6 ratones (121 segundos). El tiempo nuevas hemorragias (Figura 4B], determinado como el tiempo transcurrido entre el cese el sangrado y la puesta en marcha de la segunda hemorragia, fue marcadamente mayor en el A / J ratones en comparación con los ratones B6 y dos cepas, B6-Chr11 ^{A / J} (CSS-11 ) Y B6-Chr17 ^{A / J} (CSS-17), significativamente (P <0,002) ya veces nuevas hemorragias en comparación con los ratones B6 que eran similares a los valores de A / J mice. Otra cepa, B6-Chr5 ^{A / J} (CSS-5), se acercó importancia a P <0,008. Las nuevas hemorragias tiempo se detuvo a 600 segundos, y el porcentaje de ratones con este valor determinado para las tres cepas: CSS-5-60%, CSS-11-60% y CSS-A17-46%. El porcentaje de ratones B6 nuevas hemorragias con un tiempo de 600 segundos fue de 7% y para el A / J mice el porcentaje fue del 85%.

Nuevas hemorragias vez en la matriz cepas CSS y se compararon con los valores de la progenie de los ratones que fueron cruzadas con B6 ratones para producir ratones heterosomic para el CSS-5, (B6xCSS-5) y F1 CSS-17 (B6xCSS-17) F1 cepas (Figura 5]. Los valores para las nuevas hemorragias CSS-5F1 y CSS-17F1 ratones fueron similares a la vitamina B6 en lugar de la A / J ratones, lo que sugiere la A / J es el rasgo recesivo. El sangrado y hemorragias recurrentes en la progenie de la cruz, B6-Chr5 ^{A / J} × B6-Chr17 ^{A / J} (CSS-5 × CSS-17) tuvo como resultado la recuperación de la A / J fenotipo en la progenie de estas cepas doble heterosomic . Así, a pesar de la heterosomic de cromosomas 5 y 17 en la progenie de la CSS-5 × CSS-17, el fenotipo es ahora similar al A / J. Esto sugiere que los rasgos sobre la relación A / J cromosomas se interactúan para producir el fenotipo.

Los componentes del sistema Plg residen en los cromosomas CSS-5 (PAI-1), CSS-11 (α _{2-antiplasmin),} y CSS-17 (Plg). Como se informó en el Cuadro 2, la A / J mice ha aumentado Plg antígeno, la actividad fibrinolítica, α _{2-antiplasmin,} PAI-1 y la actividad de fibrinógeno en comparación con ratones B6. En CSS-17 ratones, el antígeno Plg también fue significativamente (P = 0,015) se incrementó (152 ± 6, n = 12) en comparación con los ratones B6, pero para CSS-5 y CSS-5 × 17, el antígeno se Plg valores similares a los de ratones B6. Actividad fibrinolítica no fue diferente a la CSS-5 o CSS-17 cepas en comparación con los ratones B6. α _{2-antiplasmin} fue significativamente (P = <0,01) redujo en CSS-5 ratones (142 ± 4 μ g / ml, n = 5), significativamente (P <0,05) mayor en el CSS-11 (201 ± 6, n = 8), pero no difieren en CSS-17 o CSS-5 × 17 ratones en comparación con los ratones B6.

PAI-1 antígeno y la actividad se determinó en la CSS con un aumento de nuevas hemorragias veces, CSS-5, CSS-11, y CSS-17 (Figura 6], el heterosomic, CSS-5F1, CSS-17F1, y doble hetersomic, CSS - 5 × 17. CSS-5, CSS-17, CSS-5F1, y CSS-17F1 general, ha reducido PAI-1 antígeno en comparación con ratones B6. La disminución de PAI-1 antígeno es un rasgo dominante por el hecho de que los valores fueron similares en los homosomic y heterosomic CSS-5 y CSS-17. La CSS-5 × CSS-17 doble heterosomic cepas tuvieron valores similares a la B6 y A / J padre cepas. PAI-1 actividad se redujo significativamente en el CSS-5 y CSS-17F1 ratones, pero una vez más en la CSS-5 × CSS-17 cepa el valor de PAI-1 actividad fue restaurado al valor de la B6 y A / J padre cepas. El PAI-1 antígeno (5,4 ng / mL ± 0,5, n = 7) y actividad (170 U / mL ± 20, n = 6) en el CSS-11 ratones no fue diferente que para los ratones B6.

La cola sangrado ensayo fue rápida y facilitó la selección de las 21 cepas CSS, y posteriormente los identificados fueron la prueba de oclusión arterial después de la lesión FeCl ₃ (Figura 7]. La CSS-5 y CSS-17 había oclusión veces similares a los ratones B6, pero el doble heterosomic CSS-5 × CSS-17 progenie había oclusión veces superior a cualquiera de los ratones B6 o la heterosomic CSS-5F1 y CSS-17F1 o la A / J cepas. En doble heterosomic CSS-5 × CSS-17 ratones, sólo uno o tres ratones han probado oclusión de 30 minutos, y los otros dos ratones no ocluían de 30 min. Aunque sólo un pequeño número de CSS ratones se han probado para la oclusión arterial, los resultados sugieren que la interacción de los genes en el cromosoma 5 y 17 también determina el tiempo de oclusión arterial.

En este estudio, el riesgo trombótico fue evaluado sistemáticamente en dos cepas puras de ratones que han marcado las diferencias en la susceptibilidad a la dieta inducida por la obesidad, la dieta inducida por la aterosclerosis, y la ligadura inducida por la hiperplasia neointimal y la remodelación de los vasos. Oclusión arterial tiempo, la cola nuevas hemorragias y sangrado tiempo fueron evaluados como posibles factores predictivos de respuesta trombóticos. Las evaluaciones de las dos cepas puras se compararon con los valores de los ratones de genes específicas de la red con Plg fibrinolítico alterado las respuestas, así como la deficiencia de leptina en ratones con una reducción de la función plaquetaria. Se hallaron importantes diferencias en la respuesta trombóticos entre las dos cepas puras, B6 y A / J, y las diferencias observadas no son correlacionados con cambios en la coagulación o la función plaquetaria. Screening la CSS identificado tres cromosomas que albergaron los genes que contribuyeron a la A / J fenotipo de tiempo el aumento de nuevas hemorragias. Ratones homosomic para estos cromosomas o doblemente heterosomic para dos de los cromosomas, 5 y 17, están obligados a expresar la A / J fenotipo, elevación de nuevas hemorragias tiempo. PAI-1 antígeno y la actividad se redujo en ambos CSS-5 y CSS-17 y la heterosomic ratones, CSS-5F1 y CSS-17F1, pero no en el CSS-11 cepa. Los valores fueron restaurados en la heterosomic doble para dos de los cromosomas, 5 y 17. Oclusión arterial tiempo fue similar al B6 en la CSS-5 y CSS-17 homocigotos cepas, pero aumentó en heterosomic doble para dos de los cromosomas, 5 y 17.

La FeCl ₃ inducida por el modelo de lesión vascular y trombosis en los ratones es ahora ampliamente utilizado para evaluar la genética y las intervenciones farmacológicas [24]. Las dos cepas puras había marcadas diferencias en el momento de que la oclusión de la arteria carótida después de FeCl ₃ lesiones. Después de FeCl ₃ tratamiento, la formación del trombo y la oclusión es extraordinariamente acortado en el A / J ratones en comparación con los ratones B6. Estos resultados no han sido previamente informado. Un estudio reciente [25] de gran estrés en ratas, encontraron que la magnitud de los cambios en la pura tensión con un aumento del flujo sanguíneo varió con las diferentes cepas. Más investigación, más allá del alcance de este estudio sería necesaria para determinar la contribución a las diferencias de tamaño y de gran estrés carotids a la oclusión arterial en las tasas de B6 y A / J mice. En estudios preliminares, hemos observado diferencias en la composición del trombo en B6 y A / J mice. El patrón de flujo sanguíneo cesación de las dos cepas puras era diferente que para los ratones ^ob Lep [26] con una alteración de la función plaquetaria, la coagulación y el tiempo fue similar en los dos cepas. En los ratones con deficiencias de la red Plg [27], tiempo de formación del trombo se redujo en el Plg-/ - ratones, pero aumentó en el PAI-/ - ratones, lo que sugiere que las alteraciones en la actividad plasmina que afectan la tasa de lisis del coágulo, puede modular los acontecimientos que dieron lugar a la formación de un trombo oclusivo.

La cola de sangrado ensayo se ha utilizado ampliamente en ratones para evaluar el impacto de las deficiencias más de expresión y de las plaquetas y la coagulación de proteínas en ratones. Sweeny et al [28] examinaron 25 cepas de ratones y encontraron sólo la RIIS / J ratones que se han incrementado el tiempo de hemorragia debido a la reducción de von Willebrand antígeno. Broze et al [29] evaluaron ratones con deleciones de genes de la coagulación vía y se encontró que, si bien el tiempo de sangría no fue mayor, nuevas hemorragias persistido a pesar de electrocauterización de la cola en FVIII y FIX ratones deficientes. Esta observación plantea la posibilidad de que nuevas hemorragias tiempo puede ser un reportero de sensibilidad genética influye en la formación del trombo y la estabilidad. Los ratones que son deficientes en factores necesarios para la función plaquetaria normal, plaquetas glicoproteína Ib [30], y la proteasa-receptor activado-4, [31] han aumentado el tiempo de sangría cola. La deficiencia de leptina con la reducción de la agregación plaquetaria muestra claramente un aumento considerable en el tiempo de hemorragia y el aumento del tiempo de sangría en Plg-/ - y UPA-/ - ratones sugiere que Plg UPA y puede ejercer una influencia en la respuesta plaquetaria normal para promover la formación de trombo. En general, el notable aumento de nuevas hemorragias veces observado en algunos cepas de ratón sugiere que los factores genéticos distintos de coagulación pueden desempeñar un papel en la estabilidad de un trombo.

En la cola sangrado ensayo, A / J ratones no tenían cambios en el tiempo de sangría, pero las nuevas hemorragias tiempo fue mayor en comparación con ratones B6. En nuestro estudio, Plg-/ - ratones han aumentado el tiempo de sangría, PAI-1-/ - ha disminuido temne nuevas hemorragias, y UPA-/ - ratones había un mayor tiempo de hemorragia similar a la Plg-/ - ratones (J. Hoover-Plow , A. Shchurin, y E. Hart, resultados no publicados). El aumento de sangrado o hemorragias recurrentes veces no se han reportado en ninguna de las Plg red orientada ratones. Matsuno et al [32] informó de que no se diferencia en el tiempo de sangría para tPA-/ -, UPA-/ -, PAI-1-/ - ratones en comparación con los ratones WT, y el ensayo fue similar, pero la cola clip segmento es considerablemente más corto y sangrado veces reducido en comparación con los tiempos en nuestro estudio. El tiempo de sangría no se ha informado anteriormente para Plg-/ - ratones. Hemos encontrado valores similares para Plg-/ - ratones en un 50% B6: 50% fondo 129 (J. Hoover-arado, A. Shchurin, y E. Hart, resultados no publicados). Los resultados de este estudio sugieren que no sólo es el tiempo de sangría, genéticamente determinada, de fondo, sino también nuevas hemorragias cola que el tiempo es determinado genéticamente.

Aunque la presión arterial podría ser mayor en los ratones con la cola elevada tiempo de hemorragia, varios estudios sugieren que este no es el caso. Estudios de A / J [33 - 36] ratones han informado bien disminuyó la presión arterial o ninguna diferencia en comparación con los ratones B6. La presión arterial se midió en el Plg-/ - ratones (D. Hellard, J. Hoover-arado, y E. arado, resultados no publicados), estos ratones y han reducido la presión arterial cuando se compara con WT littermates, y UPA-/ - [ 37] y Lep ^ob [38, 39] ratones también han reducido la presión arterial, pero no hay una correspondencia entre la presión arterial y la cola nuevas hemorragias o sangrado. Análisis morfométrico de la cola indica una diferencia en el contenido de colágeno de la cola en la A / J mice. Las diferencias en la estructura y / o el metabolismo de colágeno o la matriz extracelular de proteínas puede contribuir al aumento de nuevas hemorragias y la reducción de la oclusión vez en la A / J ratones y garantiza una investigación más a fondo.

Los genes para Plg, PAI-1, y α _{2-antiplasmin} residen en los tres cromosomas identificados por QTL para nuevas hemorragias tiempo y puede o no ser coincidentes para la fenotipos observados se encuentran en el A / J ratones y CSS. No es probable que sólo la concentración de estos componentes se explica el aumento de nuevas hemorragias y la reducción de tiempo de oclusión arterial vez en la A / J mice. En comparación con los ratones B6, la A / J ratones y las tres cepas con elevada nuevas hemorragias tiempo había variable Plg, PAI-1, y α _{2-antiplasmin.} Dos formas alélica del ratón Plg gen se ha informado de B6 y A / J mice [40]. Plg concentración se incrementó en A / J ratones en comparación con ratones B6. A pesar de que no detectó diferencias en Plg estructura, esto no excluye posibles diferencias funcionales. Una cepa congenic (específico para una región homosomic de A / J y el resto de Chr y fondo es de ratones B6) de A / J cromosoma 17 que incluye el gen Plg se puso a prueba en el sangrado de ensayo. Los valores de sangrado y hemorragias recurrentes en este congenic cepa fue similar a los valores de B6 ratones, lo que indica que el QTL no es Plg. Hay otros genes de proteasas y matriz de proteínas que residen en el cromosoma 17, además de genes desconocidos. ADN par de secuencias base de datos para el PAI-1 o el gen α _{2-antiplasmin} gen en B6 y A / J ratones no han informado de diferencias [51], pero los genes de regulación aguas arriba de la región de codificación puede ser importante. Nuestros resultados sugieren que los nuevos o desconocidos genes pueden interactuar con los componentes del sistema Plg para modificar su función.

En resumen, este estudio los informes marcadas diferencias en dos cepas puras de ratones, B6 y A / J, en la formación de la trombosis arterial en un FeCl ₃ modelo de lesión vascular, nuevas hemorragias tiempo en una cola sangrado ensayo, la función del plasminógeno, y el tejido colágeno y los vasos de deposición . Tres cromosomas de A / J ratones fueron identificados que habían QTL para nuevas hemorragias tiempo. Los genes pueden interactuar con los componentes de la red Plg y modulan la oclusión arterial tiempo.

El marcado independiente de manifiesto las diferencias en la B6 y A / J ratones puede ser explotado para identificar los determinantes genéticos de trombosis y hemostasia. Nuestros resultados de la detección de CSS sugieren que los nuevos o desconocidos genes pueden ser utilizados para identificar los genes responsables de los rasgos relacionados con la trombosis arterial, hemorragia cola / buque nuevas hemorragias y la matriz extracelular. Identificación de las diferencias en las cepas de padres, tales como los descritos en este estudio, y el cribado de la CSS es un primer paso en el descubrimiento de nuevos determinantes genéticos de riesgo trombótico.

B6 = C57BL/6J

CSS = cromosoma sustitución de las cepas

CSS-# = B6-Chr # ^{A / J}

CSS-# F1 = (B6 × CSS-#) F1

WT = de tipo salvaje

-- / - = Deficiente

Plg = plasminógeno

PAI-1 = inhibidor del activador del plasminógeno-1

tPA = activador tisular del plasminógeno

UPA = activador del plasminógeno uroquinasa

SEM = error estándar de la media

QTL = rasgo cuantitativo locus

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

JHP concebido y diseñado el estudio, coordinado los experimentos y redactó el manuscrito. Tal como se desarrolla y se lleva a cabo la cola sangrado ensayo y participó en la redacción del manuscrito. EH llevó a cabo el modelo de lesión vascular y análisis y la cola sangrado ensayo, participaron en la cola de colágeno análisis, y la coordinación de la cría del ratón. JS participó en el análisis de las lesiones vasculares resultados del modelo y análisis de colágeno. JHN AHE y siempre que la CSS parejas reproductoras, JHN participó en las discusiones de los resultados, y JBS y JHN desarrollado la CSS. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

La pre-publicación de la historia de este documento puede accederse en:

http://www.biomedcentral.com/1471-2326/6/6/prepub