Mediators of Inflammation, 2006; 2006(4): (más artículos en esta revista)

Neutrofílica de células libres de exudado induce Antinociception mediar por la proteína S100A9

Hindawi Publishing Corporation
Rosana L. Pagano [1], Mario Mariano [2, 3], Giorgi Renata [1]

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Resumen

Calcio-proteína de unión S100A9 (MRP-14) induce efecto antinociceptivo en un modelo experimental de la sensibilidad dolorosa y participa de antinociception observados durante neutrofílica peritonitis inducida por glucógeno o carragenina en ratones. En este estudio, el directo antinociceptivo papel de la proteína S100A9 en neutrofílica de células libres de exudados obtenidos de los ratones inyectados con glucógeno se investigó. Los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con una solución de glucógeno, y después de 4, 8, 24 y 48 horas, ya sea el patrón de migración celular del exudado peritoneal o nociceptivo respuesta de los animales fue evaluada. El glucógeno inducida neutrofílica peritonitis evocado antinociception 4 y 8 horas después de la inoculación de los irritantes. Peritoneal celular libre de exudados, recogidos en distintos momentos después de la inyección irritante, fueron trasladados a ingenuos animales que se presentaron a la prueba nociceptivo. La transferencia de exudados también inducida por efecto antinociceptivo, y la neutralización de S100A9 actividad de anti-S100A9 anticuerpo monoclonal totalmente revertido esta respuesta. Este efecto no se observó cuando los experimentos se hicieron 24 o 48 horas después de la inyección de glucógeno. Estos resultados indican claramente que S100A9 se secreta durante glucógeno inducida neutrofílica peritonitis, y que esta proteína es responsable de antinociception observado en la fase inicial de reacción inflamatoria. Por lo tanto, estos datos refuerzan la hipótesis de que el calcio de la proteína de unión S100A9 participa de la endógeno de control del dolor inflamatorio.

INTRODUCCIÓN

Los neutrófilos, monocitos y macrófagos en secreto una gran variedad de productos biológicamente activos que participan en distintos tipos fisiopatológicos de la respuesta. Tal es el caso del calcio, proteínas de unión S100A8 y S100A9 [1], ambos miembros de la familia de las proteínas S100 [2], que se expresan en la diferenciación de las células del linaje mieloide, madura en neutrófilos y monocitos, pero está ausente en tejido normal macrófagos y linfocitos [3, 4].

El S100A8/A9 proteínas comprenden el 45% del total de proteínas en el citosol de neutrófilos y un 1% en monocitos [5], y puede encontrarse en un complejo formulario llamado calprotectin [6]. S100A8 y S100A9 proteínas también se describen como p8 y p14 [7], L1 ligera y pesada cadena [8], calgranulin A y B [9], y MRP-8 y MRP-14 [10], respectivamente. Bajo condiciones inflamatorias y / o a la movilización de calcio que son trasladadas desde el citosol al citoesqueleto celular y la membrana plasmática [11, 12]. Se ha demostrado que ambas proteínas son secretadas por monocitos activados a través de una tubulina y PKC dependientes de la vía [13]. Además, la heterodimer de estas proteínas ácido araquidónico se une con gran afinidad en un calcio-dependiente manera [14].

Aunque poco se conoce sobre la función biológica de S100A8/A9, se ha demostrado in vitro que la calprotectin tiene un efecto antimicrobiano sobre varios microorganismos [6, 15], e induce la apoptosis de las células tumorales diferentes o fibroblastos normales en un cinc - reversible manera [16, 17]. S100A8/A9 complejo se encuentra en altas concentraciones en los fluidos corporales de pacientes con diagnóstico de crisis y las enfermedades crónicas como la bronquitis crónica, fibrosis quística, y la artritis reumatoide [18], lo que hace este complejo un buen bioindicador de las enfermedades inflamatorias [19]. Un efecto antiinflamatorio de este complejo en un modelo del tratamiento adyuvante con artritis inducida en la rata se informó de [20], lo que sugiere un posible papel extra celular de estas proteínas.

Independiente de expresión y el funcionamiento de la proteína S100A9 También se han observado [10, 21]. Esta proteína regula la adhesión de neutrófilos al fibrinógeno, se activa selectivamente la integrina β 2, Mac-1 [22] y desactiva BCG-peritoneal macrófagos activados [23]. Hemos demostrado un marcado efecto antinociception de S100A9 en un modelo de dolor inflamatorio [24]. Además, antinociception se detectó en el curso de neutrofílica peritonitis aguda inducida por carragenina y glucógeno, que se volvió por el tratamiento de los animales con un anticuerpo monoclonal anti-S100A9, lo que sugiere que los neutrófilos en la inflamación aguda disminuye la respuesta a través de nociceptivo S100A9 actividad [ 24, 25]. Recientemente, hemos demostrado que el C-terminal de S100A9 murino inhibe la fagocitosis y la difusión de las actividades de las células peritoneales adherentes [26], las células que participan en la respuesta nociceptivo durante el modelo de contorsiones abdominales en ratones [27]. Sobre la base de estos datos, en el presente estudio se investigó el efecto antinociceptivo de la neutrofílica de células libres de exudado inducida por glucógeno, y el papel del calcio-proteína de unión S100A9 en este sentido.

MATERIAL Y MÉTODOS
Animales

Outbred ratones machos de la cepa suizo, con un peso de 20-25 g, se utiliza en este estudio. Los animales se mantuvieron bajo control de luz (12/12 horas) y temperatura (22 ± 2 ° C), con libre acceso a los alimentos y el agua. A lo largo de los experimentos, los animales se gestione por medio de los principios y directrices publicadas por la Comisión para la Investigación y la cuestión ética de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor [28].

Glucógeno inducida por peritonitis

Los ratones fueron por vía intraperitoneal (IP) inyectado con 500 μ l de una solución al 5% de ostra glucógeno tipo II (Sigma, Mo, EE.UU.), preparado en solución salina estéril. Control de animales fueron inoculados sólo con solución salina. Después de 4, 8, 24, o 48 horas de glucógeno solución de la inoculación, los ratones fueron sacrificados, en un CO 2 cámara, a la evaluación del líquido peritoneal o presentarse a la prueba nociceptivo.

Nocicepción evaluación de la prueba writhing

El ratón writhing test utilizado se basa en el método de Koster et al [29]. Las contorsiones abdominales como consecuencia de la inyección intraperitoneal de ácido acético (0,6%, Merck, Darmstadt, Alemania) a dosis de 60 mg / Kg (v / v) consisten en la contracción de los músculos abdominales con estiramiento de las extremidades posteriores. El número de contorsiones abdominales se había contado acumulativa durante un período de 20 minutos después de la inyección de ácido acético. Antinociceptivo La actividad se expresó como la reducción del número de contorsiones abdominales en el tratamiento en comparación con los animales control, inyectados con solución salina o sólo con ácido acético.

Caracterización de células inflamatorias y células libres de recogida de exudado

Los ratones inyectados con glucógeno solución salina estéril o, después de diferentes épocas, fueron sacrificados en un CO 2 cámara y sus cavidades peritoneal lavado con 5 mL de frío-buffer fosfato salino (PBS) pH 7,4. Después de un suave masaje de la pared abdominal, el líquido peritoneal y se recogió el total y el diferencial cuenta de leucocitos se determinó. Los leucocitos de células libres de exudado sobrenadante se obtuvo del líquido peritoneal después de dos centrifugations (2000 rpm/10 min, 5 ° C). Sobrenadantes se reunieron para cada momento y el grupo de tratamiento fueron congelados (-20 ° C) y, en el momento del ensayo, se inyectaron en animales ingenuo (200 μ l / cavidad) 30 minutos antes de la evaluación de la actividad antinociceptivo.

Anticuerpos monoclonales (AcM)

Mouse MAB (IgG1) antihuman S100A9 (anti-MRP-14; BMA Biomedicals AG, Suiza) y cabra MAB antimouse IgG1 (Sigma, Mo, EE.UU.) fueron utilizados.

Adsorción de S100A9 de las células inflamatorias libre de exudados

MAB antimouse IgG1 (1 mg / mL) en tampón carbonato (pH 9,5) se distribuyó en los pozos de 96-y placas de ELISA (100 μ l / pocillo) y se incubaron durante la noche a 4 ° C. Estas soluciones se retiraron y los pozos se llenaron con el 1% de albúmina seric bovina (BSA) en PBS (200 μ l / pocillo) durante 12 horas a 4 ° C. Los pozos se lavaron (tres veces) con PBS seguido por Twin 20 (0,5%) en PBS (dos veces) y se sustituirá con 200 μ l de sobrenadantes obtenidos a partir de las células inflamatorias sin exudado, después de 4 u 8 horas de la inoculación de glucógeno, previamente incubadas con antihuman S100A9 (isotipo IgG1 de ratón). Los sobrenadantes fueron absorbidos por triplicado en antimouse IgG1 recubiertos de pozos en 2 horas y, por último, incubados en pozos revestidos de 18 horas a 4 ° C. Estos sobrenadantes fueron congelados (-20 ° C), y en el momento de ensayo se inyecta por vía intraperitoneal a ingenuos animales (200 μ l / cavidad), 30 minutos antes de la prueba nociceptivo.

El análisis estadístico

Los resultados se expresan como media ± error estándar de los medios (SEM) y se compararon mediante la prueba t de Student o por análisis de varianza [30], seguido por el test de Duncan [31]. A nivel de probabilidad inferior a .05 se tomó como significativa (P <.05).

RESULTADOS
Glucógeno inducida por la migración de leucocitos

Como hemos tenido pruebas de que la anterior los neutrófilos, a través de la proteína S100A9 (MRP-14), mediar en el efecto antinociceptivo en un neutrofílica peritonitis inducida por glucógeno [24], lo primero que decidió establecer la afluencia de leucocitos inducida por el irritante. Los resultados confirmaron nuestros datos y demostraron que la inyección de propiedad intelectual de glucógeno inducida por un número significativo de células polimorfonucleares en la cavidad peritoneal de animales en comparación con los controles. El máximo número de estas células se observó 8 horas después de la inyección irritante (Figura 1 (a)]. El número de células mononucleares disminuyó significativamente 4 y 8 horas después de la inyección de glucógeno. En cambio se registró un aumento de estas células después de 48 horas de irritante tratamiento (Figura 1 (b)].

Glucógeno inducida por efecto antinociceptivo

Para confirmar la antinociceptivo respuesta observada después de la inyección intraperitoneal glucógeno, que los animales presentados a la prueba writhing después de la inyección de glucógeno. Los resultados mostraron un efecto antinociceptivo, 4 y 8 horas después de que el irritante tratamiento, en comparación con los animales previamente inyectados con solución salina o en ácido acético por sí sola (42 y 47% de inhibición, resp.) (Figura 2]. También se observó que la inyección de glucógeno solución no indujo cambios en la nociceptivo respuesta de los animales después de 24 o 48 horas de tratamiento en comparación con los animales control (Figura 2].

Transferencia de células inflamatorias sin exudado

Para investigar si el factor antinociceptivo fue secretada por la migración de leucocitos después de la inoculación de glucógeno, ingenuo animales fueron inyectados con células libres de exudado, obtenidas a partir de diferentes intervalos de tiempo, y después de 30 minutos evaluados en la prueba writhing. Los resultados muestran que la transferencia de células libres de exudados inducida por efecto antinociceptivo cuando se obtuvieron 4 u 8 horas después de la inyección de glucógeno (40 y 45% de inhibición, resp.). El tratamiento de ratones con las células ya sea libre de exudado obtenido 24 o 48 horas después de la inyección o irritantes con los sobrenadantes obtenidos de los animales inyectados con solución salina sólo no influyó en la respuesta nociceptivo (Figura 3].

Adsorción de S100A9 de la célula libre de exudados con efecto antinociceptivo

Para investigar si el efecto antinociceptivo inducido por la célula libre de exudados obtenidos después de 4 u 8 horas de la inyección de glucógeno se debe a la secreción de la proteína S100A9, los ratones fueron tratados con células libres de exudados adsorpted de esta proteína. Los resultados muestran que la adsorción de S100A9 de estos sobrenadantes, utilizando MAB anti-S100A9 (anti-MRP-14), revirtió la respuesta observada antinociceptivo (Figura 4]. El tratamiento de animales con este MAB solo o con nonrelated rata IgG, previamente a la inyección de ácido acético, no alteró la respuesta nociceptivo en comparación con los animales control (datos no presentados).

DISCUSIÓN

Los mediadores secretados durante la respuesta inflamatoria están involucrados en el control de la dolorosa respuesta. En lo que se refiere a que, interleucina-4 (IL-4), IL-10, e IL-13 tienen la propiedad de limitar la hiperalgesia inflamatoria que inhiben la producción de citocinas proinflamatorias [32 - 35].

Proteínas S100A8 y S100A9 implicará un importante grupo de proteínas expresadas por los fagocitos durante la respuesta inflamatoria [36], y participan en la primera línea de defensa contra este tipo de respuesta [37]. La proteína S100A9, en concreto, juegan un papel en la respuesta inflamatoria frente a lipopolissacarides de inducir la liberación de los neutrófilos de la médula ósea y dirigir su migración hacia el sitio inflamatorio, lo que sugiere que podría representar una nueva clase de principios de citoquinas que participan en inmune innato respuestas [38].

Según las pruebas que sugieran que es un S100A9 proteínas proinflamatorias [36], nuestro grupo ha propuesto que esta proteína está dotado con antinociceptivo actividad inflamatoria en el dolor modelo [24]. También se observó la participación de S100A9 en antinociception observados durante la peritonitis aguda inflamatoria inducida por la glucógeno o carragenina en ratones [24, 25]. Recientemente, hemos demostrado que el C-terminal de esta proteína está implicada, ya sea con el efecto antinociceptivo en la hiperalgesia inducida por la proteasa [39], o con la inhibición de la fagocitosis y la difusión de las actividades de las células peritoneales adherentes [26], las células responsables de la writhing nociceptivo respuesta [27]. Sobre la base de estos datos, decidimos investigar si la S100A9 se secreta durante glucógeno inducida neutrofílica peritonitis, y si esta proteína actúa directamente en el efecto antinociceptivo observado en este modelo de inflamación aguda.

Una correlación directa entre el número de neutrófilos en la cavidad peritoneal después de glucógeno y el tratamiento antinociceptivo máxima respuesta se observó, tal como está descrita anteriormente [24]. De acuerdo con los datos obtenidos por Pagano et al [25], nuestros resultados sugieren que estas células podrían participar en el control del dolor inflamatorio, posiblemente a través de la proteína S100A9 acción.

El efecto antinociceptivo observado después de leucocitos de células libres de exudado transferencia, obtenidas a partir de 4 u 8 horas de glucógeno inyección para animales ingenuo, confirmó que emigraron células secretan el factor antinociceptivo en fase aguda del proceso inflamatorio. La demostración de que la antinociception observada fue mediada por S100A9 acción fue confirmada por la absorción de esta proteína en la célula libre de exudados obtenidos de 4 u 8 horas después de la inyección irritante.

La participación de los neutrófilos en la que se observa efecto antinociceptivo, como se ha demostrado [24, 25], puede ser reforzado por los resultados aquí se muestra con la célula libre de exudados obtenido 24 y 48 horas después de la inyección de glucógeno, ya que no inducen antinociception con un disminución de células polimorfonucleares y aumento de células mononucleares.

El mecanismo por el cual S100A9 induce antinociception no se ha establecido aún. Sin embargo, teniendo en cuenta que S100A9 desactiva macrófagos activados [23], y que el C-terminal de S100A9 murino inhibe la fagocitosis y la difusión de las actividades de las células peritoneales adherentes [26], las células que participan en la respuesta dolorosa de hyperalgesic liberación de citoquinas en el abdominal contorsiones modelo [27], el efecto observado por S100A9 podría estar relacionada con la activación de macrófagos con la consiguiente inhibición de la secreción de factores algogenic de estas células. Por otra parte, S100A9 podría alterar el fenotipo de los macrófagos de una "anti-inflamatorio de células" el aumento de la liberación de citoquinas inhibitorias, como la IL-4 e IL-10, que están involucrados en el control del dolor inflamatorio.

Aunque varios informes se describe la presencia de S100A9 en la fase inicial de respuesta inflamatoria [36, 37], se sabe menos acerca de su papel biológico en proceso de nocicepción. Nuestros datos indican claramente que los neutrófilos-S100A9 proteína secretada participa en el control del dolor inflamatorio.

Estamos en deuda con el Dr Tânia Aguiar-Passeti para ayudar con la adsorción de ensayo. El apoyo financiero de la FAPESP y la Fundación Butantan es también reconocido.