Mediators of Inflammation, 2006; 2006(4): (más artículos en esta revista)

Es la asociación entre el TNF-α-308 y A Alelos DMT1 Independiente de HLA-DRB1, DQB1 Alelos?

Hindawi Publishing Corporation
Deja Grażyna [1], Przemysława Jarosz-Chobot [1], Joanna Polańska [2], Urszula Siekiera [3], Ewa Małecka-Tendera [1]

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Resumen

El objetivo del estudio fue evaluar factores elegidos de la susceptibilidad genética a DMT1: DRB1, DQB1, y TNF-α polimorfismos-308 (G / A) en niños con DMT1 y su-hasta ahora-a los hermanos sanos. Luego probamos si la asociación entre el TNF-α y DMT1 genes es independiente de HLA. 87 niños diabéticos, a sus 78 hermanos, y 85 personas sanas de grupo de control se ha seguido. El mayor riesgo de DMT1 estaba conectado con alelos: DRB1 * 0401 (OR = 3,39; IC: 1.55-7.41), DRB1 * 0301 (OR = 2,72; IC: 1.48-5.01), DQB1 * 0201 (OR = 4,04; IC: 2,17-7,52), DQB1 * 0302 (OR = 5,08; IC: 2,54-10,14), y TNF-α-308 un alelo (OR = 2,59; IC: 1.23-5.44). Por otra parte desequilibrio en el ligamiento genético para TNF-α-308 con un alelo DRB1 * 0301 y DQB1 * 0201 se observó tanto en niños diabéticos y sus hermanos. Niños diabéticos y sus hermanos similares factores de riesgo genéticos para DMT1. La asociación entre el TNF-α-308 y un alelo DMT1 depende de HLA-DRB1 y DQB1 alelos.

INTRODUCCIÓN

La diabetes mellitus tipo 1 (DMT1) Se cree que el resultado de la eliminación selectiva de las células β de páncreas causada por la progresiva reacción inflamatoria autoinmune. En la actualidad se acepta que la susceptibilidad genética interactúa con los factores ambientales desconocidos es responsable de la base autoinmune de DMT1 [1, 2]. Ambas pantallas de genoma estudios y buscar genes candidatos han confirmado que DMT1 es un trastorno heterogéneo poligénica, con alrededor de 20 loci de contribuir a la susceptibilidad a la enfermedad [3 - 5]. Se cree que los genes más importantes, responsables de más del 50% del riesgo genético de desarrollar diabetes, están ubicados en la región HLA en el cromosoma 6p21 [6]. La primera región del HLA relacionados con la susceptibilidad a DMT1 (clase I HLA B8 y B15) se encontró hace treinta años [7]. La asociación positiva de determinados HLA de clase II con alelos DMT1-DQ8/DR4 y DQ2/DR3 en la mayoría de poblaciones caucásicas ha sido muy bien documentada [1, 6, 8]. El factor de necrosis tumoral α (TNF-α) que se conoce como citoquinas proinflamatorias implicadas en la patogénesis autoinmune y de las enfermedades infecciosas. Los genes de TNF-α se encuentran en la región HLA de clase III (250 kb centroméricas de la HLA-B y 850 kb telomérica de la clase II HLA-DR genes en los seres humanos) [9, 10]. Aunque la contribución de TNF-α a DMT1 no está bien establecido en los seres humanos en estudios multicéntricos, se ha demostrado en un modelo animal que TNF-α puede ser citotóxica para las células β-apoyada por ambos interleucina-1 e interferón-γ [11, 12]. NOD ratones que sobreexpresan el TNF-α en sus células β-están predispuestos a la diabetes [13]. Además se ha informado, que los niveles circulantes de los monocitos y de células T de tipo 1 citoquinas proinflamatorias se encuentra elevado en los pacientes a la aparición de la diabetes [14]. Se ha señalado en diversos estudios [9, 10, 15 - 17], que el TNF-α región contiene algunos polimorfismos (polimorfismos de nucleótido único-SNP), que podría estar conectado con otro secreción de citoquinas. Probablemente diferentes lugares en la región del promotor, en el primer intrón, en la 3'untranslated las regiones y los microsatélites podrían determinar los diferentes niveles de TNF-α producción [18 - 21]. El TNF-α polimorfismo promotor-308 en los humanos que impliquen la sustitución de guanina (conocidos como TNF1) de adenosina (conocido como TNF2) se ha utilizado con mayor frecuencia en los estudios asociados. Alelo TNF2 parece haber un verdadero significado funcional, ya que es mucho más fuerte activador transcripcional que el alelo TNF1 común [9]. En vista de la ubicación de genes, se ha especulado que el polimorfismo de este lugar podría contribuir a HLA asociación con DMT1. Estudios anteriores en las poblaciones de Europa occidental [22, 23] han indicado una fuerte asociación del alelo TNF2 con DMT1, sin embargo los autores de estos trabajos se propone que estas asociaciones podrán ser presentados por el típico vínculo de HLA desequilibrios (LD) calcula que entre alelos en el TNF locus y otros alelos de HLA región. Sin embargo los estudios sobre Oriente Medio poblaciones europeas son pocas y contradictorias. Se demostró en un estudio letón [24] que los microsatélites A5 y TNF2 son a la vez independientemente asociados con la enfermedad.

El objetivo de este estudio es una evaluación de factores elegidos de la susceptibilidad genética a DMT1 como HLA-DRB1, DQB1, y TNF-α polimorfismo-308 (G / A) en niños con diabetes y su hasta ahora saludable hermanos. Además nos gustaría para estimar si posible relación de TNF-α-308 (G / A) se debe a una asociación o primaria mediada por LD sensibles con el DRB1 y DQB1 alelos.

MATERIAL Y MÉTODOS
Temas

Un grupo de 87 niños diabéticos (52 varones y 35 niñas) en una mediana de edad de 10,19 años (7.52-12.56 cuartil, rango de edad 1,55-18,2) fueron seleccionados al azar como objeto de este estudio. Todos los pacientes fueron hospitalizados en el Departamento de Endocrinología y diabetología en Katowice con una nueva aparición de la diabetes. El diagnóstico de DMT1 se hizo de acuerdo con la OMS y ISPAD criterios [25]. Un criterio para la inclusión de matriculación para el estudio fue la presencia de al menos una enfermedad asociada a autoanticuerpos (GADA-65, IAA, o IA2A). El segundo grupo se estudió un grupo de 78 de su hermano relacionadas y / o hermana (40 varones y 38 niñas) en una mediana de edad de 10,82 años (7.08-14.18 cuartil, rango de edad 0.69-19.99) sin ningún tipo de síntomas de intolerancia a la glucosa y normal de glucosa en ayunas. Las muestras de sangre para las pruebas genéticas se han tomado una vez, tanto de niños diabéticos y sus hermanos, sin señales de diagnóstico de la diabetes. A medida que el grupo de control sanos, 85 sujetos (44 hombres y 41 mujeres, con edades entre 18-35 años), sin diabetes o cualquier otra enfermedad autoinmune en la familia se inscribieron.

PRUEBAS DE SANGRE
Prueba inmunológica

Las muestras para la enfermedad asociada a autoanticuerpos: descarboxilasa del ácido glutámico anticuerpos (GADA-65), la tirosina fosfatasa anticuerpos (IA2A) y los anticuerpos de insulina (IAA) se obtuvieron a partir de los niños con DMT1 antes de iniciar el tratamiento con insulina. Las concentraciones de autoanticuerpos fueron medidos por radioimmune ensayo (RIA-CIS Bio International) en el Departamento de Diagnóstico de Isótopos de la Universidad de Medicina de Silesia en Katowice conforme al protocolo descrito en las instrucciones de los kits. En el GADA y IA2A pruebas de ensayo, muestras de suero fueron incubadas con 125 I-etiquetados humanos TAG o recombinante humano IA2, respectivamente. Esto fue seguido por la adición de proteínas de fase sólida a un precipitado la etiqueta TAG-TAG anticuerpos o IA2-IA2 anticuerpos complejos. Después de centrifugación, el precipitado se había contado para 125 I y la cantidad de radiactividad en el precipitado fue proporcional a la concentración de GADA o IA2A en la muestra. La presencia de distribuir la AIA se estimó en base semicuantitativa, de la determinación de la unión de 125 I-Tyr-A 14 a la insulina sérica fracción precipitada por el glicol polietileno. Después de la incubación y centrifugación de la radiactividad sobrenadante se midió por el recuento en un contador gamma scintillation. Todas las pruebas se realizaron por duplicado. Las mediciones se va como sigue: en lugar de IA2A 0-50 U / mL, para GADA 0-300 U / mL, y de IAA 0-100%. Los resultados de GADA y IA2A por encima de 0,75 U / mL para la AIA y por encima de 7% se tomaron como positivos.

HLA pruebas

Los ensayos genéticos se realizan en el Centro Regional de Sangre en Katowice. HLA de clase II alelos fueron mecanografiados mediante PCR-SSP método. Alelo pruebas específicas One Lambda (CYTGEN, EE.UU.) se utilizaron para HLA-DRB1 * y DQB1 * a escribir. Muestras de sangre periférica (EDTA) fueron la fuente del ADN genómico. ADN fue aislado de la salazón a cabo utilizando el método 3-5 mL 6 M NaCl [26]. En primer lugar se leucocitos resuspendido en 5 mL SE buffer con la adición de 250 ul 20% SDS y 15 μ l Proteinase (10 mg / μ l). La incubación se llevó a cabo durante 17 horas a 37 ° C. Siguiente extracción de ADN se realizó con 12,5 ml de alcohol absoluto y muestras de ADN fueron almacenadas a temperatura ambiente (30 min) a secas. La mezcla de PCR consistió de mezcla D-listos para el consumo, Taq polimerasa (5 U / μ l) y ADN (100 ng / μ l). El programa de PCR se realizó de acuerdo al protocolo: 1 ciclo: 96 ° C (130 segundos) y 63 ° C (60 seg), el próximo 9 ciclos: 96 ° C (10 segundos) y 63 ° C (60 seg), y por último, 20 ciclos: 96 ° C (10 sec), 59 ° C (50 sec), 72 ° C (30 seg). Después de la electroforesis en gel de los productos PCR, Transiluminador UV se utiliza para la visualización y completar un patrón de amplificación.

TNF-α polimorfismo-308 (G / A) las pruebas

El polimorfismo en la región promotora del TNF-α poli-morfismo-308 (G / A) fue identificado mediante PCR-SSP método. Comercial One Lambda (CYTGEN, EE.UU.) se utilizó kit [27]. ADN de los leucocitos humanos fue preparado por la salazón a cabo utilizando el método 6 M NaCl [26]. Muestras de ADN antes de PCR fueron resuspendido en 10 mM Tris HLC, ph 8.0-9.0 a una operación de concentración 100 ng / ul. Los reactivos de PCR fueron los siguientes: el ADN muestra (19 ul), D-Mezcla listo para su uso (180 ul), y Taq Polimerasa (concentración de 5 U / ul ul -1). PCR ciclismo condiciones fueron las siguientes: 1 ciclo de 96 ° C (130 segundos), y 63 ° C (60 seg), el próximo 9 ciclos: 96 ° C (10 segundos) y 63 ° C (60 segundos) y 20 ciclos: 96 ° C (10 sec), 59 ° C (50 seg), y 72 ° C (30 seg). Por último los productos de PCR fueron separados en gel de agarosa que contenía buffer TBE y visualizado por Transiluminador UV.

ANALISIS ESTADISTICO

La frecuencia de los alelos HLA y de polimorfismo TNF-α 308 (G / A) se estimaron en cada grupo con una expectativa de maximización (EM) algoritmo, tal como se aplica en Arlequin 2,000 programa [28]. El desequilibrio en el ligamiento genético entre alelos de loci estimado fue determinada por D estadística: D = p un b -- p un p b para dos alelos en comparación loci 1 y 2, donde p significa una frecuencia de un alelo en el primer lugar estimado, p b significa frecuencia del alelo b en el segundo lugar estimado, p ab significa la frecuencia de par ab.

Para evaluar el riesgo asociado a factores genéticos la odds ratio (OR) con un 95% intervalo de confianza (IC) se calculó para todos los alelos y haplotipos de acuerdo con la fórmula de la Woolf. La última verificación de los factores de riesgo para DMT1 se llevó a cabo después de la creación de múltiples modelo de regresión logística. El modelo fue construido en etapas. En primer lugar el análisis univariado se utilizó para identificar todas las variables discretas de predicción de aparición de la diabetes. Para cada uno de ellos ecuación de regresión logística se realizó. Utilizando algoritmo paso adelante, la mejor clasificación fue el modelo buscado. La variable del más alto poder predictivo fue elegida como la primera. El resto de variables se han añadido en el próximo paso. El proceso de búsqueda se acaba, cuando ninguna de las restantes variables mejorado de forma significativa la clasificación de las propiedades del modelo. χ 2 y la calificación estadística C p criterio se aplica para los modelos de comparación.

RESULTADOS

Tipificación genética de HLA-DRB1 y DQB1 en el bajo nivel de resolución en niños diabéticos reveló predominio de los siguientes alelos: DRB1 * 04 (33,33%), DRB1 * 03 (31,03%), DQB1 * 02 (39,65%) y DQB1 * 03 (37,93%). Los haplotipos reconocidos como predisponentes a la enfermedad: DRB1 * 04 DQB1 * 03 (65,5%, 57 niños) y / o DRB1 * 03 DQB1 * 02 (62%, 54 niños) fueron encontrados en la mayoría de los niños enfermos (91%, 79 los niños). No hubo diferencias significativas en la frecuencia del haplotipo en relación con el sexo o la edad en el inicio. Tipificación genética de HLA-DRB1 y DQB1 en el bajo nivel de resolución en hermanos de niños diabéticos reveló predominio de los siguientes alelos: DRB1 * 03 (23,72%), DRB1 * 04 (23,08%), DQB1 * 02 (30,77%), y DQB1 * 03 (33,33%). Al igual que los malos predominio de los hermanos siguientes haplotipos se observó: DRB1 * 03 DQB1 * 02 (47,4% y 37 niños) y DRB1 * 04 DQB1 * 03 (44,8%, 35 niños).

El análisis comparativo de la distribución de DRB1 y DQB1 alelos se realizó sobre la base de las familias con pares: los niños malos-hijo sano. Niños diabéticos sin hermanos fueron excluidos de esta parte del análisis. En las familias con algunos niños sanos, una de ellas fue seleccionada al azar. Por último los 44 pares de los niños fueron comparados con los 85 sujetos sanos del grupo control. La distribución de las estimaciones de alelos DRB1 y DQB1 en todos los grupos se muestra en los cuadros 1 y 2. Mundial de prueba, mientras que la comparación de todos los grupos mostraron que tanto los niños diabéticos y sus hermanos difieren significativamente de los sanos grupo control (P <.001), sin diferencia entre pares examinados (P = .1039). Alelos asociados con el mayor riesgo de DMT1 en la población examinada en el DRB1 genes fueron los siguientes: 0401 (OR = 3,39; 1,55-7,41) y 0301 (OR = 2,72; 1,48-5,01), mientras que en DQB1 genes: 0302 (OR = 5,08; 2.54-10.14) y 0201 (OR = 4,04; 2,17-7,52). El riesgo fue significativamente superior cuando coexisten alelos en los dos loci. El riesgo calculado para determinados haplotipos fue el siguiente: DRB1 * 0401 DQB1 * 0302 (OR = 10,67; 3.49-32.67) y DRB1 * 0301 DQB1 * 0201 (OR = 4,73; 2,4-9,34). Por otra parte, la fuerte protección contra la diabetes se asoció con el alelo de DRB1 * 1501 (OR = 0,06; 0,01-0,44) y en menor medida con el alelo DQB1 * de 0301 (OR = 0,1; 0,02-0,46).

La variabilidad genética de TNF-α-308 fue analizado en 44 pares de niño diabético hermano-y 36 temas seleccionados al azar de un grupo de control. El propósito de este análisis es dar respuesta a la pregunta de si este polimorfismo puede ser un factor de riesgo para DMT1. El estudio reveló diferencias significativas sólo entre los diabéticos y los niños sanos grupo control (P = .013). La presencia del alelo TNF2 se asocia con mayor riesgo de DMT1 (36,36% frente al 18,1%, OR = 2,59; 1,23-5,44). La distribución de TNF-α-308 polimorfismos en todos los grupos se muestra en la Tabla 3.

El análisis de muestras genéticas confirma desequilibrio en el ligamiento genético (LD) de alelos DRB1 y DQB1 asociados a la predisposición a DMT1 en todos los grupos, ya se ha informado en la literatura [1, 6, 8]. Para niños diabéticos valor de D es la siguiente: en lugar de alelos DRB1 * 0401 y DQB1 * 0302 (D = 0,14; χ 2 = 46,04; P <.001) y de alelos DRB1 * 0301 y DQB1 * 0201 (D = 0,21; χ 2 = 72,09; P <.001). LD Además se señaló para el TNF-α-308 con un alelo DRB1 * 0301 alelo (D = 0,13; χ 2 = 29,16; P <.001) y DQB1 * 0201 alelo (D = 0,12; χ 2 = 2,95, P <.001) en niños diabéticos. La LD similar se observó en los hermanos para TNF2 con DRB1 * 0301 (D = 0,13; χ 2 = 49,76; P <.001) y para TNF2 con DQB1 * 0201 (D = 0,11; χ 2 = 26,91; P <. 001).

La evaluación final de la susceptibilidad genética a DMT1 examinado en el grupo de niños diabéticos se basa en las múltiples modelo de regresión logística. En primer lugar todas las variables discretas de predicción de aparición de la diabetes en el análisis univariado fueron tomadas en cuenta lo siguiente: el DRB1 * 04, DRB1 * 0301, DQB1 * 0302, DQB1 * 0201, DRB1 * 04 DBB1 * 0302, DRB1 * 0301 DQB1 * 0201, y la TNF2. Por último las siguientes variables permanecieron en el modelo: DRB1 * 04, DQB1 * 0302, DRB1 y DQB1 * 0301 * 0201. La presencia de estos alelos haplotipo y determina la clasificación correcta de niños diabéticos en 90,1%. Alelo TNF2 no correcta clasificación significativamente las propiedades del modelo. El modelo se describe en el cuadro 4. El modelo predictivo de la aparición de DMT1 podría describirse como sigue: P c = e β 1 + e β donde β = -2,30 + 1,94 DRB1 * 04 + 1,80 DQB1 * 302 + 4,10 DRB1 * 0301 DQB1 * 201.

DISCUSIÓN

Este estudio es el primer informe de HLA: DRB1, DQB1, y TNF-α-308 asociación con DMT1 polaco en el suroeste de la población (exactamente en la población de la Alta Silesia). Al igual que en la mayoría de poblaciones caucásicas estudiado hasta la fecha [1, 6, 8, 29], haplotipos: DRB1 * 04 DQB1 * 0302 y DRB1 * 0301 DQB1 * 0201 mostró la mayor asociación con la aparición de DMT1 también en este estudio. Al comparar nuestros datos con otros estudios realizados en Polonia [30, 31], algunas similitudes y diferencias se pueden observar. En general, las distribuciones de alelos DRB1 y haplotipos relacionados con DMT1 en diferentes subpoblaciones de nuestro país son bastante similares de la misma haplotipos para determinar la predisposición y la protección de la enfermedad. Sin embargo las frecuencias de alelos DQB1 y asociaciones con DMT1 examinado difieren en polaco subpoblaciones. En los niños de la región central de Polonia [30] sólo alelo DQB1 * 0302 determina alto riesgo de DMT1 (OR = 5,59; IC: 3.26-9.58), que se corresponde con el riesgo en nuestra población (OR = 5,08; IC: 2,54 - 10.14) y el riesgo en la región nororiental de Polonia (RR = 19,8) [31]. La conexión positiva con DMT1 de DQB1 * 0201 no se observó en los niños de la región central de Polonia, mientras que se confirmó en el noroeste de la subpoblación de Polonia (RR = 6,25) y en nuestro estudio (OR = 4,04; IC: 2,17 -7,52). En el otro lado el mayor efecto protector de DQB1 * 0602 no se observó en nuestro estudio como opuesto al estudio antes mencionado. Se debe probablemente a muy diferentes de distribución de este alelo en la población sana de control (la frecuencia de DQB1 * 0602 en Silesia la población es del 8,2% frente al 34,2% en el noroeste de la subpoblación de Polonia). Esa gran diversificación de las estimaciones de alelos en las diferentes regiones de Polonia es probablemente el resultado de la histórica y aspectos económicos, como por ejemplo la migración de población polaca a causa de cambios en las fronteras y para la región más urbanizada de Polonia (región de la Alta Silesia).

Estudios anteriores en las poblaciones europeas [23] y en los EE.UU. [32] indica una fuerte asociación entre el TNF-α-308 un alelo (TNF2) y DMT1. En uno de los primeros estudios [23] una diferencia significativa en alelo frecuencia entre los pacientes y grupo control se observó (P = .03), pero también muy fuerte asociación del alelo TNF2 raro con el HLA-B8 y HLA-DR3 se observó . El riesgo relativo de DMT1 (RR) en este estudio se calculó para los genes HLA de la siguiente manera: 3,1 para DR3 y 2,2 para TNF2. La conexión entre TNF2 y DMT1 fue confirmada en otros estudios, además de estudios de diferentes poblaciones mostraron la diversificación de la distribución de TNF2 en la población general. La frecuencia de TNF2 en poblaciones caucásicas se estima en alrededor de 17-22% [22, 23], mientras que en los países de Asia se encuentra en muy raras ocasiones el 1-3% [32]. También se describen en población marroquí [33] que la presencia de un alelo en ambos cromosomas podría llevar sorprendente efecto. Independiente de LD con HLA de clase II, TNF-308 haplotipo TNFa * 2 + 252 TNFB * 2 mostró un efecto protector significativo (OR = 0,031) contra la enfermedad. Los autores de este trabajo explicó que este resultado podría ser detectado, ya que Marruecos pone de manifiesto la mayor frecuencia del alelo TNF2 comunicado todavía (genotipos: 25,9% para el TNF * 1, 2 y 19,8% para TNF * 2, 2 en la población general).

En este estudio alelo TNF2 responsable de la secreción más alta se observó en el 36,4% de los niños con DMT1, mientras que en el grupo control se constató pocas veces-a 18,1% (P = .013). Por lo tanto alelo TNF2 podría ser reconocido como un factor de riesgo para DMT1 (OR = 2,59; 1,23-5,44). Sin embargo, este resultado debe interpretarse con cautela porque de LD entre el TNF-α y alelos alelos HLA: DRB1 y DQB1. En un análisis comparable entre LD y TNF2 alelos DRB1 * 0301 y DQB1 * 0201, tanto en niños diabéticos y sus hermanos fueron reconocidos. Estos resultados son aún otra confirmación de los resultados de los estudios realizados en otras poblaciones caucásicas que la conexión de TNF-α con DMT1 depende de los genes HLA [22, 23, 32]. Resultados obtenidos son también la siguiente prueba real de similitud genética de los hermanos. Las diferencias significativas en la distribución de TNF2 se observaron sólo cuando se comparan los niños diabéticos con grupo control, sin embargo no hubo diferencias entre niños diabéticos y sus hermanos. Se ha demostrado en otro estudio [34] en que los miembros de la familia saludable de los niños con DMT1 sobreproducción de citoquinas proinflamatorias existido. Debido al hecho de que muchos factores genéticos y immunoregulatory anomalías que participan en dibetogenesis son compartidos por los hermanos sanos, otros estudios deben realizarse para determinar cuáles son los factores que están obligados a hacer la enfermedad en este telón de fondo.

CONCLUSIÓN

Niños diabéticos y sus hermanos sanos similares factores de riesgo genéticos para DMT1: alelo DRB1, DQB1 y polimorfismos de TNF-α-308 (G / A). La asociación entre TNF2 y DMT1 depende de HLA-DRB1 y DQB1 alelos.

El proyecto fue parcialmente apoyado por el polaco Comité Estatal de Investigación Científica (KBN), subvenciones no. 4PO 5E073 y 3T11F 010 29.