BMC Plant Biology, 2006; 6: 24-24 (más artículos en esta revista)

Almacenamiento de perfiles de proteína en español y finalista del mercado y los cacahuetes tipo de potenciales marcadores

BioMed Central
XQ Liang (liang804@yahoo.com) [1], M luo (mluo@tifton.uga.edu) [1], CC Holbrook (holbrook@tifton.usda.gov) [4], BZ Guo (bguo @ tifton. usda.gov) [1]
[1] USDA-ARS, Crop Protection y Gestión de la Unidad de Investigación, Tifton, GA, EE.UU.
[2] Guangdong Academia de Ciencias Agrícolas, Instituto de Crop Sciences, Guangzhou, China
[3] Universidad de Georgia, Departamento de Cultivos y Ciencias del Suelo, Tifton, GA, EE.UU.
[4] USDA-ARS, Cultivos Genética y Cría Unidad de Investigación, Tifton, GA, EE.UU.

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Resumen
Fondo

Proteómicos análisis ha demostrado ser el más poderoso método para describir las especies de plantas y líneas, y para la identificación de proteínas en mezclas complejas. La ventaja de este método reside en el alto poder de resolución de dos dimensiones de electroforesis (2-DE), junto con muy sensible a espectrometría de masas (MS), y de homología de secuencia de búsqueda. Al utilizar este método, podemos encontrar los marcadores polimórficos para diferenciar las subespecies de maní.

Resultados

Total de proteínas extraídas de semillas de 12 diferentes genotipos de maní cultivado (Arachis hypogaea L.), compuesto de corredor de mercado (A. hypogaea ssp. Hypogaea) y español-racimo tipo de mercado (A. hypogaea ssp. Fastigiata), se separaron por electroforesis en tanto uno y dos-dimensional SDS-PAGE geles. Los perfiles de proteína fueron similares en una dimensión geles para todos los genotipos de maní a prueba. Sin embargo, maní genotipo A13 carecían de una gran banda con un peso molecular de aproximadamente 35 kDa. Hubo una pequeña banda con un peso molecular de 27 kDa que estuvo presente en todos los genotipos de maní runner y el español de derivados (GT-YY7, GT-YY20, y GT-YY79). El español de productos derivados tienen un corredor de tipo de maní en sus genealogías. La proteína de 35 kDa en la A13 y 27 kDa proteína en subcampeón de genotipos de maní tipo fueron confirmadas por la 2-D SDS-PAGE geles. Entre más de 150 puntos principales de proteína en la 2-D geles, cuatro spots de proteínas que son marcados individualmente como manchas 1-4 mostraron patrones polimórficos entre corredor y de tipo español-racimo cacahuetes. Spot 1 (ca. 22,5 kDa, pI 3.9) y al contado 2 (ca. 23,5 kDa, pI 5,7) se observaron en español de todos los genotipos montón, pero no se encontraron en corredor tipos. Por el contrario, al contado 3 (ca. 23 kDa, pI 6.6) y al contado 4 (ca. 22 kDa, pI 6.8) estuvieron presentes en todos los genotipos de maní runner, pero no en español-racimo genotipos. Estos cuatro puntos son proteínas secuenciadas. Sobre la base de los internos y N-terminal de secuencias de aminoácidos, las proteínas son estas isoformas (iso-Ara h3) el uno del otro, se iso-alérgenos y podrá ser modificado por el post-translacional división.

Conclusión

Estos resultados sugieren que puede haber una asociación entre estas proteínas polimórficas isoformas de almacenamiento y maní subespecie Fastigiata (tipo español) y hypogaea (tipo corredor). Los péptidos de proteínas polimórficas distinguido por 2-D índices podrían ser utilizados como marcadores para la identificación del corredor español y los cacahuetes.

Fondo

Existe una considerable variación en Arachis hypogaea L. subespecie hypogaea y Fastigiata Waldron, que son más clasifican en cuatro tipos de mercado corredor entre ellas, Virginia, español, y Valencia [1]. La mayoría cultiva cacahuetes pertenecen a corredor español y tipos. Muestran genéticamente determinada variación de una serie de botánicos y agronómicos incluyendo rasgos de ramificación y floración hábitos, las semillas de latencia y tiempo de maduración. Sin embargo, hay pocos categórico criterios para distinguir subespecies debido a la limitada polimorfismo molecular detectable. Recientemente, varios enfoques moleculares se han empleado para evaluar la diversidad genética y las relaciones taxonómicas. Entre ellos se encuentran las isoenzimas [2], los fragmentos de restricción polimorfismos de longitud (RFLP), amplificación de polimorfismos al azar (RAPD), amplificación de polimorfismos de longitud de los fragmentos (AFLP), y repite la secuencia simple (SSR) [3 - 6]. Sin embargo, muy poco polimorfismo genético entre las dos subespecies se detectó. Singh et al. [7, 8] y Bianchi-Hall et al. [9] encontró muy poca o ninguna variación entre maní cultivado sobre la base de perfiles de las proteínas.

Hasta la fecha, proteómicos análisis ha demostrado ser el más poderoso método para describir las especies de plantas y las líneas [10], y la identificación de proteínas (especialmente los marcadores de proteínas) en mezclas complejas. La ventaja de este método reside en el alto poder de resolución de dos dimensiones PAGE (2D-PAGE), junto con la secuenciación de polipéptidos muy sensible espectrometría de masas (MS), tales como ionización electrospray espectrometría de masas en tándem (ESI-MS/MS), y la secuencia homología de búsqueda en bases de datos [11].

El objetivo de la investigación se describe en este trabajo es investigar la capacidad de análisis proteómicos para evaluar la diversidad de las proteínas de almacenamiento de semillas de maní en subespecies o un cultivar de identificación. Subespecies o un cultivar de proteínas específicas, si es que existen, debe ser útil para estudios genéticos, la reproducción, taxonomía y relaciones evolutivas en maní.

Resultados
El análisis de la electroforesis en gel

Total extractos de proteínas de seis y seis corredor español manojo de cultivares de maní y las líneas estaban separadas por una-dimensional SDS-PAGE, y los perfiles de proteínas reveló pocos diferencia importante entre todos los genotipos de maní a prueba (Fig. 1]. Las proteínas fueron resueltas en cuatro grupos (conarachin, ácidos arachin, arachin básicos, y menores de 20 kDa). Todos menos uno de maní genotipo tenía tres bandas fuertes en el rango de 35 a 45 kDa, que se corresponde con ácidas arachins. A13 Runner maní no tienen este 35 kDa del polipéptido, una subunidad de Ara h3 presente en otros genotipos. Este 35-kDa proteína péptido se informó como un 36-kDa de proteínas asociadas con maní en blanchability [12]. Una banda de proteínas polimórficas con un peso molecular de aproximadamente 26 kDa estuvieron presentes en los seis genotipos de tipo finalista y tres derivados español YY7-GT, GT-YY79, y GT-YY20, que todos tienen un corredor tipo de maní, Induhuanpi, en sus genealogías (Fig. 1].

Se utilizó en dos dimensiones de electroforesis (2-D PAGE) para lograr un mejor perfil proteico de cada genotipo (Fig. 2 y Fig. 3]. Proteínas totales de 12 cultivares de maní o la cría de líneas fue sometido a 2-D PAGE, lo que resulta en unos 150 puntos se encuentran en todos los cultivares. Estas proteínas péptido lugares cubiertos una serie de puntos isoeléctricos (Pis Pis Pis) (pH 3-10) y masas moleculares (10 - 66 kDa). Muchos componentes que se registraron en SDS-PAGE gel como una única banda (Fig. 1] se resolvieron en distintos lugares con diferentes valores de PI de 2-D PAGE geles (Fig. 2 y Fig. 3]. El grupo conarachin (Ara h1) con alrededor de 65 kDa de peso molecular SDS-PAGE fue separada en muchos lugares con diferentes Pis Pis Pis. Curiosamente, los ácidos arachin grupo con tres bandas claro que van de 35 - 45 kDa en todos los genotipos, pero A13 (Fig. 1] se resolvió en dos bandas de SDS-PAGE. Hubo adicionales polimorfismo en 2-D PAGE mostrando un terreno adicional en maní tipo español, tal como se indica por una flecha cabeza (Fig. 2], que confirmó el informe de Bianchi-Hall et al. [9]. El 35 kDa y 26 kDa proteína bandas, puso de manifiesto en SDS-PAGE, fueron confirmados en 2-D PAGE. La base arachin grupo con una gran banda en SDS-PAGE en alrededor de 22 kDa fue separada en varias subunidades o manchas en la 2-D con índices distintos puntos isoeléctricos y ligeras diferencias en los pesos moleculares (Fig. 2 y Fig. 3]. Estos patrones reveló polimorfismos entre corredor y tipo español tipo genotipos. Hubo cuatro lugares distintos de proteínas etiquetadas como manchas 1-4. Spot 1 (ca. 22,5 kDa, pI pI 3.9) y al contado 2 (ca. 23,5 kDa, pI pI 5,7) se observaron en español de todos los genotipos montón, pero no se encontraron en los tipos de corredor. Por el contrario, al contado 3 (ca. 23 kDa, pI pI 6.6) y al contado 4 (ca. 22 kDa, pI pI 6.8) estuvieron presentes en todos los genotipos corredor, pero in situ 3 no era en español-racimo tipo genotipos; terreno 4 estuvo presente en dichas adhesiones con menor concentración. El puesto de manifiesto los patrones polimórficos en 2-D PAGE se podrían utilizar para diferenciar subespecie Fastigiata (tipo español) (Fig. 2] y subespecie hypogaea (tipo corredor) (Fig. 3].

Análisis de secuencias del polipéptido

Secuencia de la proteína péptido análisis se llevó a cabo. Los cuatro proteínas polimórficas puntos 1-4 fueron extirpados de la 2-D PVDF geles y membranas para la secuenciación de péptidos. Para la secuencia interna, dos a tres péptidos fueron recogidos al azar y cada secuencia de terreno después de tripsina-gel digestión. El interior y N-terminal del péptido de secuencias obtenidas para cada terreno y su homología identificados a través de búsquedas en bases de datos se resumen en la Tabla 2 y Fig. 4. Todos los fragmentos péptido tenía una participación importante en una homología de secuencia con alergenos conocidos maní, Ara h3, Ara H4, y Ara iso-h3 [13] (Fig. 4]. Curiosamente, todas las secuencias de aminoácidos de estos 4 puntos en la Fig. 2 y Fig. 3 están presentes en diferentes regiones de las proteínas de cacahuete alergeno como alineado con el alergeno publicado secuencias de maní (Fig. 4].

Secuencia de péptido 1 terreno era único, y presente sólo en español-tipo cacahuete. Dos péptidos secuenciados después en tripsina-gel digestión son las mismas, al tiempo que dio un fragmento de 100% (FYLAGNQEQEFLR) la identidad y otro fragmento dio 88% (14 de los 16 aminoácidos) identidad con la norma ISO-Ara h3. La N-terminal de secuencia (VGQDDPSQQQ) de terreno 1 fue del 100% idénticos a iso-Ara h3, mientras que Ara Ara h3 y H4 con dos aminoácidos que faltan en esta región (Fig. 4]. N-terminal de secuenciación para 2 terreno in situ y 3 dio lugar a las secuencias que contienen VTFRQGG, idéntica a la secuencia de iso-Ara h3 [13]. La N-terminal de secuencia de 4 terreno se GIEETICSASVK, 100% idénticos a iso-Ara h3 y un aminoácido (S / T) diferentes de Ara Ara h3 y H4, el apoyo a ese punto 4 es el C-terminal de esta proteína que siempre comienza con GIEETIC [13].

Discusión

La intención inicial de este estudio fue el perfil de proteínas de almacenamiento mejorado utilizando el método de extracción de proteínas y para identificar los marcadores de proteínas que podrían ser utilizados para separar las subespecies de maní, como hypogaea y Fastigiata, con el fin de seleccionar diversas líneas de cría para la construcción de mapas de población. Con base en el anteproyecto de perfiles de proteína [14], hemos elegido Tifrunner y GT-YY20 para el desarrollo de líneas puras recombinantes (RILs) para mapeo genético. El 2-D PAGE geles, varias proteínas, etiquetados como manchas 1-4 con similar masa molecular y diferentes Pis Pis Pis, fueron secuenciados. Las secuencias de péptidos obtenidos a partir de estos puntos se suman a todos los alérgenos de maní, como iso-Ara h3 (AAT39430), lo que indica que este gen codifica la proteína puede ser procesada de distinta manera en varias subespecies de maní. La secuencia de cDNA parcial (número de AY618460 ) Se depositó en GenBank por Kang y Gallo-Meagher [15] en 2004. A continuación se detallan longitud cDNA secuencia identificada en nuestra secuencia EST proyecto se ha presentado al GenBank ( DQ855115 ). El interior y N-terminal del péptido secuencias terreno 1 sugieren que la aparente reorganización de la secuencia de aminoácidos se ha producido (Fig. 4].

En la mayoría de maní de almacenamiento de las semillas de proteínas (alrededor del 87%) es la globulina que consta de dos grandes fracciones, arachin y conarachin [16]. El arachin subunidades consisten en la polipéptidos ácidos y polipéptidos de base [17]. La uniformidad de las dimensiones de un SDS-PAGE de proteínas dentro de los perfiles de tipo finalista y español tipo cultivares y líneas de cría está de acuerdo con los estudios [7 - 9], lo que indica que muy baja variación en los perfiles de proteína se detectó en el cultivo de maní mediante SDS - PAGE electroforesis en gel.

En general, SDS-PAGE no es lo suficientemente poderosa técnica para distinguir un determinado cultivar. Por lo tanto, hemos aprobado el protocolo utilizado ampliamente desarrollado por Damerval et al. [18] e introdujo algunas modificaciones incluyendo un anteproyecto de paso-fatting de semillas de maní 2-D PAGE separación. Hemos sido capaces de generar 2-D electroforesis en gel de separación con resolución superior y la recuperación de semillas de maní. Bianchi-Hall et al. [9] informó de que los polipéptidos de ácidos arachin utilizando SDS-PAGE español distinguir de otros cultivares tipo de mercado. En este estudio, no identificó las cuatro bandas en el rango de ácidos arachin de SDS-PAGE (Fig. 1], pero podríamos detectar el cuarto lugar de las proteínas en 2-D PAGE de los genotipos de tipo español (Fig. 2] . También se detectó un 26 kDa del polipéptido de SDS-PAGE; este polipéptido se podrían utilizar para diferenciar el español y el corredor.

Conclusión

Este estudio demostró que en dos dimensiones de electroforesis (2-D PAGE) logró una mejor resolución de los perfiles de proteínas de semillas de maní, revelando entre polimorfismos corredor español y genotipos. La base arachin grupo, habiendo una gran banda en SDS-PAGE en geles de alrededor de 22 kDa, se resolvió en varias subunidades o manchas en la 2-D con índices distintos puntos isoeléctricos y ligeras diferencias en los pesos moleculares. Estas proteínas son isoformas (iso-Ara h3) el uno del otro y el iso-alérgenos pueden ser modificados por el post-translacional división. Estos resultados sugieren que puede haber una asociación entre estas proteínas polimórficas isoformas de almacenamiento y maní subespecie Fastigiata (tipo español) y hypogaea (tipo corredor). Los estudios futuros podrían ser diseñados para probar la alergénicos reacciones de estos genotipos de maní con diferentes perfiles de proteínas y de asociación con la resistencia a la contaminación por aflatoxinas [19].

Métodos
Materiales vegetales

Doce genotipos de maní se utilizaron en este estudio. Hubo seis subcampeón de genotipos de maní tipo: Georgia Green, A100, A104, GK7, A13 y Tifrunner, y seis españoles-racimo tipo genotipos de maní: ICGV 95435 (International Instituto de Investigación de Cultivos para las Zonas Tropicales Semiáridas, Patancheru, India), MXHY y ZQ48 (chino criollas), y GT-YY20, YY7-GT y GT-YY79 (español derivados corredor con maní tipo en sus genealogías, obtenidos a partir de Instituto de Investigación de Cultivos, Guangdong Academia de Ciencias Agrícolas, China). Para evitar los efectos de diferentes lugares, todos los genotipos cultivados en Tifton, GA en 2003. Las semillas fueron recolectadas en plena madurez por las prácticas de producción normal. Después de la cosecha, las semillas fueron secadas al aire a 40 ° C y almacenarse a una temperatura de 4 ° C antes de su uso.

Total de extracción de proteínas

La extracción de proteínas totales se modificó de TCA / Acetona protocolo de extracción de proteínas [18] con el primer paso de de-fatting usando hexano. Dry el cacahuete núcleos (20 g) de cada genotipo se congelaron en nitrógeno líquido y tierra a polvo en un molino y desgrasada con hexano (10 ml / g de peso en seco) a -20 ° C durante la noche. El desgrasada muestras fueron recolectadas por centrifugación (15000 × g durante 10 min a 4 ° C), secado al aire, tierra y al pago de una multa de polvo en un pre-refrigerada de mortero y pestle en nitrógeno líquido. La extracción de proteínas y las precipitaciones se han realizado en un 10% (w / v) de ácido tricloroacético en acetona fría con el 0,07% (v / v) β-mercaptoetanol a -20 ° C durante 2 h, seguido por centrifugación a 10000 × g durante 10 minutos a 4 ° C. Los pellets se lavaron dos veces con acetona fría que contenga 0,07% de β-mercaptoetanol, seguido por el lavado en frío en dos ocasiones con el 80% de acetona y luego se centrifuga a 10000 × g durante 10 min a 4 ° C. Los pellets se seca al aire y se almacenan a 4 ° C durante la noche. El total de proteínas se disolvieron en tampón de lisis (10 μ l / mg) que contiene 9,5 M de urea, un 4% Igepal CA-360 (Sigma, St Louis, MO), el 2,5% ampholytes (0,5 pH 3.0-10%, 0,5% pH 4 -6, 1,5% y pH 6-8) (Sigma), el 5% β-mercaptoetanol, y se mantiene a 35 ° C durante 30 min. Después de centrifugación (15000 × g, 20 min, 25 ° C), el sobrenadante se recogió para la carga en la primera dimensión electroforesis en gel, o alternativamente, para el almacenamiento a -20 ° C hasta su uso. El sobrenadante concentración de proteínas fue determinado usando el Bradford [20] ensayo. El experimento se llevó a cabo dos veces, y cada genotipo se ha ejecutado por lo menos tres veces.

SDS-PAGE y en dos dimensiones PAGE electroforesis

Total muestras de proteínas de estas doce genotipos de maní por primera vez perfilado utilizando SDS-PAGE (15% separa el gel con el 4% de gel de apilamiento) de acuerdo al método de Laemmli [21] con el Mini-PROTEÍNAS ® II Dual Losa Cell System (BIO-RAD , Hercules, CA) [22]. Proteínas totales (100 μ g) de cada una de las muestras se cargaron en SDS-PAGE geles. Gama baja en proteínas marcadores (Sigma) fueron utilizados como masa molecular estándar. Los geles fueron electrophoresed (120 V, 1,5 h), teñidas con 0,125% azul de Coomassie R-250 en el 40% de metanol y 10% de ácido acético. Por 2-D PAGE, el total de proteínas de semillas (1 mg) se cargaron en geles de tubo (8 M urea, el 4% de acrilamida, un 2% Igepal CA-630, 0,5% ampholyte pH 3.0-10, 0,5% ampholyte pH 4-6, 1,5% ampholyte pH 6-8, 0,01% de amonio persulfate, y el 0,1% TEMED), y superpuesta con 20 μ l muestra la superposición de amortiguación (4 M urea, 0,25% ampholyte pH 3.0-10, 0,25% ampholyte pH 4-6, 0,75% ampholyte pH 6-8, 2,5% de β-mercaptoetanol, 1% Igepal CA-360, y 0,05% Azul de bromofenol). Isoeléctrico centrándose (IEF) se llevó a cabo mediante el uso de Mini-Protean ® 2-D electroforesis de células (BIO-RAD). La superior e inferior de la cámara de buffers se NaOH 100 mM y 10 mM H 3 PO 4, respectivamente. IEF condiciones eran 200 V durante 15 min, 300 V durante 15 min, 400 V durante 30 min, y 750 V para 6 h. El tubo se centró geles fueron inmediatamente equilibrado durante 30 minutos en 10 ml de SDS equilibrio buffer (60 mM Tris-HCl, pH6.8, 2% SDS, 10% de glicerol, y el 0,05% Azul de bromofenol), o mantenerse a -20 ° C hasta el momento usar. Después de equilibrio, el tubo de geles fueron incorporados en un 1% de agarosa solución en la parte superior de la 2-D gel. La segunda dimensión se ha ejecutado el 15% de poliacrilamida-SDS geles en un Mini-Protean Cell ® 3 (BIO-RAD), 120 V durante 90 min. Los geles fueron teñidos con Coomassie azul brillante R250 y todos los geles fueron escaneadas y el terreno intensidades fueron analizados utilizando el software Image Master-2D (BIO-RAD). Los puntos interesantes de proteínas de las semillas entre los genotipos fueron identificados por gel-gel comparación. Para determinar el peso molecular, de bajo peso molecular estándar (Sigma) fue utilizada.

Secuenciación de péptidos

Proteína péptidos fueron extirpados de la 2-D PVDF geles y membranas para la secuencia del péptido de ionización electrospray utilizando la espectrometría de masas en tándem (ESI-MS/MS) para obtener secuencias de péptidos internos y la utilización de la degradación de Edman convencional método para obtener N-terminal de secuencias. Proteína manchas de los geles fueron extirpados con total combinado de proteína importe de hasta 10 pg, y fueron objeto de gel en la digestión y análisis de ESI-MS/MS para obtener la secuencia del péptido de información a la Química de Proteínas Core Facility, Baylor College of Medicine ( Houston, TX). Cuando las secuencias de péptidos podría no ser obtenida sin ambigüedades mediante el uso de ESI-MS/MS, la degradación de Edman se realizó utilizando un Applied Biosystems Procise CLC secuenciador para obtener la información secuencial para identificación de proteínas.

Electrobloting y N-terminal de secuencia

Para evitar el N-terminal de bloqueo durante la segunda dimensión electroforesis en gel, geles se vierte al menos 24 Horas antes de ejecutar y 0,1 mm thiodiglycolate se añadió como un scavenger en la parte superior de funcionamiento de amortiguación. 2-D geles fueron equilibradas durante 30 minutos en 25 mM Tris, 192 mM glicina, 10% MeOH (pH 8,3) y, a continuación, electroblotted a Immobilon-p-membrana de PVDF (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) a 300 mA para 4 hr en un Mini Trans-Blot ® electroforético de transferencia de células (BIO-RAD). La membrana fue equilibrado durante 5 min en agua desionizada y proteínas teñidas con 0,05% Coomassie Blue en el 1% de ácido acético y el 50% de metanol durante unos minutos, destained en el 50% de metanol hasta el fondo era de color azul claro. La membrana se enjuagarse durante 5-10 minutos en agua desionizada y secado al aire. Spots fueron extirpados y se utiliza para el N-terminal de aminoácidos microsequencing en la Escuela de Medicina de Baylor (Houston, TX).

Base de datos de análisis de homología de secuencia

Interior y N-terminal del péptido de homología de secuencia de identificación se realizó mediante la adaptación básica local herramienta de búsqueda (BLAST) [23] en contra de conocidos o traducido marcos de lectura abierta de las etiquetas de secuencias expresadas (EST) en las bases de datos en el Centro Nacional de Información de Biotecnología (NCBI) y SWISS-PROT.

Autores de las contribuciones

XQL realizó los experimentos y escribió el primer borrador del manuscrito. ML realiza la secuencia de búsqueda y CCS siempre materiales vegetales. BZG concebido la investigación y revisó el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias a Ernest Harris y Lewis Kippy de asistencia técnica en el campo y el laboratorio. Esta investigación fue apoyada en parte por fondos proporcionados por el USDA Servicio de Investigación Agrícola y la Fundación de cacahuates, y por los fondos proporcionados por la Cooperación Científica Programa de Investigación de EE.UU. Departamento de Agricultura-Servicio Agrícola Exterior entre EE.UU. y China. La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el fin de proporcionar información específica y no implica recomendación o apoyo de los EE.UU. del Departamento de Agricultura.