Journal of Immune Based Therapies and Vaccines, 2006; 4: 5-5 (más artículos en esta revista)

Phytol basada en nuevos adyuvantes en la formulación de la vacuna: 2. evaluación de la eficacia en la inducción de la respuesta inmunitaria protectora a las infecciones bacterianas letales en ratones

BioMed Central
Por lo tanto, Lim-Yon (slim@bidmc.harvard.edu) [1], Adam Bauermeister (abauerm2@UIUC.edu) [1], Richard A Kjonaas (rkjonaas@isugw.indstate.edu) [2], Swapan K Ghosh ( sghosh@isugw.indstate.edu) [1]
[1] Departamento de Ciencias de la Vida, Indiana State University, Terre Haute, EN 47809, EE.UU.
[2] Departamento de Química, Indiana State University, Terre Haute, EN 47809, EE.UU.

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Resumen
Fondo

Adyuvantes se sabe que mejorar significativamente la eficacia de la vacuna. Sin embargo, los adyuvantes comerciales a menudo tienen un uso limitado debido a la toxicidad en los seres humanos. El objetivo de este estudio fue determinar la eficacia comparativa de un diterpene alcohol, phytol y sus derivados hidrogenados PHIS-01, relativa a la incompleta adyuvante Freund (IFA), un adyuvante utilizado en aumentar la inmunidad protectora en ratones contra E. coli y S. aureus, y en términos de citoquinas inflamatorias.

Métodos

Vacunas, que consta de bomba de calor, atenuada E. coli o S. aureus y cualquiera de las dos phytol basada en IFA o adyuvantes, se pusieron a prueba en las mujeres ratones BALB / c. Las vacunas se administraron por vía intraperitoneal a 10 días. La eficacia de la phytol y PHIS-01, en comparación con el IFA, fue evaluada por ELISA en términos de anti-bacteriano de anticuerpos y citoquinas inflamatorias. También se examinaron la capacidad de las vacunas para inducir inmunidad protectora específica difícil de ratones con diferentes dosis de bacterias vivas.

Resultados y discusión

IFA, phytol, y PHIS-01 fueron igualmente eficaces en la evocación de lucha contra el E. coli respuesta de anticuerpos y en la prestación de inmunidad protectora contra el vivir E. coli desafíos. Por el contrario, la respuesta de anticuerpos a S. aureus fue significativa cuando PHIS-01 fue utilizado como adyuvante. Sin embargo, en términos de la capacidad de inducir inmunidad protectora, phytol fue más eficaz contra S. aureus. Por otra parte, durante los retos con vivir E. coli y S. aureus inmune produce ratones mucho menos IL-6, los mediadores de mortales síndromes de shock séptico.

Conclusión

Nuestros resultados muestran que la vacuna que contiene formulaciones phytol y PHIS-01 como adyuvantes confiere un sólido y la inmunidad protectora contra los Gram-negativas y gram-positivos, sin inducir a las bacterias perjudiciales de citoquinas inflamatorias debido a la IL-6.

Fondo

Inmunidad protectora en los vertebrados depende en gran medida eficaz en la activación y posterior interacción de las células pertenecientes a ambos innata y la inmunidad adquirida. El componente innata, sin embargo, no tiene memoria y es primero en responder, con sólo un repertorio limitado a reconocer patógenos asociados a patrones moleculares (PAMPs), generalmente presente en la estructuras de la pared celular de los microbios [1 - 3]. PAMPs funcionan como inmunoestimulantes o immunoadjuvants y hasta TOLL-regular-al igual que los receptores de células pertenecientes a la inmunidad innata que, a su vez activa la inmunidad específica adquirida. [4, 5]. La activación de la inmunidad mediada por B y los linfocitos T requiere por lo menos 3-4 días, pero dura mucho más tiempo y responde específicamente a una amplia gama de antígenos microbianos [6, 7]. Por lo tanto, las vacunas que interactúan con los dos componentes del sistema inmunitario tienen la capacidad de inducir la profilaxis eficaz contra una variedad de enfermedades infecciosas.

En la infección bacteriana, la respuesta de anticuerpos es fundamental para neutralizar las toxinas bacterianas o el bloqueo de su adhesión a las células huésped [8]. Los anticuerpos también ayudan a reclutar complemento para matar y disposición de los organismos, así como aumentar la obligatoriedad y la absorción por los fagocitos [9]. La mayoría de los antimicrobianos de las vacunas actuales en uso han sido diseñados para estimular respuestas de anticuerpos, y el desarrollo de inmunidad celular también es importante para superar las enfermedades infecciosas crónicas asociadas con patógenos intracelulares y los virus [10]. A pesar de los éxitos históricos con muertos o atenuados microbios como las vacunas, se cierne la amenaza de nuevos patógenos resistentes y requiere el desarrollo de nuevas y mejores versiones de las vacunas.

Molecular vacunas producidas por la tecnología moderna (por ejemplo, péptidos sintéticos, vacunas de ADN) son más seguras que las vacunas tradicionales, compuesto de muertos o inactivados organismos [11]. Debido a la relativamente limitada antigénica repertorio, las vacunas moleculares son a menudo poco inmunogénica y dependen de la co-administración de inmunoestimulantes o adyuvantes para ser eficaz. Por lo tanto, existe una constante necesidad de desarrollar nuevos adyuvantes que son: 1) seguro para el uso clínico; 2) capaz de mejorar la inmunogenicidad de la vacuna adecuada, y 3) que puedan mejorar el rendimiento de ambos tradicionales y molecularmente definidas las vacunas. A diferencia de la vacuna en sí, que se limita a menudo en acciones concretas y para cruzar los antígenos de reacción, los adyuvantes tienen mucho más amplio el uso de inmunoestimulantes con diferentes vacunas. En nuestro estudio en curso [12], hemos observado que phytol, un componente de alcoholes alifáticos de clorofila, y sus derivados, PHIS-01, son excelentes adyuvantes, superior en muchos aspectos a los comúnmente usados y disponibles comercialmente adyuvantes estándar (completo o incompleto de Freund adyuvante, Alum, Titermax, y Ribi sistema adyuvante). A diferencia de las convencionales adyuvantes, estos phytol basada en los adyuvantes son seguros con un alto beneficio a la toxicidad ratio, generar más de tipo IgG2a complementar la fijación de anticuerpos, y no desencadenar lupus-like síndromes en los ratones susceptibles [12]. También aumentar las células T citotóxicas respuesta (CTLs) dirigido hacia una murino linfoma no Hodgkin B [12].

Este estudio se inició para determinar la eficacia de phytol basada adyuvantes comúnmente se producen contra gram-negativas y gram-positivos bacterias. Escherichia coli y Staphylococcus aureus son frecuentes asociados con los patógenos nosocomiales y comunitarias de infecciones adquiridas en diversos sitios del cuerpo y los procesos de la enfermedad [13 , 14]. Presentamos aquí que phytol adyuvantes a base de aumentar la respuesta inmune a E. coli y S. aureus infecciones mejor que la IFA, el comúnmente utilizado comerciales adyuvante con menos efectos secundarios. Phytol adyuvantes a base de influir en muchos parámetros de respuesta inmune incluida su intensidad, duración, isotipo y especificidad. Por otra parte, las vacunas en ratones utilizando su conjunto, inactivada células bacterianas más el phytol adyuvantes proporcionar una protección duradera contra el reto intraperitoneal con altas dosis de vivir E. coli. Igualmente efectivas son atenuados por calor S. aureus vacunas más phytol adyuvantes, que producen una excelente respuesta de anticuerpos y la inmunidad duradera a S. aureus desafío.

Métodos
Cultivo bacteriano

Las bacterias, E. coli (ATCC número: 14948) y S. aureus (ATCC número: 25935), amablemente proporcionado por el doctor HK Dannelly del Departamento de Ciencias de la Vida), se cultivaron en caldo LB (Difco, Detroit, MI) a 37 ° C durante 14 horas y cosechada con tampón fosfato salino (PBS ). Las células fueron lavadas en PBS mediante centrifugación a 500 × g durante 10 min a 4 ° C y luego a la suspensión de la densidad adecuada en PBS. Las bacterias fueron asesinados por las suspensiones de calefacción a 60 ° C durante 1 hora.

Preparación del inmunógeno

Los ensayos de vacunas ya sea consistió 5 × 10 6 UFC de E. coli o S. aureus y diversos adyuvantes en un volumen total de 400 μ l. Adyuvantes utilizados en este estudio incluyen: IFA (Sigma Chemical Co, St Louis, MO), phytol (Pfaltz y Bauer Inc, Waterbury, CT) y PHIS-01 (pendiente de patente). PHIS-01 es uno de varios modificados químicamente phytol basada adyuvantes desarrollado en este laboratorio.

Ratones de inmunización y desafío

Mujeres ratones BALB / c (6-8 semanas de edad) fueron utilizados para todos los experimentos. Estos ratones fueron criados y mantenidos en las instalaciones de cuidado de los animales de la Universidad Estatal de Indiana. El uso de estos ratones se ha guiado por una estricta adhesión a un protocolo aprobado preparado bajo la vigilancia y supervisión de la Universidad del Estado de Indiana Cuidado de Animales y el empleo.

La inmunización se llevó a cabo en grupos de 4-5 ratones utilizando cualquiera de 5 × 10 6 UFC de E. coli o S. aureus y ensayos adyuvantes (IFA, Phytol, o PHIS-01) en un volumen total de 400 μ l. Las bacterias sin adyuvante en un volumen total de 400 μ l de PBS se utilizaron como control. Las vacunas se administraron por vía intraperitoneal (IP) y los animales fueron vacunados tres veces en 10 días. Los sueros fueron recogidos 5-7 días después de cada inmunización para el análisis de ELISA.

Para la protección de ensayo, los ratones fueron retados con una inyección de propiedad intelectual de E. coli o S. aureus (10 6, 10 7 y 10 8 UFC / ratón) en 1,0 ml de PBS. Retos tuvo lugar el día 5 después de la tercera inmunización.

Preparación de lisados de células bacterianas

Cultivos bacterianos fueron cosechadas y lavadas en PBS. Las células fueron zadas en 1 ml de solución tampón que contiene urea 8 M, 0,01 M Na-fosfato (dibásico), 0,01 M Tris-HCl (pH 8,0), y 5 μ l de inhibidor de la proteasa cóctel. Célula de los desechos se eliminan por centrifugación a 13000 × g durante 5 min a 4 ° C. Sobrenadante se recogió y la concentración de proteínas fue estimada sobre la base de absorbancia a 280 nm. La adopción de un procedimiento informado por Gómez et al. [6], estos lisados se utilizaron para revestir de 96 pocillos de las placas microtiter ELISA.

Inmunoensayo enzimático (ELISA)

Niveles de anticuerpos de ratón sueros fueron medidos habitualmente por un ensayo obligatorio para antígenos recubiertos de placas ELISA:

(a) de anticuerpos específicos de cepa: Cell-lisado revestidos placas ELISA fueron preparados por incubando policloruro de placas de 96 pocillos con 10 μ g / ml lisados celulares en 0,01 M de solución de bicarbonato de sodio durante la noche a 4 ° C. Después de bloquear con el 1% BSA / PBS noche a la mañana a 4 ° C, serie diluido sueros obtenidos a partir de ratones inmunizados se añadieron a cada pocillo, y se incubarán durante 1 hora a 37 ° C. Las placas fueron incubadas con conejo anti-ratón Ig-HRP y lavado. Encuadernación conejo anti-ratón Ig-HRP se detectó mediante la adición de o-fenileno diamina (OPD), y la intensidad se mide a 490 nm. Anticuerpos IgG específicos se expresaron como el promedio ± SEM.

(b) de anticuerpos específicos de LPS: LPS (Sigma Chemical Co, St Louis, MO) suspendió en PBS fueron colocados en poly-L-lisina (Sigma, St Louis, MO) precubiertos placas de ELISA y se incubarán durante 1 hora a 37 ° C. Las placas fueron lavadas tres veces con PBS que contenía 0,05% Triton-X, y realizaron pruebas ELISA usando las condiciones descritas por Takahashi et al [15].

Anticuerpos subclase determinación

Para determinar las características de respuesta de anticuerpos inducidos por vacunas, sueros inmunes del ratón se mecanografiadas para IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, y IgG3 clases utilizando anti-Ig de ratón específicos de subclase HRP-conjugado con anticuerpos secundarios (Zymed, San Francisco, CA), las indicaciones del fabricante, protocolo. La proporción de IgG1 e isotipos IgG2a se calculará dividiendo la A 405 valores de IgG1 de IgG2a.

SDS-PAGE y Western blot

Lisados de células, como se ha descrito anteriormente, se mezcla con un volumen igual de SDS-PAGE muestra de amortiguación (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y electrophoresed el 12% geles de poliacrilamida. Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y conejo anti-ratón Ig (A + M + G) (ICN, Irvine, CA) antibodiesand HRP-conjugado de cabra anti-Ig de conejo (Sigma Chemical Co, St Louis, MO) se utilizaron para detectar total Ig (M + G). HRP-conejo conjugado anti-ratón IgG (Sigma Chemical Co, St Louis, MO) se utilizó para detectar el tipo específico de anticuerpos IgG. Color de desarrollo se llevó a cabo utilizando Supersignal ® quimioluminiscente (Pierce, Rockford, IL).

Ensayos de citoquinas

Citoquinas proinflamatorias, IL-6 y TNF-α niveles en sangre y lavado peritoneal se determinaron por ELISA. ELISA se realizó por triplicado mediante medios específicos de mAbs (eBioscience, San Diego, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Control de la infección y la mortalidad

Estos estudios se realizaron en PBS tratados de control y experimental en ratones distintos grupos. Estos ratones fueron vacunados con muertos lisados bacterianos en la presencia o ausencia de los adyuvantes. Animal de mortalidad se evaluó cada 12 h durante los primeros 3 días siguientes desafíos bacteriana (10 6, 10 7 o 10 8 UFC / mouse) y el líquido peritoneal y sangre fueron cultivadas para confirmar la infección. La mortalidad se produjo principalmente entre 12 h y 36 h después del desafío. A las 18 h después de bacterias desafío, la sangre y lavages peritoneal se obtuvieron para el cultivo cuantitativo. Las muestras de todos los grupos de ratones fueron diluidas en medio LB (1:200), y un 10 μ l de muestra de cada una de ellas fue estrías en placas de agar utilizando bucles calibrado para detectar la bacteriemia causada por> 10 3 UFC / ml.

El análisis estadístico

Los análisis estadísticos de todos los datos fue realizada por el emparejado de la t de Student test (Sigma Plot). Para todas las pruebas estadísticas, alfa se fijó en 0,05. Todos los datos se expresaron como media ± SEM en las figuras y tablas.

Resultados
Anticuerpos específicos anti-bacterianas respuestas de anticuerpos

Los sueros de ratones inmunizados recogidas a lo largo del curso de tres vacunas fueron analizadas por ELISA para determinar la inducción y la duración de la respuesta de anticuerpos. Baja pero detectables en suero de anticuerpos específicos para E. coli se encuentra en niveles comparables a todos los ratones inmunizados con adyuvantes después de la segunda inmunización. Sin embargo, en comparación con los ratones inmunizados con E. coli sola (en PBS), los vacunados con IFA, phytol, y PHIS-01 registró significativamente los niveles altos de anticuerpos (n = 5, P <0,05) después de la 3 ª inmunización (fig. 1A ). Por el contrario, en el caso de S. aureus de ratones inmunizados, sólo phytol, pero no IFA o PHIS-01, generado mayor respuesta de anticuerpos séricos (n = 5, P <0,05) después de la 3 ª inmunización (Figura 1B].

La eficacia del tratamiento adyuvante en el mantenimiento de la respuesta de anticuerpos inducidos

La durabilidad de la respuesta de anticuerpos suscitó debido a la inclusión de los adyuvantes en las vacunas se determinó 30 y 60 días después de la tercera inmunización. Aunque todos los ratones que reciben las vacunas bacterianas más importantes adyuvantes evocado respuesta de anticuerpos, su durabilidad depende de la selección y la inclusión adecuada de adyuvantes. Los resultados en la Fig. 2A y 2B muestran que no hubo disminución en el nivel de anticuerpos de los ratones inmunizados con cualquiera de E. coli o S. aureus durante un período de casi tres meses. Cabe señalar que ambos PHIS-01 y phytol fueron tan eficaz como adyuvante estándar de la IFA en el caso de E. coli, pero para Gram-positivas S. aureus, sólo phytol fue más eficaz en el suministro sostenido anti-bacterianas respuesta de anticuerpos.

Isotipo perfil de la cepa específica de anticuerpos

Subclases de IgG no sólo tienen relativamente más largo de media vida, que también son importantes en vista de sus específicas funciones efectoras. Por lo tanto, se determinó anticuerpos isotipo suscitó en respuesta a las diferentes formulaciones de vacunas por ELISA utilizando comercial, calibrado clase de anticuerpos específicos anti-sueros. Considerando que, los sueros de ratones inmunizados con E. coli en IFA y phytol mostró altas concentraciones de IgG1, IgG2a y la IgG3 niveles fueron más altos sólo en PHIS-01-ratones tratados (Fig. 3A]. En particular, la proporción de IgG1 que IgG2a fue> 2,5 veces superior sólo en ratones inmunizados con PHIS-01 (Fig. 3B]. Por el contrario, IgM, el predominante fue el isotipo en ratones inmunizados con S. aureus y IFA o PHIS-01. Sin embargo, sólo phytol y PHIS-01 suscitó niveles elevados de IgG1 en respuesta a la vacunación con S. aureus (Fig. 3C].

Especificidad antigénica de los anticuerpos séricos

La figura 4 muestra Western blot de muestras de suero obtenidas a partir de ratones inmunizados con bomba de calor, las bacterias inactivadas (60 ° C durante 1 hora en un baño de agua) en diferentes adyuvantes. Antisueros, utilizado en la dilución 1:200 durante el ensayo, reconocidos en E. coli, algunos antígenos de tamaño molecular que van desde 40-100 KDa (Fig. 4A]. Los antisueros en respuesta a S. aureus reconoció las proteínas de 45, 74, 87, 90 y 95 KDa (fig. 4B]. Parece ser que los sueros anti-elaborado en respuesta a E. coli utilizando IFA y PHIS-01 fueron más fuertes que los obtenidos a partir de ratones inmunizados con phytol como adyuvante (Fig. 4A].

Bacteriana de limpieza de ratones inmunizados con diferentes adyuvantes

Los ratones fueron retados por vía intraperitoneal con tres dosis (10 6, 10 7, o 10 8 UFC) de E. viable coli y S. aureus. El crecimiento bacteriano se determinó en el peritoneal lavages cosechado 18 y 36 horas después del desafío con bacterias vivas. Se observó que cuando la dosis de desafío, ya sea E. coli o S. aureus fue 10 6 UFC, las bacterias no era detectable en el control de ratones vacunados o lo que sugiere que fueron eliminados por 36 horas a partir de la sangre y flujos de líquidos peritoneales (Tabla 1 y Tabla 2]. Sin embargo, si el PBS y IFA-dos grupos de tratamiento estaban infectados con 10 7 UFC de E. coli, un gran número de las bacterias fueron detectables en los peritoneal lavages incluso después de 36 horas después del desafío, y esto es importante, no ratón sobrevivió el desafío con 10 8 UFC de las bacterias (Tabla 1]. Un contraste es evidente en la PHIS-01 o phytol tratada con grupos de ratones desde ratones en ambos casos no tenía detectable E. coli después de 36 h (Tabla 1].

En el caso de S. aureus infección también, los desafíos con más alto que 10 6 UFC causado un número considerable de las bacterias a persistir en los fluidos peritoneal de los ratones tratados con PBS, IFA y PHIS-01. El unimmunized control y el sistema de cartilla vacunados tratados con grupos sucumbido a la infección y falleció dentro de las 36 horas después del desafío. El IFA y PHIS-01 grupos sobrevivió durante este período y, finalmente, la PHIS-01-ratones tratados sobrevivieron. La mayoría de señalar, sin embargo, es el efecto de Phytol, que no registró crecimiento bacteriano detectables 36 horas después del desafío y resistieron de manera más eficaz la infección (Tabla 2].

Influencia de los adyuvantes en la supervivencia de bacterias desafío

Para examinar si los adyuvantes difieren en la eficacia en términos de supervivencia animal, se inocularon ratones con 10 6, 10 7, o 10 8 UFC por ratón de E. coli o S. aureus. Como se muestra en la Figura 5 (A & B], los ratones inmunizados con 10 6 UFC de cualquiera de E. coli o S. aureus mostró pocos síntomas y todos los ratones sobrevivieron. Sin embargo, los ratones con mayor desafió inóculos como 10 7 o 10 8 UFC de una u otra bacteria se aletargada y sufrido de heces blandas. Si la muerte no se produjo dentro de las 24 hrs de bacterias desafío, el de los ratones sobrevivieron a la infección. Phytol y PHIS-01 fueron mucho más eficaz que PBS (es decir, las vacunas sin adyuvantes) y el IFA en conferir protección contra el E. coli. Es interesante señalar que la tasa de supervivencia global de ratones inmunizados con S. aureus fue algo más elevado que en los ratones inmunizados con E. coli. Los ratones vacunados con S. aureus y phytol mostró la mejor protección contra S. aureus desafío.

Efectos de los adyuvantes en las citoquinas inflamatorias (IL-6 y TNF-α)

Con el fin de determinar si los adyuvantes ejercer todos los efectos que sobre la inducción de citoquinas inflamatorias, como IL-6 y / o TNF-α, los niveles de esta citoquina se midieron en lavages peritoneal. Los resultados obtenidos en ratones retados con 10 6 UFC de E. coli, o S. aureus se muestra en la Fig. 6. Desde inóculos bacterianos de más de 10 6 UFC control de todos los muertos unimmunized ratones dentro de las 24 hrs, estos experimentos se realizaron con sólo 10 6 UFC de cada bacteria. No hubo aumento significativo en el TNF-α nivel en todos los grupos de ratones, mientras que la IL-6-nivel fue significativamente menor en phytol y PHIS-01-inoculados ratones tratados con E. coli (Fig. 6A]. Por el contrario, hubo mucho menos de cualquiera de citocinas inducidas durante la S. Desafío aureus (Fig. 6B].

Discusión

No ha habido, a nuestro conocimiento, no antes de la investigación sistemática la participación de la eficacia de la dieta isoprenoids, como phytol o phytol derivados de compuestos, como adyuvantes. En nuestro estudio en curso [12], hemos comprobado la actividad adyuvante de phytol, y su reducido derivados, PHIS-01, y observó eficaz estimulación de la respuesta de anticuerpos contra antígenos hapteno conjugado con una proteína portadora. Hemos observado que la respuesta debido a estos adyuvantes parecía superior a lo que se ha observado con adyuvantes convencionales, como CFA / IFA, TiterMax, y Alum. PHIS-01, en particular, también evoca de manera eficiente la inmunidad celular, incluyendo tumor específicas citotóxicas y células T helper respuestas [12]. En este informe, han evaluado la utilidad de los potenciales adyuvante de phytol y PHIS-01 para aumentar la eficacia de las vacunas contra agentes infecciosos comunes S. aureus y E. coli.

Nuestro formulaciones vacunales contienen bomba de calor, las bacterias inactivadas emulsionadas con la IFA, o cualquiera de las dos phytol experimental basada en los adyuvantes. Esta última, a diferencia de IFA, se han utilizado sin ningún tipo de emulsificante o agentes de superficie. A pesar de estas diferencias, estos nuevos adyuvantes son eficaces no sólo en el aumento de anti-bacterianas respuestas humorales en contra de ambos E. coli y S. aureus, pero también en la prevención de bacteriemias y la muerte causada por estas infecciones. Phytol y sus derivados parecen ser excelentes adyuvantes por su capacidad para mejorar y mantener la calidad de respuestas de anticuerpos (la prevención de bacteriemias) durante un período más largo de tiempo. Por lo tanto, phytol basada en nuevos adyuvantes mejorar significativamente la eficacia de la vacuna de la modulación de la inmunogenicidad y la toxicidad de la bomba de calor, muertos inóculos bacterianos, responsables de gram-negativas bacteriemia [16 - 18]. Sin embargo, phytol y PHIS-01 adyuvantes difieren en su eficacia frente a gram-positivos S. aureus. Phytol es mejor a aumentar las respuestas de anticuerpos específicos y la prevención de bacteriemias y la muerte debido a S. aureus.

Se ha sabido que IgG2a es la más deseable isotipo de anticuerpos terapéuticos para aplicaciones que impliquen la respuesta inmune normal [19]. Este isotipo es más eficaz en la activación de complemento, la promoción de anticuerpos citotoxicidad celular dependiente, y que confiera protección contra los tumores o invasión de parásitos que cualquier otro isotipo. En ratones inmunizados con E. coli, phytol y, en particular, PHIS-01 ejercen sus efectos en el aumento de los niveles séricos de ratón de todas las grandes subclases de IgG, IgG2a específicamente anticuerpos. En contraste, los ratones vacunados con S. aureus lisados emulsionar con phytol registrar niveles más elevados de IgG1 de tipo de anticuerpos, y están mejor protegidos, mientras que el IFA y PHIS-01 no ejercer mucho efecto en este isotipo cambiar. Ambos IFA y PHIS-01 de promover la inducción principalmente anti-IgM staph respuesta, que no está asociado con la memoria inmunológica. Esta inducción de anticuerpos IgG1 contra gram-positivos S. aureus observado con phytol implica de tipo Th2 respuestas celulares y el establecimiento de la memoria inmunológica.

Adyuvantes facilitar la persistencia de antígenos a los lugares de inyección, el llamado efecto de depósito. Las diferencias cualitativas en adyuvante eficacia también puede ser obtenida de los análisis de antígenos implicados en la respuesta inmune. La E. coli antígenos reconocidos por los sueros inmunes, debido a phytol y PHIS-01 son claramente discernibles en Western-Blots en comparación con el suero inmune obtenido de IFA-ratones inmunizados. A 45 KDa antígeno fue reconocida por los anticuerpos de los ratones inmunizados con phytol y PHIS-01. Del mismo modo, sólo los anticuerpos IgG de la phytol grupo reconoció cuatro únicas S. aureus antígenos (aproximadamente 45, 74, 90 y 95 kDa). Nuestros resultados sugieren que phytol y PHIS-01 difieren de los convencionales adyuvante IFA en cuanto a su capacidad para aumentar la inmunogenicidad de antígenos bacterianos. Esto puede explicar por qué phytol y sus derivados proporcionar una mejor protección contra la re-exposición a los agentes patógenos. La naturaleza bioquímica de estos antígenos aún no se ha dilucidado.

La eficacia de phytol y PHIS-01 como adyuvantes es también evidente en la calidad de la protección que proporcionan las vacunas contra la infección de aparición temprana. En los casos letales, un marcado descenso de los niveles de anticuerpos, invariablemente, aumenta la probabilidad de una elevada mortalidad en ratones [20]. Los ratones inmunizados con muertos E. coli y phytol o PHIS-01 mostró las bacteriemias transitorias y todos sobrevivieron. El estado de inmunidad se mantuvo incluso cuando los ratones fueron retados con 10 6 UFC de E. coli células. Estos importantes resultados sugieren que la memoria inmunológica contra el antígeno correspondiente (s) puede facilitar la rápida eliminación del agente infeccioso de la sangre arroyos y peritoneo. En contraste, los ratones inmunizados con PBS o bien IFA mueren dentro de 1-3 días.

En la base de la definición de mecanismos de las diferencias en adjuvanticity de phytol y PHIS-01 relativa a IFA podría potencialmente se encuentran en monocitos y macrófagos que producen citocinas pro-inflamatorias principalmente como TNF-α e IL-6. Estas citoquinas juegan un papel importante como mediadores de fatal shock séptico [22 - 25]. En nuestra investigación, poco TNF-α podría ser detectado en 18 Horas después de la infección bacteriana. Sin embargo, IL-6 es detectable en el lavado peritoneal y la sangre durante un breve período en ratones inmunizados con PBS y IFA, pero no phytol y PHIS-01. Se desprende de este estudio que el calor inactiva los microorganismos no son lo suficientemente inmunogénica para inducir una respuesta inmune efectiva, y que los adyuvantes en las vacunas formulaciones podrían hacer la diferencia. Nuestros resultados demuestran la utilidad de phytol y PHIS-01 como adyuvantes eficaces. Curiosamente, los ratones que sobreviven a las infecciones bacterianas producen menos TNF-α e IL-6 citoquinas, las importantes mediadores de shock séptico fatal.

De este modo, el desarrollo de muti-epitopic E. coli y S. aureus el uso de estas vacunas adyuvantes parece prometedor. La otra área de interés es el desarrollo de anti-bacterianas globulinas gamma para uso intravenoso toxemic la prevención de episodios. Ha sido previamente demostrada por Kaijser et al. que la administración pasiva de un Ab monoclonales específicos para E. coli, en relación con un antibiótico mejora significativamente la supervivencia de los animales con infección experimental [26]. Los pacientes de alto riesgo con una mala defensa de acogida, tales como los lactantes nacidos prematuramente y pacientes sometidos a quimioterapia inmunosupresora, puede incluso beneficiarse de infusión pasiva de la respuesta inmune inducida en personas competentes. Dado que la mayoría de mortales infección nosocomial es causada por E. coli y S. aureus, será de interés para desarrollar IgG enriquecida con las vacunas para la profilaxis y el tratamiento de la sepsis nosocomial.

Agradecimientos

Los autores se agradecen a Profesor HK Dannelly, del Departamento de Ciencias de la vida, y Tista Ghosh, MD, MPH, Tri-County Health Dept, Denver por sus valiosas sugerencias y lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de la Universidad del Estado de Indiana Comité de Investigación (UNR215) y la Indiana Academy of Science (SAC131 a SG) y la financiación de Estudiantes Graduados de la Universidad Estatal de Indiana (SY L.).