Journal of Immune Based Therapies and Vaccines, 2006; 4: 6-6 (más artículos en esta revista)

Phytol basada en nuevos adyuvantes en la formulación de la vacuna: 1. evaluación de la seguridad y la eficacia de la estimulación durante humoral y celular mediada por la respuesta inmune

BioMed Central
Por lo tanto, Lim-Yon (slim@bidmc.harvard.edu) [1], Matt Meyer (matmeyer@iupui.edu) [1], Richard A Kjonaas (rkjonaas@isugw.indstate.edu) [4], Swapan K Ghosh ( sghosh@isugw.indstate.edu) [2]
[1] Departamento de Ciencias de la Vida, Indiana State University, Terre Haute, EN 47809, EE.UU.
[2] División de Patogenia Viral del Departamento de Medicina, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 330 Brookline Avenue, Boston, MA 02115, EE.UU.
[3] Indiana Facultad de Medicina, Terre Haute, EN 47809, EE.UU.
[4] Departamento de Química, Indiana State University, Terre Haute, EN 47809, EE.UU.

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.

Resumen
Fondo

La eficacia de la vacuna depende en gran medida sobre el uso adecuado de los adyuvantes (s) en la formulación. Phytol, una dieta diterpene alcohol, es una estructura similar a la de origen natural isoprenoid adyuvantes, pero poco se sabe de su adjuvanticity. En este informe se describe la relativa seguridad y eficacia de phytol y sus derivados hidrogenados PHIS-01 en comparación con el comercial de los adyuvantes.

Métodos

Hemos probado adyuvante propiedades utilizando una fórmula que consiste en ya sea un hapteno, ftalato-conjugado con una proteína, ojo de cerradura limpet Hemocianina (KLH), o la ovoalbúmina (OVA) emulsionar con la prueba de adyuvantes en ratones sin ningún tipo de surfactante. Inmunidad humoral se evaluó en términos de títulos, especificidad, y isotypic perfiles. El efecto sobre la inmunidad celular se estudió analizaron la inducción de una u otra OVA-o B-linfoma citotóxicos específicos de linfocitos T (CTL).

Resultados y Discusión

El phytol compuestos, en particular PHIS-01, obtener un aumento de los títulos de todas las grandes subclases de IgG, especialmente IgG2a. A diferencia de adyuvantes comerciales, tanto phytol compuestos son capaces de inducir específicas citotóxicas efectoras respuestas de células T específicas para ambos óvulos y linfoma B de la prueba. Phytols como adyuvantes son también distintivo en el sentido de que no provocan adversos anti-ADN respuesta autoinmune. Administrados por vía intraperitoneal phytol es comparable a completar Freund adyuvante a la toxicidad en dosis de más de 40 ug / ratón, pero PHIS-01 no tiene este tipo de toxicidad.

Conclusión

Estos resultados nuestros y los estudios en curso sobre la inmunidad antibacteriana muestran que phytol y PHIS-01 son nuevos y eficaces adyuvantes con poca toxicidad.

Fondo

El diseño de vacunas eficaces no sólo depende de la naturaleza de los antígenos (Ag), sino también sobre la inclusión de adyuvantes apropiado para el óptimo inducción de inmunidad protectora. La inmunogenicidad de una proteína está inherentemente vinculada a sus propiedades físico-químicas, pero los adyuvantes pueden afectar significativamente la amplitud de la respuesta. Tradicionalmente, las vacunas han consistido en atenuados o muertos por microorganismos, o los componentes aislados. En los últimos años, las formulaciones de vacunas específicas han incluido y seguro proteínas recombinantes, péptidos sintéticos, e incluso vectored ADN [1, 2]. En general, estas vacunas no son tan efectivos como los que se basan en su conjunto los organismos, pero la eficacia es a menudo mayor cuando se utiliza en conjunción con organizaciones no-específica immunoadjuvants [3 - 5].

Adyuvante actividad ha sido demostrado en numerosos productos naturales a través de serendipia y por ensayo y error [6, 7]. Sin embargo, en la selección de los adyuvantes, sus propiedades inmunológicas son tan importantes como su beneficio a la toxicidad ratio. Adyuvantes son a menudo extrañas al organismo y, por tanto, capaz de producir reacciones adversas. Estos efectos adversos pueden ser una consecuencia directa de tóxicos o no metabolizable componentes en su formulación o puede ser el resultado de la inclusión de agentes que overstimulate inmune inflamatoria o sistemas [8]. Por ejemplo, CLS, que se utiliza ampliamente en estudios experimentales, produce excelentes humoral y celular mediada por la inmunidad, pero no es apto para ser humano y veterinario, ya efectos de toxicidad. Por lo tanto, es necesario para la identificación de los adyuvantes que sean seguras y eficaces.

La búsqueda de adyuvantes pueden ser útiles a menudo ha conducido a la utilización de isoprenoid compuestos extraídos de fuentes vegetales [9 - 12]. Debido a que algunos de estos compuestos pueden ser tóxicos, hemos considerado el desarrollo de adyuvantes isoprenoid de sustancias que son comunes en la dieta humana. Los estudios epidemiológicos sugieren que las verduras en las dietas mejorar la resistencia a la infección y, por tanto, mejorar la inmunidad [13 - 15]. También pueden ayudar a prevenir algunos tipos de cáncer de aumentar las respuestas inmunológicas contra los tumores que salen en las primeras etapas de la carcinogénesis [16 - 18]. Clorofilas en verduras constituyen una importante fuente de un componente isoprenoid, phytol (3, 7, 11, 15-tetrametilo-2-hexadecen-1-ol, C 20 H 40 O), alcoholes alifáticos ramificados, también presente en la grasa ácido cadena lateral en tocoferoles. Porque phytols son hidrofóbicas, que son capaces de interactuar con la membrana celular. Una serie de estudios recientes han descrito varios celulares y efectos biológicos de phytol (19-21). Sin embargo, todavía no existe un informe definitivo sobre la adjuvanticity de phytol o cualquier derivados sintéticos como hidrogenados phytol o phytanol, llamado PHIS-01 (pendiente de patente) que se ha estudiado en nuestro laboratorio.

En el presente informe, se compararon los adyuvante potencial de ambos phytol y PHIS-01 a que algunos de los adyuvantes utilizados comúnmente (completa e incompleta Freund's adyuvantes, TiterMax, Ribi, del sistema adyuvante, y Alhydrogel). Desde phytol y PHIS-01 son estructuralmente similares a los aceites minerales constituyentes en IFA y CFA, se incluyeron para la comparación pristane como el aceite mineral protype en este estudio. La mayoría de estos común adyuvantes no son igualmente capaces de mejorar tanto humoral y / o respuestas celulares contra un inmunógeno. Por otra parte, su inclusión en formulaciones vacunales pueden generar efectos secundarios adversos, incluyendo la inducción de anti-ADN respuestas de anticuerpos, el sello de lupus-, como trastornos autoinmunes [22, 23]. Estamos aquí demostrar que phytol, y en mayor medida phytol derivados PHIS-01, adjuvanticity excelente exposición a bajas dosis no tóxico y mejorar un anti-hapteno respuesta humoral que consta de grandes subclases de IgG, especialmente IgG2a. Ellos son igualmente capaces de provocar anti-tumor de células T citotóxicas respuesta. Además, a diferencia de adyuvantes convencionales, phytol derivados PHIS-01 muestra poca toxicidad o nephritogenic patología resultante de la inducción de una reacción cruzada anti-ADN respuesta de anticuerpos. En nuestro estudio, también hemos observado que la phytol y PHIS-01 son superiores adyuvantes para obtener anti-bacterianas la respuesta inmune [24].

Métodos
Estudios inmunológicos

Se estudiaron los efectos de comerciales y experimentales en diferentes adyuvantes inmune parámetros tales como el antígeno específico de respuestas humorales, isotipos de anticuerpos, mediada por células contra la inmunidad tumoral, autoinmune y reactividad en BALB / c, C57Bl / 6, autoinmunes y propensos a ratones NZB . Género con ajuste, 8-12 semanas de edad BALB / c y C57Bl / 6 animales fueron criados en las instalaciones de animales de la Universidad Estatal de Indiana. Para determinar los parámetros autoinmune, de seis semanas de edad NZB / W F1 y mujeres ratones NZB (Harlan Sprague Dawley, Indianápolis, IN) fueron utilizados. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo a las directrices de cuidado de los animales de laboratorio (NIH publicación 85-23), utilizando protocolos específicos aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión (ACUC) de la Universidad Estatal de Indiana.

El comercial adyuvantes utilizados en este estudio consistió en CLS, IFA, Titermax, y RAS (Sigma Chemical Co, St Louis, IL); phytol (Pfaltz y Bauer Inc, Waterbury, CT), y Alhydrogel (exactas Químicas y Ciencia Corp, Westbury, NY). Pristane (Sigma, St Louis, IL) fue también utilizado para la evaluación comparativa de plasmacytomagenic potencial. Nuestro experimental adyuvante consistió en phytol y un phytol derivados, PHIS-01 (pendiente de patente). Este último se obtuvo por la reducción química de phytol en phytanol publicado a raíz de un procedimiento [25].

Anti-tumor de la eficacia de la vacuna

Un linfoma no Hodgkin B 2C3 se utilizó en este estudio. Hemos utilizado ampliamente este modelo tumoral en estudios anteriores [26 - 28]. Este tumor, que segrega anti-ftalato 2C3-Ig, se generó a partir de la fusión de los ftalatos-KLH-priming BALB / c con un esplenocitos no secretor mieloma, X63-Ag8.653. Otros dos anti-ftalato hibridomas, designado como 1H5 y 3B4, que muestran una alta especificidad para los ftalatos y el ADN, también se han descrito anteriormente [27].

También estudiamos otro modelo de tumor, entre otras cosas negativas-EL4 thymoma (H-2 b) y EL4 células transfectadas con ovoalbúmina (OVA)-cDNA de genes (E.G7-OVA) obtenidos a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) . El uso de este modelo tumoral, evaluamos OVA-antígeno-específica CTL en C57BL / 6 ratones.

Adyuvantes en la respuesta humoral

Efecto adyuvante en la respuesta de anticuerpos se estudió en BALB / c (cinco o más en un grupo) que fueron inyectados por vía intraperitoneal (IP) con los ftalatos-KLH conjugados (en BALB / c) emulsionar en experimental o adyuvantes convencionales en un volumen total de 400 μ l (100 μ g de cada antígeno). Control de grupos de ratones fueron inmunizados con PBS. Tras la vacunación también figura adyuvantes y se les dio a 10 días. Los ratones fueron sangrados a través de retro-orbital venas cinco días después de cada inmunización.

Para la evaluación del antígeno específico de la actividad citotóxica efector, hemos utilizado la ovoalbúmina (OVA en 5 o más C57Bl / 6 ratones) también emulsionar con adyuvantes como se indica más arriba. También se evaluó la eficacia de los adyuvantes en la generación de tumores específicos de respuesta citolítica contra el modelo 2C3 tumor en ratones BALB / c. Este último grupo fue vacunado repetidamente con muertos 2C3 las células tumorales antes de bazo fueron disecados a cabo para el aislamiento y la evaluación citotóxica de las células efectoras.

Enzima de ensayos de inmunoabsorción ligado (ELISA)

ELISA indirecta se realizó para evaluar y correlacionar los diferentes respuestas humorales [26]. Anticuerpos en suero se realizarán las pruebas de sus especificidades a ftalato de polivinilo a 96-y placas de fondo plano (Falcon) recubierto con cualquiera de los ftalatos (como un conjugado de BSA) o ternero timo de ADN. Después de las placas fueron bloqueadas con 1% BSA / PBS SOBRE a 4 ° C, distintas diluciones de los sueros (10-10000) se añadieron a cada pocillo, y las placas fueron incubadas durante 1 hora a 37 ° C. Los pozos fueron lavados con buffer fosfato salino-que contienen 0,05% tritón X, y el conejo anti-ratón Ig-HRP (50 μ l) (a 1:3000 dilución) fue añadido. Las placas fueron incubadas durante 1 hr y se lavan de nuevo. Encuadernación conejo anti-ratón Ig-HRP se detectó mediante la adición de o-fenileno diamina (OPD) y peróxido de hidrógeno. La reacción fue detenido con 50 uL del 10% de H 2 SO 4, y la intensidad del color se dio lectura a 490 nm.

Generación de células efectoras citolítica

C57BL / 6 ratones recibieron tres inyecciones con OVA emulsionar en los ensayos adyuvantes. Spleen células se obtuvieron a partir de C57Bl / 6 ratones en el día 7 después de la 3 ª inmunización y preparado para 51 Cr citotoxicidad de liberación de ensayo [28]. Por el linfoma, ratones BALB / c fueron inoculados con cada adyuvante 5 días antes de la administración de vivir 2C3 tumor (5 × 10 6 células / ratón). Esplenocitos fueron cosechadas en el día 8 y estimulado con las células muertas 2C3 antes de 51 Cr citotoxicidad de liberación de ensayo.

Esplenocitos Se sembró en 6 pozos de cultivo de tejidos en placas de 6 × 10 6 células / así en 2 ml RPMI/10% de SFB, y luego estimulado in vitro con muertos E.G7-Los óvulos o células 2C3 células (1,2 × 10 6 células / así) durante 5 días en presencia de un 10% de CO 2 a 37 ° C para generar células citotóxicas efectoras.

La citotoxicidad de ensayo

Como anteriormente se ha descrito, el objetivo células fueron etiquetados a 37 ° C con 150 μ Ci de sodio de 51 Cr 1 hora, lavar tres veces en PBS, y luego resuspendido en RPMI/10% de SFB [28]. El objetivo marcado células fueron dispensados a las 5 × 10 3 células / pocillo en placas de 96 pocillos. Efector esplenocitos se añadieron a distintas E: T con ratios adecuadas las células diana sembró en placas de 96 pocillos. El volumen total de la reacción fue de 200 μ l /. Las placas fueron incubadas a 37 ° C durante 6 h, después de lo cual fueron centrifugadas, y 30 μ l de sobrenadante retirado de cada bien se añadió al 96-luces y placas para evaluar 51 Cr liberación en un Top Conde-NXT lector de placas (Packard Instrumentos, Meriden, CT, EE.UU.). El porcentaje de lisis específica se determinó mediante la fórmula: lisis específicos por ciento = (muestra liberación - la liberación espontánea y máxima de liberación - la liberación espontánea) × 100. Liberación espontánea no superó nunca el 18% de la máxima libertad. Citolítica Todos los análisis descritos en este estudio se realizaron por triplicado y repetirá al menos tres veces en distintos experimentos. En concreto, la medición de la OVA-citotóxica específica de células efectoras actividad se realizó a través E.G7 de óvulos y células EL4 como objetivos en C57Bl / 6 ratones, este último actúa como control negativo contra la OVA específicos de efectores. Por 2C3-linfoma específicos de citotoxicidad estudios, 2C3 y un Mastocitoma P815 fueron utilizados como blancos. P815 células sirvió de control negativo.

El análisis estadístico

El emparejado de la t de Student test (Sigma Plot software) se utilizó para determinar la significación estadística. Los niveles de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativas. Los datos son expresados como media ± SEM

Resultados
Generación de la lucha contra el ftalato de respuesta de anticuerpos en ratones BALB / c

Grupos de 5 ratones fueron inyectados con 100 μ g de ftalato-KLH admixed con un adyuvante, tal como se describe anteriormente [27 - 29]. La venta en el comercio adyuvantes CFA, IFA, alhydrogel, pristane, TiterMax Oro, y Ribi adyuvante System (RAS) se utilizaron en la preparación del inmunógeno de acuerdo con los fabricantes protocolos. Por phytol y PHIS-01, aprobó el protocolo recomendado para IFA / CFA. Con el fin de comparar adjuvanticity, los ratones recibieron idénticas dosis de antígeno en cada experimento. La eficacia de cada uno de los adyuvantes se evaluó midiendo los niveles séricos de anticuerpos 5 días después de cada inmunización. Los resultados muestran que en diverso grado, todos los adyuvantes a prueba aumentada tanto de 1 ° y 2 ° respuestas de anticuerpos a los ftalatos conjugado (fig. 1A y 1B]. Hubo pocos cambios en la magnitud de las respuestas de anticuerpos en todos los grupos de ratones inmunizados durante el seguimiento durante un período de 2 meses (datos no presentados). Curiosamente, el 2 ° contra el ftalato de respuesta de anticuerpos se ha visto impulsada con la mayor eficacia de PHIS-01 y phytol como adyuvantes de CFA / IFA combinación o RAS. Por el contrario, TiterMax y Alum fueron ineficaces (fig. 1B].

Efectos de PHIS-01 y otros adyuvantes en la inducción de subclases de IgG

La eficacia de una vacuna formulación depende en gran medida el tipo de anticuerpos inducidos por subclases, y los adyuvantes se sabe que desempeñan funciones importantes en la eficacia de la vacuna. En este estudio, se determinó por isotyping los efectos de diferentes adyuvantes en la inducción de diferentes subclases de IgG. Se presentaron diferencias significativas en efecto, observado con el uso de diferentes adyuvantes (Fig. 2]. Es evidente que todos los adyuvantes a prueba a favor de la subclase IgG1, sin embargo, sólo PHIS-01 fue también eficaz en la inducción de niveles significativos de IgG2a e IgG3 anti-ftalato anticuerpos sugieren un cambio hacia el tipo Th1 respuesta inmune. Evidentemente, la proporción de IgG1 que IgG2a Abs fue <1 sólo en ratones inmunizados con ftalato emulsionar con PHIS-01.

Inducción de la lucha contra el tumor de las células T efectoras

Desde la inducción citolítica de las células efectoras es fundamental para garantizar el éxito de vacunas contra el tumor, se determinó la eficacia relativa de phytols adyuvantes y conocido en su capacidad para aumentar antígeno-específica CTL actividad en C57BL / 6 y BALB / c ratones utilizando dos modelos diferentes de tumores, E.G7-OVA y 2C3, respectivamente. Esplenocitos de C57Bl / 6 ratones inmunizados con OVA emulsionar en diferentes adyuvantes fueron estimuladas in vitro con muertos E.G7-OVA células tumorales y posteriormente evaluadas para la actividad citolítica contra E.G7 de óvulos y células untransfected EL4. Los resultados en la Fig. 3A muestran claramente que phytols, a diferencia de Alum, en la formulación de la vacuna podría obtener tumor específico mediada por células efectoras actividad, aunque en menor grado que la CFA / IFA. Este efector de la población se antígeno-específicos, como untransfected EL4 células no se zadas (datos no presentados).

Hemos informado anteriormente de inducción idiotype citotóxicos específicos de los linfocitos T (CTL) en ratones BALB / c después de la vacunación profiláctica con muertos 2C3 tumores o durante las primeras etapas de 2C3 crecimiento tumoral in vivo [30]. El uso de este modelo, hemos investigado si este tipo de tumor específico CTL respuesta se ve aumentada por la inyección de los adyuvantes y vivir 2C3 células. Como se muestra en la Fig 3B, esplenocitos de ratones inyectados con phytol y, en particular, PHIS-01 presentó respuesta CTL 2C3 tumor contra las células diana. Estos esplenocitos no tiene actividad citotóxica contra el antígeno de control negativo tumores P815 (datos no presentados). En contraste, los adyuvantes comerciales CFA / Alum IFA o eran ineficaces contra el B-2C3 linfoma (Fig. 3B].

Evaluación de la toxicidad y la seguridad de los adyuvantes phytol

Adyuvantes, en general, mejorar las interacciones entre innata y la inmunidad adquirida mediante la movilización y activación de la primera, posiblemente mediante la promoción de las señales de peligro [31, 32]. Con el fin de evaluar la toxicidad relativa o inflamatoria efectos de la phytol y PHIS-01, administrado en diversas concentraciones (40-100 μ g) intraperitoneal a través de rutas a ratones que pesen alrededor de 20 g. Los ratones se pesaron antes del tratamiento y posteriormente a intervalos regulares a lo largo de un período de una semana, y luego sacrifica a examinar los órganos principales, tales como el hígado y el bazo. Como se muestra en la Tabla 1, las DL 50 de PHIS-01 era mucho mayor que 8 mg / kg de peso corporal en ratones, mientras que todos los ratones inyectados con la misma dosis de phytol estaban muertos dentro de 4 días. La diferencia entre la ganancia de peso corporal / pérdida en el ensayo y el control de los animales era inferior al 10% entre los grupos de ratones inyectados con <40 μ g de phytol o PHIS-01. Por otra parte, phytol inducida por esplenomegalia comparable a la observada en los ratones tratados con CFA (Fig. 4A y 4B], pero no había señal de esplenomegalia con 40-80 μ g de PHIS-01 (Fig. 4B]. Promedio bazo pesos y el número de células para cada grupo de ratones se informó en el cuadro 2.

La inducción de lupus de autoanticuerpos de los adyuvantes

A pesar de adyuvantes como CFA / IFA, o incluso pristane, efectivamente aumentar la inmunogenicidad de potenciales vacunas contra el débil, sino que también inducir lupus autoanticuerpos de tipo normal en la mayoría de las cepas de ratones [22, 23]. No se sabe si esta capacidad para inducir el lupus es único para el aceite mineral adyuvantes. Para determinar si los productos phytol también inducir lupus tipo de autoanticuerpos, hemos probado los sueros de ftalato-inmunizados BALB / c, NZB, y propensos a sufrir lupus NZB / W F1 para ratones de reacción cruzada anti-ADN respuestas. Nos ha informado anteriormente esas respuestas utilizando adyuvantes como CFA y IFA [27 - 29]. Como se muestra en la Fig. 5, ratones BALB / c inmunizados con ftalatos en pristane inducida por altos niveles de anti-ADN autoanticuerpos después de la 3 ª inmunización. Autoanticuerpos similares también se produjeron, aunque a niveles inferiores, de ratones inmunizados con CFA / IFA y RAS. Sin embargo, ambos phytol y PHIS-01 no tuvo efectos significativos en la producción de anti-ADN Abs.

No hay signos de glomerulonefritis en phytol tratada con ratones

Una evaluación más profunda de la seguridad y la toxicidad fue evaluada por histopatología de los riñones de ratones tratados con phytol, PHIS-01 y IFA / CFA. Nitrógeno ureico en sangre (BUN) y proteinuria de autoinmune propensos NZB / W F1 ratones inmunizados con ftalato-KLH en phytols o IFA / CFA fueron probados mediante el uso de Azostix (Bayer, Elkart, IN) y Multistix (Bayer, Elkart, IN) respectivamente. Tal como se ha descrito anteriormente [27], los ratones inmunizados con ftalatos en IFA / CFA revelan casi 3 a 4 veces mayor BUN y nivel de proteína urinaria grave nefritis que indica que los ratones de control, sin embargo, ninguna de estas patología renal se observó utilizando phytol o PHIS - 01 como adyuvantes (datos no presentados).

Ascitis producción en ratones BALB / c utilizando pristane y phytols

Aceites minerales, pristane en particular, se ha demostrado que promover la formación de ascitis y la inducción de plasmocitoma en ratones BALB / c [33 - 36]. Para comprobar si phytol y PHIS-01 ejercen efectos similares, ratones BALB / c por vía intraperitoneal fueron cebados con pristane, phytol, o PHIS-01. En contraste con pristane, phytol y PHIS-01 no expuestos plasmacytomagenic propiedades en estudios preliminares. No obstante, tal y como se muestra en la Tabla 3, phytol resultó ser comparable a pristane como una cartilla para la propagación de las líneas de hibridoma in vivo.

Discusión

La importancia de los seguros y eficaces coadyuvantes en la investigación de vacunas no puede ser pasada por alto, y hay una necesidad cada vez mayor, no sólo para las nuevas vacunas, sino para los nuevos adyuvantes como así. La mayoría de las vacunas recientemente desarrolladas se basan en antígenos seleccionados objetivo que consiste en moléculas individuales o fragmentos derivados de microorganismos infecciosos, o las células tumorales. Ellos son administrados en forma de purificado proteínas, péptidos sintéticos, o vectored ADN. Estas vacunas son generalmente poco inmunogénica y costoso y / o difíciles de producir. Por otra parte, muchos ampliamente utilizado vacunas pueden perder su eficacia debido al uso repetido y para otras razones biológicas. Adyuvantes puede anular dicha insuficiencia inmunológica y ayudar a montar eficaz la respuesta inmune. Aunque en el pasado la mayoría de las vacunas han sido diseñadas para estimular respuestas de anticuerpos, vacunas actualmente en desarrollo son cada vez más destinadas a obtener la respuesta inmune celular la participación de las células Th1, y CTLs. Estas respuestas son necesarias para controlar las enfermedades infecciosas crónicas asociadas a virus y agentes patógenos intracelulares, y también para el desarrollo de vacunas terapéuticas contra el cáncer.

En este estudio, se determinó la adjuvanticities de clorofila-phytol derivados y sus derivados químicamente reducido, PHIS-01, en relación con los de uso común comercial de los adyuvantes. En el primer estudio, los ratones fueron vacunados con un hapteno, ftalatos, conjugado con KLH en uno de los varios adyuvantes: phytol, PHIS-01, CLS, IFA, pristane, TiterMax, Ribi sistema adyuvante, y Alhydrogel o alumbre. La eficacia se mide en términos de cantidad, especificidad, duración y isotipo de Abs generado. En otro experimento, phytol, PHIS-01, CFA, y la IFA se utilizaron para estudiar la inducción de la inmunidad celular, especialmente de tumores específicos CTL respuesta a cualquiera de OVA-EL4 thymoma transfectadas 2C3 o linfoma en C57Bl / 6 y ratones BALB / c, respectivamente, . Además, este estudio también se abordó la cuestión de la seguridad en relación con la eficacia de phytol basada en los adyuvantes. La evaluación de la seguridad se ha llevado a cabo desde la perspectiva de toxicidad, y la capacidad de inducir reacciones adversas autoinmunes y plasmocitoma formación.

En este informe, ftalato de proteínas conjugadas fue seleccionado como el inmunógeno a causa de nuestra anterior conclusión de que la lucha contra el ftalato de respuesta de anticuerpos inducidos con el IFA como adyuvante provoca reacción cruzada anti-ADN generar anticuerpos lupus-like síndromes con patología renal [27 -- 29]. También informó de que este adversos de reactividad cruzada se ve exacerbada por muchos adyuvantes comúnmente utilizados. Evaluación de la lucha contra el ftalato y de reacción cruzada anti-ADN respuestas de anticuerpos en presencia de diferentes adyuvantes es, pues, un nuevo enfoque para evaluar la seguridad y la eficacia de los adyuvantes. En esta investigación, se observó que phytol y PHIS-01 efectivamente mejorar la inmunogenicidad de ftalato-sin inducir conjugada anti-ADN anticuerpos. El mecanismo subyacente a la supresión de esta reacción autoinmune debido a los ftalatos está claro.

Otra prueba de la eficacia de phytol, y especialmente PHIS-01, como coadyuvantes, que pueden ser extraídas de la calidad y los niveles de IgG suscitó respuestas. PHIS-01-ratones tratados exhibió excelente anti-ftalato IgG2a respuesta. Este isotipo es más conveniente en aplicaciones terapéuticas, debido a su capacidad para activar complemento cascadas, y Ab-citotoxicidad celular dependiente de lo que a su vez garantiza una mejor protección contra el tumor o parásitos. Por otra parte, la inducción de IgG2a es una medida indirecta de las contribuciones relativas de Th1 y Th2 células. Queda por determinar si este cambio isotipo refleja los cambios en el entorno de citoquinas derivadas de la phytol basada en los adyuvantes.

En muchos casos, antígeno específico de combinaciones adyuvante se ha demostrado que promover el antígeno específico de la producción de citoquinas tipo Th1 (IFN-γ, IL-2) y citotóxica de células T respuestas [36 - 38]. Sin embargo, todavía no existe una combinación específica que garantice la actividad sostenida en términos de magnitud y duración de células mediada por la respuesta inmune. Nuestros estudios revelan que los ratones pre-tratados con phytol, y especialmente PHIS-01, montar una efectiva respuesta CTL reconociendo linfoma asociado Ig-idiotype. Ni CFA / IFA ni alhydorgel parecen inducir una respuesta similar. Sin embargo, cuando C57Bl / 5 son los ratones inmunizados con OVA y soluble phytol o PHIS-01, efector actividad citotóxica de las células del bazo su exposición significativa mejora, aunque no tanto como CFA / IFA.

En conclusión, phytol y PHIS adyuvantes-01 parecen ser más versátil como inmunoestimulantes sobre la base de su capacidad para favorecer una humoral y celular mediada por la respuesta inmune. Esto es más evidente en otro estudio en el que evaluaron su adjuvanticity a generar respuestas eficaces antibacterianos [24]. En términos de toxicidad, PHIS-01 induce a poco, en su caso, esplenomegalia, lo que implica no significativa en favor de los efectos inflamatorios, y por lo tanto, es más útil que phytol. Además, sólo pequeñas cantidades de phytol y PHIS-01 son necesarios para estimular la respuesta inmune. Ninguno de estos dos compuestos reaginic estimula la respuesta inmune, ni induce autoinmunes como el lupus-síndromes. Lo que es más importante, phytol y PHIS-01 hibridoma apoyo de propagación in vivo, sin inducir la formación de tejido granulomatoso en las superficies peritoneales, que es un problema con pristane. Además, a diferencia de pristane, estos nuevos adyuvantes no tienen ningún efecto sobre el desarrollo en plasmocitoma BALB / c. En futuros estudios, plan para determinar si las diferencias en la eficacia se deben a un entorno de citocinas generadas por estos compuestos

Agradecimientos

Los autores se agradecen a los profesores William Brett y Jim Hughes del Departamento de Ciencias de la vida y Tista Ghosh, MD, MPH, Tri-County Health Dept, Denver por sus valiosas sugerencias y lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de Investigación de la Universidad (UNR215) e Indiana Academia de la ciencia (SAC131) (SG) y la financiación de Estudiantes Graduados de la Universidad Estatal de Indiana (SY L.).