Acta Veterinaria Scandinavica, 2006; 47(1): 70-70 (más artículos en esta revista)

Ocurrencia de hemolítica Mannheimia spp. en ovinos aparentemente sanos en Noruega

BioMed Central
Louise L Poulsen (louiseladefoged@gmail.com) [1], M Turið Reinert (turidr@dsr.kvl.dk) [1], Rikke L Sand (rikkelinding@hotmail.dk) [1], Magne Bisgaard (MBI @ kvl . dk) [1], Henrik Christensen (hech@kvl.dk) [1], John E Olsen (jeo@kvl.dk) [1], Snorre Stuen (snorre.stuen @ veths.no) [2], Anders M Bojesen (miki@kvl.dk) [1]
[1] Departamento de Veterinaria Pathobiology, The Royal Veterinary and Agricultural University, 4 Stigbøljen, DK-1870 Frederiksberg C, Copenhague, Dinamarca
[2] Escuela Noruega de Ciencias Veterinarias, Departamento de Producción Animal Clinical Sciences, Sandnes, Noruega

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Resumen
Fondo

La aparición de especies Mannheimia en ovejas sanas sólo se ha investigado de forma muy limitada, ya ampliar el género y el nombre de sus cinco especies fueron creadas. El objetivo del presente estudio fue evaluar la aparición de especies hemolítica Mannheimia aparentemente sanos en ovejas procedentes de cuatro rebaños de ovinos en el sur-oeste de Noruega.

Métodos

Típico β-hemolítico Pasteurellaceae se aislaron de hisopos nasales y, posteriormente, sometido a examen bacteriológico. Un total de 57 Mannheimia aislamientos fueron obtenidos en cultivo puro. Todos los aislamientos fueron genotipo mediante amplificación de polimorfismos de longitud de los fragmentos (AFLP) el análisis y la comparación con los seis cepas de referencia. El 16S rRNA secuencias de genes de dos cepas se determinó también.

Resultados

β-hemolítico Mannheimia especies fueron aisladas de 24% a 64% de las ovejas en los cuatro rebaños. Un total de 26 hemolítica M. ruminalis-al igual que las cepas fueron aisladas entre los cuales, una considerable diversidad genética se encontró. Dieciocho M. glucosida aislamientos fueron obtenidos a partir de tres manadas, mientras que M. haemolytica fue sólo aislado de dos manadas de aves, 16 de ellos de sólo uno de los rebaños.

Conclusión

Demostramos que un número relativamente elevado de ovinos aparentemente sanos en Noruega parecen llevar la potencialmente patógenos M. haemolytica y M. glucosida en el tracto respiratorio superior. Un número inesperadamente alto de hemolítica M. ruminalis organismos similares fueron también obtenidos en los cuatro rebaños. El generalmente no hemolítica M. ruminalis suelen ser aisladas de rumiantes sanos. La importancia de β-hemolítico M. ruminalis organismos similares no se conoce y debe ser investigado en un estudio futuro.

Fondo

Mannheimia se propuso para la trehalosa-negativos [Pasteurella] haemolytica complejo que incluye al menos siete especies, cinco de los cuales fueron nombrados [1]. [P.] haemolytica fue reclasificado como M. haemolytica incluida la ex [p.] haemolytica biogroup 1 y serovares 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14 y 16, mientras que M. glucosida se propuso que se incluyera [p.] haemolytica serovar 11, biogroups 3A-H y la β-glucosidasa y meso-inositol positivo cepas de biogroup 9. M. varigena incluye la antigua [p.] haemolytica biogroup 6 y Bisgaard taxón 15 y taxón 36. El primero [p.] granulomatis y Bisgaard taxón 20 y [p.] haemolytica biogroup 3J se combinaron en M. granulomatis. Por último, M. ruminalis se propuso que se incluyera el ex Bisgaard taxón 18 y [p.] haemolytica biogroup 8D [1]. Una novela Mannheimia especies Posteriormente se informó de ganado de engorda de Australia [2]. La especificidad de serotipado como una herramienta de diagnóstico que posteriormente fue investigado por Angen et al. [3, 4] que demostró que el serotipado no representa un método fiable para la identificación. Los mismos autores hicieron hincapié en que se extendió fenotípica y genética de caracterización es necesario para la correcta identificación de estos organismos lo que hace difícil decidir cuál de los taxones presentes se tratan en estudios anteriores, basados únicamente a fenotipificación y el serotipado [5 - 11].

La mayoría de las especies de Mannheimia se conocen como patógenos oportunistas [12] y con frecuencia son aisladas de portadores asintomáticos [6, 9, 13]. En ovinos, la enfermedad causada por Mannheimia especies ha recurrido principalmente a la neumonía y la septicemia [13], aunque aislados se ha informado de casos de mastitis y el miocardio y el cerebro de los animales sanos [3].

Debido a los mencionados cambios en la taxonomía y las repercusiones que pudiera tener en el entendimiento de la etiología, patogenia y la epidemiología de estos organismos, la presente investigación tiene como objetivo determinar la ocurrencia de especies Mannheimia hemolítica en los rebaños de ovejas sanas de la cooperación Sur-oeste de Noruega. Los resultados demostraron que un número relativamente elevado de ovinos aparentemente sanos en Noruega parece llevar la potencialmente patógenos M. haemolytica y M. glucosida en el tracto respiratorio superior. Además se encontró un número inesperadamente alto de hemolítica M. ruminalis organismos similares en los cuatro rebaños.

Materiales y métodos
Los rebaños y la toma de muestras de bacterias

Un total de 139 ovejas adultas procedentes de cuatro ganaderías de IMS, duela, Kjosavik, y Sandnes, Noruega se incluyeron en el estudio que se llevó a cabo durante la primavera de 2005. Epidemiológico relaciones no se demostró entre los rebaños seleccionados al azar. El rebaño en IMS consta de 33 ovejas adultas Texel. Dentro de este rebaño, un solo ovejas de pasteurellosis sufrido en 2004. Un nuevo carnero fue presentado el mismo año, pero de lo contrario, la manada no había tenido contacto con otras ovejas. La manada de duela incluido en 38 adultos noruego blanco ovejas. Cuatro o cinco casos de pasteurellosis se observaron durante el año 2004. Un nuevo carnero fue presentado a la manada el mismo año y parte de la manada había sido el pastoreo con otros rebaños durante el verano. El Kjosavik rebaño consistía de 40 adultos noruego ovejas blancas y cruces. Un solo animal de pasteurellosis sufrido en 2004. No hay nuevas animales fueron introducidos en la manada durante el año 2004, pero la manada había sido el pastoreo en las montañas con otros rebaños durante el verano. Por último, la manada en Sandnes incluyó 200 adultos de ovino de diversas razas mixtas noruego de White Sheep. A partir de este rebaño, 11 adultos y 17 ovejas corderos se incluyeron en la encuesta. Sin embargo, el rebaño se grassing con otros rebaños durante el verano, pasteurellosis no se habían diagnosticado en este rebaño durante muchos años. El diagnóstico provisional, pasteurellosis se basó en las lesiones descritas por Gilmour y Gilmour [13].

Frotis nasal bilateral fueron tomadas con hisopos estériles de algodón de cada animal. Los hisopos fueron chapados en un 5% de sangre ovina placas de agar (Oxoid) y se incubaron en el 5,8% de CO 2 de 18-20 horas a 37 ° C. Después de la incubación, las placas fueron examinadas por Pasteurellaceae-al igual que las colonias que son de color amarillento o grisáceo, y que muestran una estrecha zona de β-hemólisis. Una sola colonia hemolítica se subcultured y probadas por tinción de Gram, catalasa y oxidasa. Todas las cepas que resultaron positivos catalasa, citocromo oxidasa-positivos, Gram-negativas, y teniendo en la morfología típica colonia de Pasteurellaceae se almacenaron a -80 ° C en bolas porosas (microbanco ™, en favor de los diagnósticos de laboratorio) y posteriormente a El Departamento de Veterinaria Pathobiology, The Royal Veterinary and Agricultural University, Copenhague para una mayor caracterización.

Bacteriana fenotipificación

Un total de 57 cultivos puros se caracterizaron fenotípicamente. Los aislamientos fueron designados para IMS I, S para duela, K para Kjosavik y sólo el número de Sandnes (salvo C1, también de Sandnes). Incluyen caracteres fenotípicos, la morfología de colonia en agar sangre (triptosa base de agar sangre de carnero [Difco], que contiene 5% de sangre bovina citrated), observó la morfología celular de contraste de fase microscopio, la tinción de Gram-, el 3% KOH test, catalasa (3% H 2 O 2) y oxidasa (Fluka). Se examinó la motilidad de contraste de fase a 37 ° C, y por inoculación en VL-medio semisólido (Hermanos del Corazón de infusión (Difco) añade 0. Agar 25%) después de incubación a 22 ° C durante 24 horas. Catabolismo de la glucosa fue examinado por Hugh y Leifson medio (Merck). Ureasa fue probada en la urea Christensen medio (Merck). Indol producción se examinó mediante la adición del reactivo de Kovac a 48 horas de infusión Corazón Hermanos cultura. Producción de ácido a partir de: L (+) arabinosa, D (+) manosa, trehalosa y se examinó como se informó anteriormente [14], mientras que la producción de α-fucosidase (ONPF) y β-glucosidasa (NPG) se determinaron con Rosco comprimidos según diagnóstico a la fabrica instrucciones. CAMP-test se realizó de acuerdo a Christie et al. [15].

Bacteriana por genotipo AFLP y la secuencia 16S rRNA

Los aislamientos con las especies clasificadas de Mannheimia Posteriormente, se caracteriza por AFLP y en comparación con las siguientes cepas de referencia: M. haemolytica NCTC 9380 T, M. glucosida P925 T y M. ruminalis HPA92 T. Por otra parte, seis cepas previamente identificadas como M. ruminalis (HPA90, HPA93, HPA98, HPA109) y M. glucosida (P730, P733) se incluyeron [16].

Se extrajo el ADN utilizando un kit de purificación del ADN (D Prestospin Bug, Molzym) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. AFLP escribiendo se llevó a cabo como se informó anteriormente [17]. En pocas palabras, la no-selectiva BglII primer BglII (FAM-5 'GAGTACACTGTCGATCT 3') y los no selectivos BspDI BspDI primers (5 'GTGTACTCTAGTCCGAT 3') se utilizan para amplificar los fragmentos de restricción posterior a la digestión y la ligadura de sus correspondientes adaptadores. Productos de amplificación fueron detectados en un ABI 377 secuenciador automatizado (PE Biosystems). Cada carril interior incluye un carril-tamaño estándar etiquetados con tinte ROX (Applied Biosystems) y GeneScan 3,1 fragmento de software de análisis (Applied Biosystems) se utilizó para determinar el tamaño del fragmento y el patrón de análisis. AFLP perfiles que comprende fragmentos en el rango de tamaño de 50-500 pb fueron considerados para el análisis numérico con el programa GelCompar II (Matemáticas Aplicadas, Kortrijk, Bélgica). Normalizado AFLP se compararon las huellas dactilares utilizando el coeficiente Dice similitud y la agrupación se realizó un análisis de la UPGMA.

16S rRNA gen secuencia incluyó dos cepas, S9 y 85, lo que representa dos de los tres grupos principales en el M. ruminalis grupo en la Fig. 1. Amplificación por PCR se realizó de acuerdo a las condiciones estándar descrito por Vogel et al. [18]. Los oligonucleótidos para ambos amplificación por PCR y secuenciación del 16S rRNA fueron sintetizados de acuerdo a las secuencias y posiciones en Dewhirst et al. [19] y desbobinador y Dewhirst [20]. Secuenciación del ADN se realizó en el ABI 377 (Applied Biosystems) secuenciador no etiquetados con los primers y el kit BigDye de acuerdo a protocolos descritos con la Química Guía para la secuenciación automática del ADN (Applied Biosystems). Las búsquedas de secuencias de ADN en el NCBI se realizaron por BLAST [21].

Resultados

Sobre la base de los caracteres fenotípicos se indica para cada especie Mannheima en la Tabla 1, las especies de distribución de los aislamientos obtenidos a partir de la presente investigación se resume en el cuadro 2. Allí no se encontraron discrepancias entre los caracteres fenotípicos de manifiesto la actualidad de los aislamientos y las previstas para las diferentes especies Mannheimia de Angen et al. [1]. Sin embargo, dada la considerable diversidad genética entre los aislamientos con la clasificación M. ruminalis se refiere también, como M. ruminalis organismos similares. Curiosamente, todos los aislamientos clasificados con M. ruminalis fueron β-hemolítico en sangre ovina, aunque esta especie se considera en general como no-hemolíticos. La M. ruminalis organismos similares son los más prevalentes Mannheimia especies presentes en los cuatro rebaños.

AFLP mecanografía y análisis de agrupamiento de manifiesto dos grandes grupos divergentes en un 38% de similitud, uno que contiene cepas clasificadas con M. ruminalis y otro que contiene los aislamientos clasificados como M. haemolytica y M. glucosida. Todos los 26 aislamientos de M. ruminalis-al igual que los aislamientos agrupados con el tipo y la cepa otros cuatro cepas de M. ruminalis. Una parte considerable de la diversidad genética se observó dentro de la M. ruminalis grupo. Por esta razón, dos aislamientos (S9 y 85) cada una representando una subcluster que contiene la M. ruminalis tipo de cepa (HPA92 T) y un subcluster no incluidos cepa de referencia, respectivamente, se caracterizaron por 16S rRNA gen secuenciación. Los resultados mostraron 99,6% y 99,4% similitud entre el tipo de cepa, M. ruminalis (HPA92 T), y los aislados S9 y 85, respectivamente. Un 99,7% secuencia 16S rRNA se observó similitud entre los aislados S9 y 85. Además, estas cepas mostró 96,5% a 98,1% secuencia 16S rRNA similitud con el tipo de cepas de M. haemolytica, M. glucosida y M. granulomatis, la mayor similitud observada entre S9 y la M. glucosida tipo de cepa.

La diversidad genética de la M. ruminalis-como los aislamientos obtenidos a partir de la manada Sandnes fue considerable, mientras que los aislados de los otros tres granjas fueron en general más estrechamente relacionados. Seis de los ocho cepas de M. ruminalis-al igual que los aislados de la manada en IMS fueron muy relacionadas (Fig. 1]. Sólo alrededor del 38% se observó similitud entre el tipo de cepa y los aislamientos obtenidos en el presente estudio.

Dieciséis de las 40 ovejas de la manada en la muestra Kjosavik positivo para M. haemolytica, mientras que sólo dos (77 y C1) de ovejas de los 28 examinados de la manada en Sandnes la muestra positiva. Todos los 18 M. haemolytica aislamientos formó un grupo aparte AFLP con la cepa tipo de M. haemolytica (NCTC9380 T). Un total de 13 aislamientos de M. glucosida se obtuvieron a partir de las manadas en duela, Kjosavik, y Sandnes. Estas cepas también formó un grupo AFLP agrupación con la cepa tipo (P925 T) y las cepas de referencia incluido (P730 y P733).

Discusión

Investigaciones anteriores sobre la prevalencia de [P]. Haemolytica han mostrado una considerable variación. Un rango entre 8,9% y 96,2% de ovejas sanas que llevan estos organismos en la cavidad nasal se han reportado [6, 7, 22]. La variación puede ser causada por varios factores, incluyendo las distintas técnicas de aislamiento, identificación errónea, y la variación estacional. Swabbing de las amígdalas y la cavidad nasal de ovejas sacrificadas puso de manifiesto que [p.] haemolytica puedan ser aislados de 95% de las amígdalas y un 64% de los frotis nasofaríngeo [9]. Por otra parte, se ha constatado que la prevalencia de [p.] haemolytica en los climas templados varía estacionalmente con una mayor prevalencia en la primavera y comienzos de verano [13].

En el presente estudio, la tasa de aislamiento Mannheimia spp. varió de 24% a 64% en los cuatro rebaños investigados. Sin embargo, sólo una única colonia hemolítica en agar sangre ovina se caracteriza subcultured y de cada una de las muestras. Además, la cavidad nasal fue muestreada en lugar de las amígdalas que podría explicar la falta total de aislamiento de [P]. Trehalosi. En esta encuesta, las ovejas se swabbed en mayo, donde la prevalencia de Mannheimia spp. se esperaba que fuera a su más alto. Con la excepción de la manada en IMS, por lo menos dos especies diferentes de Mannheimia fueron aislados en cada manada. Además, seis de las ocho cepas de M. ruminalis de la manada en IMS son muy relacionados genéticamente, probablemente refleja el hecho de que esta manada se ha mantenido aislada en el tiempo. Esta manada también mostró la más baja tasa de aislamiento Mannheimia spp.

De acuerdo con Gilmour y Gilmour [13], [P]. Haemolytica (M. haemolytica) está normalmente asociada con neumonía en el ganado bovino y ovino, los corderos en la septicemia y mastitis en las ovejas. Estas observaciones han sido apoyados por Angen et al. [1, 4]. Sin embargo, la presente investigación demuestra claramente que estos organismos también pueden obtenerse en la parte superior del tracto respiratorio de ovejas aparentemente sanos.

M. glucosida parece estar asociado con el tracto respiratorio superior y rumen de las ovejas, sino que también ha sido informado de diversas lesiones [1, 4]. M. ruminalis tiene, hasta el momento sólo se informó desde el rumen de ganado ovino y vacuno, [1, 3] y, fundamentalmente, en un contexto no-hemolíticos. Sin embargo, sólo un número relativamente reducido de cepas disponibles y teniendo en cuenta los resultados del presente estudio, puede ser cuestionado si la no-hemolíticos fenotipo es general a M. ruminalis o si simplemente se aplica a una sub-población de esta especie. Nos sentimos seguros con respecto a la clasificación de la M. ruminalis-al igual que los aislados de esta investigación, ya que mostraron muy alto 16S rRNA gen similar a la M. ruminalis tipo de cepa (HPA92 T) y también agrupados con la M. ruminalis cepas HPA98 ([P]. haemolytica biogroup 8), HPA90 (Bisgaard taxón 18 biovar 2 (árabe +)) y HPA93 y HPA109 (Bisgaard taxón 18 biovar 3 (Sorb +)), como se demuestra por AFLP. Con excepción de los hemolítica del fenotipo M. ruminalis-al igual que las cepas no hubo discrepancias a los resultados fenotípicas descritas en la Tabla 1. Se ha sugerido que la no-hemolíticos M. ruminalis han perdido factores de virulencia asociados a patógenos y sus antepasados filogenéticos [23]. Por lo tanto, podría especuló si la β-hemolítico M. ruminalis-al igual que los organismos aislados en el estudio actual representan una forma intermedia. Alternativamente, puede haber diferentes subpoblaciones, que se han adaptado a diferentes nichos, es decir, en la cavidad nasal y rumen. Aunque nuestro estudio incluyó a representantes de la cavidad nasal y el rumen no hemos podido demostrar genéticamente distintas subpoblaciones basadas en el sitio de aislamiento. Pérdida de factores de virulencia pueden tener en cuenta que en general estos organismos se han adaptado a un más amplio nicho ecológico, que cuenta con el apoyo de la gran diversidad genética demostrada por AFLP. En consecuencia, los futuros estudios relacionados con la β-hemolítico del fenotipo y sus antecedentes genéticos en M. ruminalis será muy relevante.

Savelkoul et al. [24] encontraron que las cepas de Klebsiella mostrando un 90-100% similitud de huellas digitales podrían ser considerados como pertenecientes al mismo clon. En otros estudios incluidos Acinetobacter [25] y Gallibacterium anatis [26], la misma similitud valores se han utilizado para definir un clon. Siempre que el mismo valor se puede utilizar para definir los clones dentro de las especies de Mannheimia, indicó que todos los rebaños investigado han estado expuestos a varias introducciones de Mannheimia spp. lo largo del tiempo o clonal que varios linajes han evolucionado dentro de cada manada.

Conclusión

El presente estudio demuestra que M. haemolytica, M. y M. glucosida ruminalis organismos similares se encuentran en la parte superior del tracto respiratorio de ovejas sanas. Curiosamente, la aparición de hemolítica M. ruminalis-al igual que los aislamientos fue inesperadamente alto. Este organismo ha sido aislado por lo general en un no-hemolíticos. La importancia de este hallazgo tendrá que ser investigado en estudios futuros, con el fin de concluir sobre la importancia biológica de los diferentes hemolítica y no hemolítica fenotipos.

Abreviaturas

AFLP: la longitud de los fragmentos amplificados polimorfismos

UPGMA: no ponderada par Grupo método con medias aritméticas

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

LLP, SPI y TRM tomó parte en todos los aspectos de la investigación, incluida la planificación, toma de muestras, fenotípicas y genotípicas de caracterización y elaboración del manuscrito. SS participó en la planificación, toma de muestras y caracterización inicial de los aislamientos bacterianos. MB participado en la planificación, la caracterización fenotípica y redacción del manuscrito. HC hizo la secuencia 16S rRNA alineaciones. JEO participó en la planificación y redacción de la investigación. AMB participó en la caracterización genotypical, la redacción y la revisión del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a los agricultores Kjell Kjosavik, Ernst Mathiassen y Nils Stian vold que participaron en este estudio. Dan Ifrah se agradece aportación fundamental para el proyecto de Inglés.