Kinetoplastid Biology and Disease, 2006; 5: 6-6 (más artículos en esta revista)

Leishmania amastigotes como objetivos para la detección de drogas

BioMed Central
Adriano Monte-Alegre (-Aduano.Monte alegre @ mpl.ird.fr) [1], Ali Ouaissi (ali.ouaissi @ montp.inserm.fr) [1], Denis Sereno (sereno@mpl.ird.fr) [ 1]
[1] IRD, UR008 "Pathogènie des Trypanosomatidés", 911 Avenue Agropolis, BP 64501, 34394 Montpellier Cedex 5, Francia

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Resumen

Direct screening de drogas contra el mamíferos etapa de Leishmania se ha visto obstaculizado por el costo y el tiempo que consume el esfuerzo necesario para lograrlo. La capacidad para obtener transgénicos Leishmania que expresa los genes reportero abierto nuevas posibilidades para el desarrollo de pruebas de detección de drogas. Evolución reciente de normalizar y reunir múltiples informaciones puede ahora ser envisionned. Vamos a discutir sobre estas metodologías disponibles que podrían mejorar la sensibilidad, fiabilidad, versatilidad y la rapidez, de la pantalla basada en el modelo intracelular.

Fondo

Leishmania es un parásito protozoario que se encarga de varias patologías conocidas colectivamente como la leishmaniasis. De acuerdo con los más recientes de la OMS, 12 millones de personas se ven afectadas por la leishmaniasis en todo el mundo y 2 millones de nuevos casos se producen cada año [1]. Por otra parte, el aumento de la leishmaniasis se debe a múltiples factores, entre ellos la epidemia del SIDA, aumento de los viajes internacionales, la falta de vacunas eficaces, las dificultades en el control de vectores, los conflictos internacionales y el desarrollo de la resistencia a la quimioterapia. Metodologías que imitan de cerca las condiciones encontradas por Leishmania son obligatorios. En este enfoque, se discute la posible aplicación de la tecnología genética reportero, en los experimentos de multiplexación, como una estrategia futura para el cribado de drogas contra Leishmania amastigotes intracelulares.

Reportero la tecnología genética para la detección de drogas en contra de amastigotes intracelulares

La expresión de genes reportero se usa para definir un gen con un fenotipo fácilmente medibles que puede distinguirse fácilmente en un fondo de las proteínas endógenas [2]. Diversos parásitos recombinante con un gen reportero, ya sea como episomal copia o después de su integración en un determinado lugar, por lo general el rDNA lugar, se encuentra actualmente disponible. Para algunos de ellos, la capacidad de estas líneas celulares para ser utilizado in vitro para el procedimiento de detección de drogas fue evaluada frente a axénicos o intramacrophagic amastigotes (Véase el cuadro 1]. Autofluorescent proteínas presentes la ventaja de no exigencia a cofactores o sustratos desde la proteína fluorescente es intrínsecamente [3]. Diversas especies de Leishmania que expresa GFP, GFP multímeros o el incremento de buenas prácticas agrarias (eGFP) fueron de ingeniería [4 - 10]. En general transfectants no expresan un nivel suficiente de fluorescencia para spectrofluorometric medición en una microplaca. Para superar este tipo de problema una forma de multímeros de las buenas prácticas agrarias y de ingeniería se expresó en Leishmania promastigotes. Como era de esperar, los parásitos que expresa la forma de multímeros GFP fluorescencia soportar cuantificables en 96 pozos con spectrofluorometric análisis [6].

En general, los métodos que utilizan catalizadores de la tecnología de genes reportero como luciferase, β-galactosidasa, β-lactamasas son más sensibles que los métodos basados en proteínas fluorescentes. Promastigotes de Leishmania que expresa β-galactosidasa fueron seleccionados y su uso de drogas en los procedimientos de selección evaluó [8]. β-galactosidasa presenta la ventaja de que colorimétrico de detección se puede realizar. Sin embargo, algunos inconvenientes comúnmente citado de β-galactosidasa incluyen su gran tamaño (el monómero es 116 kDa) y la expresión endógena de β-galactosidasa de algunos tipos de células de mamíferos incluyendo los macrófagos [11 - 13]. Para soslayar estas deficiencias, un catalizador reportero sistema basado en β-lactamasas se desarrolló [13]. Dos especies de Leishmania: Leishmania principales y Leishmania amazonensis expresar β-lactamasas fueron diseñados y seleccionados. La actividad de algunas drogas antileishmanial estándar se evaluó en intramacrophagic amastigotos. En general, los resultados obtenidos demuestran que esta metodología podría ser valiosa para los procedimientos de detección de drogas [12].

Varias especies de parásitos se expresan luciferase desarrollado recientemente y su susceptibilidad hacia la clásica antileishmanial agentes investigados [14 - 16]. Las principales ventajas de esta tecnología son numerosas e incluyen la alta sensibilidad de la prueba y la ausencia de antecedentes de actividad en la célula huésped. Recientemente, un refinado trabajo realizado por Lang y sus colaboradores demostraron que L. amazonensis parásitos expresar firefly luciferase podrían utilizarse para controlar la infección por Leishmania en tiempo real, a través de análisis de imagen. También han probado diversos compuestos antileishmanial y han seguido su eficacia en células vivas mediante la utilización de imágenes [17]. La ventaja de esta metodología se basan en la capacidad de realizar experimentos sobre células vivas, lo que hace el análisis más rápido y más exacto ya que la viabilidad de los parásitos y las células huésped es objeto de seguimiento.

Reportero genes presentes varias limitaciones. Resistencia cruzada conferida por la presencia de la resistencia a los antibióticos es uno de ellos. Neomicina confiere resistencia hacia paromomycin [18]. El desarrollo del método definido para crear mutantes que carecen de seleccionar los marcadores podrían contribuir a superar este problema [19]. La forma en la que el reportero gen se introduce también podría tener un impacto en el rendimiento de la pantalla. Cuando los periodistas son parte de los plásmidos, la relativa reportero de salida puede depender del número de copias del plásmido transfectadas (que varían de célula a célula) más que en la actividad de la droga. En segundo lugar la transformación de parásitos podría tener consecuencias biológicas, ya sea por perturbar la arquitectura genómica o simplemente por la presencia de los extranjeros reportero producto génico. En tercer lugar, por la β-galactosidasa tecnología, el periodista podría tener por sí mismo ciertas limitaciones (es decir, la sensibilidad, los antecedentes de la actividad de acogida macrófagos) que hacen que sea inexacta para una determinación in vitro de la actividad de drogas contra parásitos intracelulares.

La mejora de la normalización y la eficacia de detección de drogas por medio de la recolección múltiples informaciones al mismo tiempo

Obtener información sobre la actividad de drogas en contra de un organismo intracelular es difícil y lleva mucho tiempo. Los datos sobre la toxicidad contra la célula hospedadora se debe recopilar antes de la prueba los compuestos contra el agente patógeno intracelular. La heterogeneidad en la tasa de infección del país de acogida puede tener una influencia sobre la toxicidad de compuestos. La actividad cinética de los compuestos puede variar y tienen que ser evaluados. Una metodología versátil que permite al investigador para cuantificar y probar múltiples parámetros de cinética de acción, la concentración de drogas y la viabilidad tanto contra células de acogida y los amastigotes intracelulares (multiplexado) podría aumentar el rendimiento de la pantalla. Al mismo tiempo, recabar información sobre la viabilidad de las células huésped y los parásitos el uso de una combinación de parásitos y macrófagos que expresan diferentes reportero puede ahora ser prevista. Para lograr este objetivo, el reportero debe utilizar la señal distinguibles unos de otros y el uso compatible química. Fluoróforos, que emiten longitudes de onda diferentes, han sido ampliamente utilizados para distinguir entre múltiples señales. Recientemente, ha habido un número creciente de ejemplos utilizando luminiscencia de multiplexación, ya sea en combinación con: 1 - otras señales luminiscentes, 2 - fluorescencia o 3 - β-galactosidasa de ensayo [20, 21]. Dado que los resultados se expresan como una relación entre la señal de salida emitida por la célula huésped y el emitido por los parásitos, dicha metodología podría también ayudar a normalizar los experimentos con el fin de comparar directamente la actividad de drogas. La utilidad de estos enfoques para la detección de drogas tiene que ser evaluado por parásitos intracelulares como Leishmania o T. cruzi. Fibroblastos que expresan β-galactosidasa pueden ser adquiridos en la ATCC y puede por lo tanto, representan buenos candidatos para llevar a cabo experimentos preliminares, en T. cruzi. En conclusión, la capacidad de múltiples genes reportero tecnologías que se utilizarán en los experimentos de multiplexación tienen que ser evaluados, ya que puede representar una herramienta valiosa en el campo de la parasitología y la farmacología.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por becas de Indo-centro francés para la Promoción de investigación avanzada (IFCPAR / CEFIPRA, Centro Franco-Indien pour la promoción de la Recherche Avancée, contrato n ° 3603-C). AMA cuenta con el apoyo de FRM (Fondation pour la Recherche Medicale) y IRD de DSF. Damos las gracias L Baltas para revisar la redacción del manuscrito.