Journal of Nanobiotechnology, 2006; 4: 10-10 (más artículos en esta revista)

Tridimensionales reconstrucción de núcleos celulares, interiorizado quantum dots y sitios de la peroxidación lipídica

BioMed Central
W Robert J Funnell (robert.funnell @ mcgill.ca) [1], Dusica Maysinger (dusica.maysinger @ mcgill.ca) [2]
[1] Departamentos de Ingeniería Biomédica y otorrinolaringología, McGill University, 3775 rue University, Montreal, Quebec, H3A 2B4, Canadá
[2] Departamento de Farmacología y Terapéutica, McGill University, 3655 paseo-Sir William Osler, Montréal, QC, H3G 1Y6, Canadá

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.

Resumen
Fondo

El objetivo del estudio fue desarrollar e ilustrar en tres dimensiones (3-D) la reconstrucción de los núcleos y la peroxidación lipídica intracelular en las células expuestas a estrés oxidativo inducido por quantum dots. La muerte celular programada se caracteriza por múltiples bioquímicos y cambios morfológicos en diferentes organelos, incluyendo los núcleos, las mitocondrias y lisosomas. Es la dinámica del espacio-temporales cambios en la señalización y las adaptaciones morfológicas que en última instancia, determinar la «forma» y el destino de la célula.

Resultados

Se presentan nuevos enfoques para el 3-D reconstrucción de la morfología y orgánulos cambios bioquímicos en vivo confocal de células imágenes. Demostramos el 3-D formas de núcleos, el 3-D intracelular de las distribuciones de QDs y medidas de acompañamiento de lípidos de membrana peroxidación, y proporcionar métodos para la cuantificación.

Conclusión

Este estudio proporciona una aproximación a 3-D orgánulo y nanopartículas de visualización en el contexto de la muerte celular, sin embargo, este enfoque también es aplicable en términos más generales a la investigación de los cambios en la morfología orgánulo en respuesta a las intervenciones terapéuticas, los estímulos estresantes y interiorizado las nanopartículas. Por otra parte, el enfoque proporciona datos cuantitativos para esos cambios, que nos ayudará a integrar mejor la compartimentación de los acontecimientos y subcelular de vincular morfológicas y bioquímicas con los cambios fisiológicos resultados.

1. Fondo

Quantum dots (QDs) se utilizan cada vez más como complemento de tintes molecular bio-en aplicaciones de imágenes. En comparación con estos tintes, QDs tienen dos propiedades especiales: tamaño dependen de luminiscencia, y amplia de excitación, pero relativamente estrecha espectros de emisión [1 - 3]. Los diferentes procedimientos de síntesis y nivelación diversos métodos de conjugación y proporcionar una amplia gama de QDs con diferentes sustancias químicas y biológicas, incluida su estabilidad en ambientes biológicos. QD estabilidad es esencial tanto para la calidad de la señal de imagen y de la compatibilidad de las células vivas. Varios grupos han logrado conjugar la limitación o varios ligandos biológicamente interesantes con QDs y han demostrado su utilidad para diferentes aplicaciones biológicas [4 - 14].

Pese a los enormes avances de la biofísica, química y biológica de las investigaciones, la compatibilidad de QDs con células vivas sigue sin resolverse, y la investigación en este campo está todavía en sus inicios [15 - 20].

QDs, al igual que otros estímulos que causan la muerte celular, induce tanto sutil y robusto cambios morfológicos en varios orgánulos, incluyendo el núcleo [21]. Un tipo de muerte celular ha sido atribuido a la localización y el grado de condensación de la cromatina. Dependiendo del tipo de estímulo estresante y en su duración e intensidad, convertirse en núcleos pyknotic (condensada y disminuido), hipertróficas (hinchada), contorted o fragmentado [22]. Varios tipos de QDs pueden generar especies reactivas del oxígeno en disolución acuosa los medios de comunicación [16] conduce a estrés oxidativo si los enzimas antioxidantes y otros componentes celulares no pueden compensar el insulto. Bruta de cambios morfológicos en núcleos celulares son fácilmente detectables por tinción de uso común con los tintes fluorescentes, como la DAPI, DRAQ5 y Hoechst. Estas manchas son las estrategias adecuadas para la identificación de los núcleos, conteo de células y activados por fluorescencia de células clasificador (FACS) análisis. Sin embargo, los datos cuantitativos de imágenes de microscopía confocal son a menudo no se hayan previsto, debido a la falta de sencillo y fácil de usar software. Los datos cuantitativos que reflejan los cambios nucleares en forma y volumen antes, durante y después de células insultos y las intervenciones farmacológicas son útiles para las correlaciones con las respuestas celulares.

La naturaleza de los cambios morfológicos y de las relaciones espaciales entre los orgánulos pueden ser difíciles de apreciar por el mero hecho de ver en dos dimensiones (2-D) imágenes, pero un montón de esas imágenes pueden ser explotados para producir tridimensional (3-D) utilizando modelos gráficos por ordenador. Dependiendo del tipo de imágenes y en los algoritmos utilizados, tales modelos pueden ser más o menos intensidad de mano de obra y tiempo. Una vez creados, estos 3-D modelos pueden utilizarse tanto para la visualización y para la cuantificación. En este estudio nos proporcionan un ejemplo de 3-D reconstrucción de los núcleos, de la cromatina y la distribución de los sitios de la peroxidación lipídica en las células sometidas a estrés oxidativo de las nanopartículas. Cromatina reorganización en núcleos celulares y la peroxidación lipídica son sucesos críticos que pueden afectar significativamente función de la célula y, eventualmente, conducir a la muerte celular. La cuantificación de estos cambios intracelulares es difícil de evaluar a partir del 2-D imágenes e imposible de espectrofotométrico determinaciones.

En el presente estudio, describimos nuclear cambios inducidos por los tratamientos QD en modelo MCF-7 y las células PC12. También describe métodos efectivos para el 3-D de reconstrucción, visualización y cuantificación de los núcleos y QDs. Se discuten dos enfoques específicos para la segmentación y 3-D de reconstrucción para la creación de 3-D modelos, y combinan los enfoques con el fin de producir compuestos de los modelos de núcleo, la membrana celular y interiorizado QDs. Se utilizó como modelo QDs nanopartículas que pueden inducir estrés oxidativo con el fin de evaluar: (i) cambios morfológicos en los núcleos de células vivas, (ii) la distribución espacial de la cromatina y QDs dentro de las células, y (iii) la peroxidación lipídica que se produce como un consecuencia del estrés oxidativo.

Los métodos pueden aplicarse a diferentes tipos de células para estudiar los cambios en orgánulo morfologías en respuesta a cualquiera de nanopartículas terapéuticas o tratamientos. Por otra parte, estos métodos ayudan a revelar multa cambios en los distintos compartimentos y proporcionará datos cuantitativos para esos cambios, lo que contribuye a nuestra comprensión de la función de señal de la compartimentación y el fortalecimiento del vínculo con morfológicos y fisiológicos de los resultados.

2. Resultados

Numerosos estudios han abordado la cuestión de los cambios intracelular inducida por el estrés oxidativo, incluidos los cambios en los núcleos, membranas, mitocondrias y lisosomas [23 - 26]. Nuestros estudios anteriores mostraron que QDs con superficies sin protección (sin topes y conchas) son relativamente inestable y puede causar la muerte celular [17]. El presente estudio ilustra los nuevos enfoques para la reconstrucción de la distribución espacial intracelular de QDs, cambios morfológicos del núcleo, y que acompaña a la peroxidación lipídica intracelular. El principal ejemplo es una MCF-7 celda con internalizado verde, de carga positiva QDs con cisteamina en la superficie. Cuando en el suero libre de soporte, estas células son susceptibles de tratamiento QD que los resultados significativos en la peroxidación lipídica y la muerte celular después de 24 horas (las células de control: 5,7 ± 0,2%; QD tratados: 30,4 ± 1,2%, p <0,05). Síntesis, caracterización y dependiente de la concentración de toxicidad de estos QDs se informó recientemente por nuestro grupo [16]. En este estudio, nuestro principal consistirá en los datos de serie de secciones en vivo de células de imágenes de microscopía confocal.

2,1 Morfología del núcleo

El primer ejemplo dado aquí se basa en una imagen de conjunto de datos que contiene 18 rebanadas. El pixel (elemento de imagen) el tamaño de cada imagen es de 0,19 μ m y el espaciamiento entre rebanadas es 0,57 μ m. Fig. 1 muestra un trozo. (B) muestra el canal rojo, lo que corresponde a la imagen sin confocal de fluorescencia. El esquema de la célula es visible, pero no tinción especial se utilizó para la membrana celular. (C) muestra el canal verde, que coincidirá con el quantum dots, y (d) muestra el tono azul, que corresponde al núcleo.

El núcleo y la membrana celular, por un lado, tienen formas relativamente simples, pero en las imágenes aquí no tienen límites limpia y fuerte contraste. Un semi-automático para la segmentación tanto, es conveniente, y en nuestro caso usamos un trozo por trozo iterativo frontera ajustada algoritmo que se inicializa y guiado (y posiblemente corregida) manualmente. El procedimiento está descrito en detalle en los métodos.

Los puntos cuánticos, por otra parte, forma grupos con formas complejas, pero tienen intensidades coherente. Un sistema automático umbral enfoque basado en la segmentación es apropiado en este caso y también se describe en el método.

Fig. 2 muestra el resultado 3-D para el modelo MCF-7 de células discutidos aquí. El rojo y azul representan las superficies de la membrana plasmática celular y núcleo, respectivamente. Cada pequeña caja verde representa un vóxel (elemento de volumen) que está por encima de los umbrales especificados en el canal verde y, por tanto, se considera que corresponden a un conjunto de puntos cuánticos. Este tipo de modelo puede ser muy útil para la evaluación de fenómenos como el 3-D cambios en la forma debido a los daños causados por puntos cuánticos, y el 3-D de las distribuciones de puntos cuánticos.

Adicional 1 archivo contiene los 3-D modelo y se pueden ver interactivamente con un visor VRML. Adicional archivo 2 es una animación creada por la rotación de la 3-D modelo, para aquellos que no desean instalar un visor VRML.

Esta técnica también puede utilizarse para visualizar la distribución de la cromatina condensada en el núcleo. Fig. 3 muestra otro modelo para el núcleo de la misma MCF-7 celda. La forma general del núcleo es una vez más muestra como una superficie translúcida, y la cromatina con intensidades por encima de un determinado umbral se muestra como cajas azules. Archivos adicionales 3 y 4 contienen la completa 3-D modelo y una animación de la misma. La falta de distribución uniforme de la cromatina es claramente visible. Fig. 4 muestra un modelo similar para un celular PC12 [véase la disposición 5].

2,2 Volúmenes de los núcleos y puntos cuánticos

Hemos examinado 2-D imágenes de numerosos núcleos y las estimaciones de la nuclear transversales de la superficie. Por ejemplo, los cambios en la sección transversal de las zonas núcleos a QD tratamientos se obtuvieron a partir del 20 2-D imágenes. Hay un cambio significativo en el medio nuclear transversales de la superficie del área de valores en QD tratados con células (una disminución significativa de pyknotic células y un aumento de células hipertróficas en comparación con los controles). La sección transversal son las zonas 161,7 ± 17,5 μ m 2 para las células normales; 99,5 ± 5,6 μ m 2 para pyknotic células, y 202 ± 10,8 μ m 2 para las células hipertróficas. Si uno supone que las células son esféricas y que las Secciones transversales corresponden a las secciones a través de los centros de las esferas, se podría calcular los volúmenes correspondientes con la fórmula

V = 4 3 π ( Un π ) 3 2 . MathType MTEF @ @ @ 5 + 5 = @ feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacH8akY = wiFfYdH8Gipec8Eeeu0xXdbba9frFj0 = OqFfea0dXdd9vqai = hGuQ8kuc9pgc9s8qqaq = dirpe0xb9q8qiLsFr0 = vr0 = vr0dc8meaabaqaciaacaGaaeqabaqabeGadaaakeaacqWGwbGvcqGH9aqpdaWcaaqaaiabisda0aqaaiabiodaZaaaiiGacqWFapaCdaqadaqaamaalaaabaGaemyqaeeabaGae8hWdahaaaGaayjkaiaawMcaamaaCaaaleqabaWaaSaaaeaacqaIZaWmaeaacqaIYaGmaaaaaOGaeiOla4caaa @ @ 3A12

Las mencionadas zonas, por lo tanto corresponden a los volúmenes de 1547 μ m 3 (normal), 747 μ m 3 (pyknotic) y 2160 μ m 3 (hipereutrófico), respectivamente. Estas estimaciones, sin embargo, dependerá de forma decisiva en los dos supuestos, ninguno de los cuales es probable que sea válida. La asunción de esfericidad pueden ser aplicables a la normalidad MCF-7 núcleos, pero no es aplicable a los anormalmente forma y no es en absoluto aplicable a las células PC12, por ejemplo, que tienen núcleos de forma irregular, incluso en las condiciones normales. Más sofisticado estereológicos se disponga de métodos para obtener estimaciones de volumen imparcial para las poblaciones de objetos [27]. Para estimar los volúmenes de cada uno de los núcleos, se puede calcular a partir de ellas reconstruir en 3-D superficies, tal como se describe en Métodos. Por ejemplo, para el 3-D de un modelo MCF-7 de células se ha señalado anteriormente, el volumen del núcleo se calculó para 1180 se μ m 3.

La cuantificación de QDs es casi imposible de solo 2-D imágenes desde la distribución de fluorescencia es extremadamente variable de un trozo a otro. Por lo tanto, es necesario utilizar la información de todas las rodajas. A través de todas las rebanadas en este conjunto de datos, el número total de voxels correspondientes a los puntos cuánticos es 2856, dado el tamaño de pixel y el tramo espaciamiento de los nacimientos, el volumen de un vóxel es de 0,02 μ m 3, por lo que el volumen total de los puntos cuánticos es 58,8 μ m 3, o alrededor del 5% del volumen del núcleo.

Para la comparación se muestra aquí otros dos ejemplos, tanto de nuevo por MCF-7 células. En la Fig. 5 [ver archivos adicionales 6 y 7], la imagen en la parte superior es de un control de células. El conjunto de datos contiene 20 rebanadas con un espaciamiento de 0,41 μ m, y un tamaño de pixel de 0,19 μ m de nuevo. El núcleo del volumen es 1440 μ m 3. La imagen en la parte inferior (no en la misma escala) es otro de control celular. Este conjunto de datos contiene 30 rebanadas con un trozo de espaciamiento de 0,61 μ m, y de nuevo un tamaño de pixel de 0,19 μ m. El núcleo del volumen es 1530 μ m 3. El núcleo de estos volúmenes de control de las células son el 22% y 30% mayores, respectivamente, que no sea la de la QD tratados MCF-7 de células se ha expuesto.

2,3 peroxidación lipídica

Las proteínas, los lípidos y el ADN son susceptibles de especies reactivas del oxígeno y pueden ser peroxidized bajo condiciones de estrés oxidativo. Se evaluó la medida de la peroxidación lipídica en las células expuestas a QDs utilizando BODIPY C 11 @ 581/591. Este tinte fluorescente emite fluorescencia de color rojo cuando los lípidos son unoxidized y verde cuando se oxidan. Un enfoque ratiometric utilizando spectrofluorometry puso claramente de manifiesto que el tratamiento QD causas peroxidación lipídica. (La relación entre el rojo y verde se redujo significativamente en QD-células tratadas: control = 1553,9 ± 270,2, QD tratados = 512,3 ± 49,9, p <0,05). Sin embargo, dado que la spectrofluorometric enfoque no proporciona la información espacial, hemos utilizado el mismo tinte para generar imágenes con microscopía confocal. Un ejemplo se muestra en la Fig. 6, en el que las partes (a) y (b) muestran el rojo y verde canales, respectivamente. El rojo y azul representan las líneas de la membrana celular y núcleo como segmentado con la técnica descrita interactivo bajo métodos.

Modelos tridimensionales proporcionar los medios para la cuantificación y también pueden mostrar la distribución espacial de la oxidación intracelular de lípidos. Fig. 7 muestra una vista de un 3-D modelo [véase la disposición 8] en el que la membrana celular y núcleo se basan en la segmentación se muestra en parte por el rojo y azul, líneas en la Fig. 6, y los voxels correspondientes a la canal verde (lípidos oxidados) se muestran con cajas sobre la base de un umbral.

De la Fig. 6 (a) y (b) y está claro que hay más de lípidos que unoxidized oxidados. Para cuantificar la observación, uno puede calcular la intensidad total en cada canal, tal como se describe en Métodos. En la celda el tramo se muestra en la Fig. 6, hay un total de intensidad de 671 × 10 3 en el rojo (unoxidized) y sólo el canal 131 × 10 3 en el verde (oxidadas) canal, una proporción de aproximadamente 5,1. En resumen, sobre todas las rebanadas, se obtiene de esta celda un total de intensidad de color rojo de 16,5 × 10 6 y un total de intensidad de verde 2,89 × 10 6, una proporción de aproximadamente 5,7. La similitud de los coeficientes sugiere que este trozo es un ejemplo típico. Para una segunda celda de los mismos datos (no se muestra), la intensidad total en todas las rebanadas es 19,3 × 10 6 para el canal rojo y 1,83 × 10 6 para el verde, para una proporción de alrededor de 10,5.

Para visualizar la distribución de relativa intensidad, se puede ver la combinación aditiva de color rojo y verde los canales en la forma convencional, como en la Fig. 8 (a), pero esto es difícil de cuantificar. Una alternativa es para mostrar las diferencias entre el rojo y verde los canales tal como se describe en Métodos. El resultado se muestra en (b). Los píxeles aparecen como gris cuando la intensidad diferencia es cero, como tonos de amarillo rojo cuando la intensidad es mayor que la intensidad de verde, y como tonos de azul cuando la verdad es todo lo contrario. La dominante de color amarillo brillante y la escasa dispersión de azul confirma la impresión obtenida a partir de la visualización en canales separados (a) y (b) de la Fig. 6.

3. Discusión

En este estudio se presenta un versátil, sencillo y adecuado a 3-D reconstrucción de localización intracelular QD y de los cambios en la morfología nuclear y la peroxidación lipídica como consecuencia del estrés oxidativo [16, 17, 28 - 33]. El enfoque que presentamos aquí es aplicable a cualquier tipo de células y para cualquier farmacológica o la manipulación genética que lleva a morfológicas y / o bioquímicos cambio. También es aplicable a mucho mayor estructuras anatómicas [34, 35] y para diferentes orgánulos que juegan un papel en la muerte celular [18].

Muchos enfoques están disponibles para crear y compartir 3-D modelos. Aunque en 3-D modelos pueden ser producidos por la libre-forma arbitraria creación de formas, en este documento que estamos examinando el caso en que la forma del modelo se obtiene a partir de 3-D de datos de imágenes que consta de una pila de imágenes alineados. Estos modelos se basan a menudo en rayos X de tomografía computarizada (TC) y resonancia magnetica (MRI), pero aquí estamos considerando óptica confocal de la sección de microscopía. En comparación con la TC y la RM de datos, ópticos seccionar a menudo se traduce en un menor número de rebanadas y en una rebanada de espesor que es mayor que en el tramo tamaño de pixel.

La geometría del modelo se deriva de la segmentación de imágenes, es decir, de determinar qué partes de las imágenes corresponden a las estructuras de interés. El proceso de segmentación pueden variar de meramente manual 2-D (una rebanada a la vez) a totalmente automático 3-D. En este trabajo se demuestra el uso de dos enfoques diferentes, dependiendo de la naturaleza de las imágenes y de las estructuras para ser competitivo.

Para imágenes que no tienen limpias las fronteras y un fuerte contraste, un semi-automático enfoque es el adecuado. En este caso usamos un trozo por trozo iterativo frontera ajustada algoritmo que se inicializa y guiado (y posiblemente corregida) manualmente. Esta técnica puede ser laborioso y que se utiliza mejor, bien cuando las formas de ser segmentados son relativamente simples o cuando la calidad de imagen es simplemente no es lo suficientemente bueno para permitir una más técnica automática. Según se describe en Métodos, una serie de parámetros se pueden ajustar para modificar el comportamiento del algoritmo. Los mejores valores de los parámetros a utilizar dependerá de la naturaleza de las imágenes e incluso a la diferente naturaleza de estructuras específicas dentro de las imágenes. Una vez que un conjunto de parámetros se ha establecido, que puede dejarse sin cambios mientras que un número de conjuntos de datos están siendo analizados si es importante para mantener la coherencia en aras de la cuantificación y la comparación.

Un parámetro utilizado para guiar el algoritmo de segmentación en este caso es la fuerza umbral. Normalmente en la segmentación de imágenes de trabajo, si el umbral se utiliza en todos, se utiliza para determinar completamente la segmentación: píxeles o voxels cuyas intensidades están por encima del umbral se consideran parte de la estructura, y aquellos cuya intensidad se encuentran por debajo del umbral no lo son. Esto puede llevar a límites muy áspera incluso para las estructuras sin problemas a causa de ruido en la imagen-proceso de adquisición. El hecho sigue siendo, sin embargo, un umbral que puede a menudo ser una buena indicación visual de los límites que debería ser. En nuestro enfoque asignamos un parámetro de fuerza al límite, como se ilustra en la Fig. 9. Si la fuerza es igual a cero (negro línea), el umbral es sólo para visualización por el usuario y no tiene ningún efecto sobre el algoritmo de segmentación. Si la fuerza es una (línea roja), el umbral por completo el control de información de la imagen utilizada por el algoritmo. Normalmente utilizamos un valor intermedio (línea verde), por lo que el límite del comportamiento de búsqueda del algoritmo se ve influida por el umbral, sino que también puede verse influenciado por los matices de intensidad en torno a la frontera.

Cuanto más baja es la calidad de una imagen y mayor será la precisión requerida, el más largo interactivo técnica de segmentación será. En las imágenes se muestran aquí, el mayor desafío es que la segmentación de la membrana celular. Si la forma exacta global de la célula requiere un estudio cuidadoso, sin embargo, una mancha puede ser utilizada para ese fin, lo que aumenta el contraste y la frontera facilitar enormemente el proceso de segmentación.

La segunda segmentación técnica utilizada en este caso es totalmente automático 3-D umbral basado en la segmentación. Para las estructuras que tienen relativamente buena imagen de contraste, bien definidos y bordes uniformes intensidades, es factible utilizar el umbral basado en los algoritmos de segmentación. Esa segmentación automática es especialmente conveniente para las estructuras con fronteras muy irregulares o de un gran número de pequeñas estructuras, teniendo en cuenta que en ambos casos interactivo segmentación sería muy tedioso.

Independientemente de la técnica de segmentación que se utiliza, si la dimensión de las estructuras son segmentados a ser cuantificados, entonces es evidentemente deseable que los límites ser correctamente identificados. Esto se aplica por igual a 2-D y 3-D métodos. A menudo es difícil, sin embargo, para determinar qué es "correcto" desde las fronteras a menudo no son marcadamente delineados. En algunas situaciones podría ser posible comparar los resultados con otras modalidades de imágenes, tales como la microscopía electrónica de transmisión (TEM) de serie de secciones, pero cada técnica tiene sus propios signos de interrogación. En el caso de TEM, por ejemplo, los límites puede ser muy fuerte pero la distorsión debido a la fijación y otro tipo de elaboración es difícil de determinar.

Para muchos propósitos, precisión absoluta no es tan importante como la coherencia, como al comparar el tamaño de una población de estructuras con los de otra población. Mientras la imagen se mantienen los parámetros de la misma, la coherencia de segmentación se puede obtener completamente automático con umbral basado en la segmentación simplemente de mantener el límite sin cambios. Incluso con semi-automático técnicas, la coherencia puede obtenerse de mantenimiento de los distintos parámetros de segmentación sin cambios una vez que se han determinado, como se mencionó anteriormente, y por consiguiente la limitación de la intervención manual para tareas simples como la selección de regiones o estructuras a ser transformadas en datos diferentes conjuntos.

Una característica importante del tipo de imágenes utilizadas en este caso es que se trata de dos o tres canales de color independientes. En otras aplicaciones de imágenes biomédicas, las imágenes son por lo general, ya sea monocromática (por ejemplo, rayos X TC y la RM) o "real" de color (por ejemplo, histología). En el caso real de color, las imágenes son más a menudo representados numéricamente como rojo, verde y azul, los canales, pero son conceptualmente compuesto de tono, luminosidad y saturación. En el presente caso, sin embargo, el rojo, verde y azul representan realmente los canales de fuentes independientes de información (por ejemplo, las diferentes frecuencias de láser). Esto implica que la segmentación debe llevarse a cabo un canal a la vez y que el software debe ser capaz de mostrar y procesar los tres canales, ya sea individualmente o en diversas combinaciones.

Una vez que un conjunto de imágenes ha sido segmentado en cierto modo, las diferentes técnicas están disponibles para la creación 3-D modelos de superficie. Las dos técnicas que aquí se presenta, la triangulación entre contornos simples y etiquetado de los voxels, son complementarios. El resultado 3-D modelos pueden ser presentados como imágenes o como películas, pero son mucho más informativo si realmente puede ser manipulado en forma interactiva en 3-D. El uso de VRML97 el formato de archivo estándar para intercambio de 3-D modelos a través de la World Wide Web permite que los modelos a ser compartida con otros investigadores, que fácilmente puede instalar gratuitamente en 3-D de televidentes en sus propios ordenadores sin necesidad de ningún hardware especial.

La norma X3D es un 'mayor sucesor de VRML' VRML, pero sigue siendo útil ", mientras que los desarrolladores de actualizar sus productos para apoyar a X3D '[36].

4. Conclusión

El enfoque que aquí se presenta es adecuado para 3-D reconstrucciones de múltiples eventos intracelulares que incluyen tanto morfológicas y cambios bioquímicos en diferentes orgánulos. Los resultados muestran cómo en 3-D reconstrucciones pueden proporcionar información cuantitativa de traducción simultánea intracelular cambios morfológicos (por ejemplo, el nuclear encogimiento o expansión) y cambios bioquímicos (por ejemplo, la peroxidación lipídica) hizo hincapié en que se forman en las células. El enfoque es aplicable a cualquier tipo de células y cualquier caso discernible con marcadores fluorescentes (por ejemplo, para revelar Lysotrackers lisosomales hinchazón, Mitotrackers para morfología mitocondrial o JC-1 para los cambios de potencial mitocondrial) detectables por microscopía confocal.

5. Métodos
5,1 Cell preparación

Todos los estudios con cultivos celulares fueron aprobadas por el Comité de los riesgos biológicos de la Universidad McGill en las condiciones certificadas por el comité y recomendado por la ATCC (American Type Culture Collection).

Quantum dots se prepararon y se caracteriza, tal como se describe anteriormente [16].

Rat feocromocitoma (PC12 células) y humanas de cáncer de mama (MCF-7) las células fueron cultivadas (37 ° C, 5% CO 2) en medio RPMI 1640 que contiene 10% fœtal suero bovino (SFB) (Gibco, Burlington, ON, Canada) . Medio RPMI 1640 fue de color rojo fenol libre y figura 1% de penicilina-estreptomicina. Por spectrofluorometric colorimétricas y ensayos, las células fueron cultivadas a 24 y placas (Sarstedt, Montreal, Quebec, Canadá) a una densidad de 105 células / cm 2.

Una hora antes de tratamientos, soporte de suero fue aspirado, lavado y las células con el suero libre de soporte. Suero dulce libre de soporte se añadirá a todos los pozos, excepto para el control de las células cultivadas en el 10% de SFB para tener en cuenta los cambios en la morfología celular, número de células y la actividad metabólica causada por la retirada de suero.

QD soluciones (5 o 10 μ g / ml) se prepararon de la población (2 mg / mL), por dilución en suero libre de células, medio de cultivo. Las células fueron incubadas con QDs para obtener el máximo de 24 horas de antelación al análisis bioquímicos o en vivo de imágenes de células.

5,2 Cell viabilidad

Tras la QD tratamientos, las células fueron teñidas con Hoechst 33342 (10 μ M, 1 hora). El número de núcleos se determinó contando todos los núcleos fluorescentes, independientemente de sus formas, por triplicado, con mediciones que se está realizando por condición, como mínimo. Por otra parte, la intensidad de fluorescencia se mide por spectrofluorometric lecturas con la SpectraMax Gemini XS spectrofluorometer microplaca (Molecular Devices Corporation, EE.UU.). Número de células se determinó a partir de las porciones lineales de curvas de calibración (RFI para Hoechst versus número de células). Los datos fueron analizados con el SOFTmax Pro 4,0 programa. Todos los valores se presentan en porcentajes en relación con el suero de control negativo.

5,3 peroxidación lipídica

Las células fueron tratadas con el colorante fluorescente BODIPY ® 581/591 C 11 (BODIPY C-11, Molecular Probes), que se inserta en las membranas celulares y permite una evaluación cuantitativa de oxidados versus unoxidized lípidos fluorescentes de color verde o rojo, respectivamente, y se analiza bien de spectrofluorometry o por microscopía confocal. Las células fueron teñidas durante 30 minutos con un 10 μ M de solución BODIPY C-11 antes de su tratamiento QD. Tras el tratamiento QD, spectrofluorometric muestras fueron preparadas de la siguiente manera: los lípidos se extrajeron de las células de acuerdo con el método de Folch incubando dos veces con una mezcla de cloroformo y metanol (2:1 [v / v]). Después de la extracción, el 0,2 volúmenes de 0,9% solución de NaCl y se añadieron el cloroformo que contienen fase se recogieron. Después de la evaporación del cloroformo y la disolución de los lípidos en isopropanol, spectrofluorometric lecturas fueron tomadas con la SpectraMax Gemini XS spectrofluorometer microplaca (Molecular Devices Corporation, EE.UU.). Los datos fueron analizados con el SOFTmax Pro 4,0 programa. Todos los valores se presentan como medio normalizado ± SEM en relación con el suero de control negativo (tomado como 100%). Los valores se considera significativo cuando p <0,05.

5,4 microscopía confocal

Las imágenes fueron adquiridas con un Zeiss LSM 510 Nlo microscopio invertido. Las células fueron cultivadas en bien de 8 cámaras (Lab-Tek, Nalge Nunc International, Rochester, NY, EE.UU.). QDs se añadieron a las pozos y las células fueron incubadas durante 24 horas. Los núcleos se tiñen con Hoechst 33342 (10 μ M, 30 min-1 h, sondas moleculares; ex λ 350 nm, λ em 461 nm) y analizados por 2-imágenes de fotones (Ti: Sa láser fijado a pulso a 800 nm y 390 BP -465 Filtro IR). Peroxidación lipídica fue evaluada por tinción con BODIPY C-11 (Molecular Probes) y el cambio de rojo a verde se vigila con láser de HeNe un (543 nm, 560 nm LP filtro) y un láser de argón (488 nm, 520 nm LP filtro) . No hay antecedentes de fluorescencia de células se detectó bajo los parámetros utilizados. Las imágenes fueron adquiridas a resoluciones de 512 × 512 y 1024 × 1024. En todos los experimentos de imagen, el número de promedios fue de 4. Scan tamaño fue 146,2 μ m × 146,2 μ m.

El análisis estadístico 5,5

Los datos fueron analizados con SYSTAT 10 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.). Significación estadística fue determinada por Student's t-test, ANOVA de un factor seguido de multiparamétricos Dunett del post-hoc de prueba, o de dos vías ANOVA. Las diferencias se consideraron significativas cuando p <0,05.

5,6 Interactive segmentación de imagen
5,7 Umbral basado en la segmentación de imagen

Esta sección describe automático 3-D umbral basado en la segmentación. Como un ejemplo para que thresholding automático funciona bien, Fig. 18 (a] muestra el quantum dot-canal en particular, una rebanada. La línea azul es el esquema segmentado del núcleo celular. Hay una gran zona brillante y algunas zonas tenues. Para mostrar las tenues zonas con mayor claridad, Fig. 18 (b] se presenta la misma imagen con un no-lineal de brillo escala, correspondiente a un valor gamma [[40], p. 564] de 0,5 (en lugar de la original 1.0). Algunas agrupaciones son tenues ahora también visible, así como un fondo bastante uniforme dispersión de píxeles que no son muy negro. La técnica de segmentación se ha descrito anteriormente para el núcleo de la célula sería extremadamente difícil y largo si se aplican a los numerosos grupos de píxeles que corresponden a puntos cuánticos.

Una vez más es necesario elegir un umbral, en este caso para la selección de píxeles que se considere que forman parte de quantum dots. En la Fig. 19, diversos umbrales de 10 a 100 (en un rango de 0-255) se ilustran. Todos los píxeles cuya intensidad es mayor o igual que el umbral de nuevo de color amarillo y un poco más alentadoras.

Parece claro que un umbral de 10 es demasiado bajo y un umbral de 100 es demasiado alto. Si el grupo de píxeles por encima del núcleo se considera quantum dots, el umbral debería ser tomado como 20 o 30. Nosotros utilizamos un valor de 30.

Una vez que el umbral que se elija, cada vóxel con una intensidad de valor igual o mayor que el umbral se considerará que pertenecen a la estructura. FIE Nuestro programa incluye una función que permite a todos los voxels en o por encima del umbral que se ha marcado con sólo pulsar una tecla para toda la imagen de volumen.

5,8 tridimensionales modelo de creación y distribución
5,9 La cuantificación de los volúmenes

Una vez que la segmentación se ha hecho, es relativamente fácil de extraer información cuantitativa. Cuando una segmentación se realiza mediante la producción de contornos explícita, como en el método interactivo se ha descrito anteriormente, se adjunta el volumen puede ser fácilmente calculada cuando la superficie se realiza la triangulación, en nuestro caso por la Tr3 programa. El cálculo es que el volumen de un poliedro con caras triangulares.

Cuando la segmentación es un simple thresholding, el volumen de cálculo es sólo una cuestión de contar los seleccionados voxels.

5,10 cuantificación de las intensidades

De la Fig. 6, por ejemplo, es evidente que hay más unoxidized de lípidos oxidados. Para cuantificar este tipo de observaciones, además de contar simplemente píxeles con valores superiores a unos umbrales, FIE permite al usuario calcular la intensidad total en cada canal, es decir,

I t o t = Σ i = 0 255 n i i MathType MTEF @ @ @ 5 + 5 = @ feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacH8akY = wiFfYdH8Gipec8Eeeu0xXdbba9frFj0 = OqFfea0dXdd9vqai = hGuQ8kuc9pgc9s8qqaq = dirpe0xb9q8qiLsFr0 = vr0 = vr0dc8meaabaqaciaacaGaaeqabaqabeGadaaakeaacqWGjbqsdaWgaaWcbaGaemiDaqNaem4Ba8MaemiDaqhabeaakiabg2da9maaqahabaGaemOBa42aaSbaaSqaaiabdMgaPbqabaGccqWGPbqAaSqaaiabdMgaPjabg2da9iabicdaWaqaaiabikdaYiabiwda1iabiwda1aqdcqGHris5aaaa @ @ 4010

donde i es la intensidad, que van desde 0 a 255, y n i es el número de píxeles que tenga la intensidad i. Esto puede hacerse de una rebanada o para todas las rodajas de una sola vez, y para toda una imagen o de una región determinada de interés, como una celda individual.

Para visualizar la distribución de relativa intensidad, uno puede ver la combinación de rojo y verde los canales en la forma convencional, mediante la adición de rojos y verdes para hacer tonos de amarillo, pero esto es difícil de cuantificar. Una estrategia alternativa es para mostrar la diferencia entre el canal rojo de la intensidad y el verde de la intensidad de canal para cada píxel de la imagen, como en la Fig. 8 (b]. Los píxeles aparecen como gris cuando la intensidad diferencia es cero, como tonos de amarillo rojo cuando la intensidad es mayor que la intensidad de verde, y como tonos de azul cuando la verdad es todo lo contrario.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Autores de las contribuciones

El 3-D de software fue desarrollado por WRJF, que también escribió el texto correspondiente. Experimentos biológicos con células vivas y sus imágenes fueron realizadas por DM, que siempre confocal de imágenes 3-D de reconstrucción. En general texto sobre la pertinencia de 3-D reconstrucciones de la biología celular ha sido escrito por DM. Ambos autores asumir la plena responsabilidad por la exactitud de las declaraciones y han trabajado conjuntamente para finalizar el texto.

Material complementario
1 de ficheros adicionales
3-D modelo que se muestra en la Fig.
2
Este archivo puede ser visualizado con cualquier visor de VRML97, como se comenta en el texto.
2 ficheros adicionales
Animación de 3-D modelo que se muestra en la Fig.
2
Esta animación fue creada como una captura de pantalla de la modelo que aparece por el visor VRML Cosmo Player. La animación debería ser visible con cualquier navegador Web gráfico.
3 ficheros adicionales
3-D modelo que se muestra en la Fig.
3
4 de ficheros adicionales
Animación de 3-D modelo que se muestra en la Fig.
3
5 de ficheros adicionales
3-D modelo que se muestra en la Fig.
4
6 ficheros adicionales
3-D modelo que se muestra en la Fig.
5
(arriba).
7 ficheros adicionales
3-D modelo que se muestra en la Fig.
5
(abajo).
8 de ficheros adicionales
3-D modelo que se muestra en la Fig.
7
Agradecimientos

Reconocemos el apoyo financiero de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (MS & WRJF), Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación (Canadá) (WRJF), la diabetes juvenil Fundación de Investigaciones (DM) y Alzheimer's Disease Foundation (EE.UU.) (DM) . También damos las gracias a U. Koppe y J. Laliberté para su asistencia técnica, y J. Lauzière para la edición del manuscrito.