Endotelina-1 aumenta la expresión de genes fibrogénicos, pero no promueve la síntesis de ADN o la apoptosis en las células hepáticas stellate

Stellate células hepáticas (HSC) son responsables para el almacenamiento de retinoides y el control del flujo sanguíneo sinusoidal en hígado normal. En daño hepático, HSC es el número aumentó notablemente y se transforma en myofibroblast similares a las células, denominado activado HSC. Activado HSC producir los componentes de la matriz extracelular, metaloproteinasas de la matriz y sus inhibidores [1 - 3]. Todos ellos disminuyendo durante la resolución del tejido fibrótico.

La endotelina (ET) -1, a 21 aminoácidos de péptidos, desempeña funciones múltiples en una gran variedad de tejidos y células [4, 5]. En el hígado, ET-1 induce la constricción vascular y estimula la glucogenolisis y la síntesis de mediadores lipídicos [6, 7]. ET-1 es secretada por las células endoteliales sinusoidales y activado por HSC [8], y activado HSC que expresan un número elevado de receptores de ET [1] responder a ET-1 con la difusión y expresión de α-actina de músculo liso [8, 9] . Los receptores celulares para la ET-1 son los receptores de la endotelina A (ETAR) y el receptor de la endotelina B (ETBR) [10, 11]. La expresión de la ETAR y ETBR son diferentes entre quiescent y activado HSC o entre principios y finales activados en los estados de HSC.

ET-1 está implicado en la evolución de la fibrosis del tejido y ET-1 overexpressing ratones transgénicos desarrollar fibrosis renal [12]. ET-1 puede aumentar la síntesis de colágeno en los fibroblastos cardiacos y vasculares células musculares lisas [13, 14]. En el hígado ET-1 contribuye a la activación y HSC fibrogenesis de upregulation de colágeno tipo I la expresión de genes [15]. Anteriormente puso de manifiesto que en un modelo de rata de fibrosis biliar secundaria un antagonista selectivo ETAR redujo la acumulación de colágeno, incluso en una fase avanzada de la fibrosis [16]. Sin embargo, la función exacta de ET-1 como un modulador de HSC proliferación, la apoptosis y la matriz extracelular metabolismo sigue siendo poco clara. Por lo tanto, en el presente estudio se investigaron los efectos de ET-1, así como la ETAR y la ETBR sobre la proliferación, la apoptosis y la matriz extracelular de producción de HSC en los estados de principios y finales de activación, correspondientes a diferentes expresiones de la ETAR y ETBR .

En el paso 1 de HSC, la expresión mRNA ETAR fue significativamente más alto que el ETBR expresión mRNA (Fig. 1]. Sin embargo, el ARNm ETAR se redujo drásticamente en 4to paso HSC. Por otro lado, la expresión mRNA ETBR aumentado 1,9 veces en 4 º paso HSC. La proporción relativa de expresión ETAR a ETBR fue mayor en 1er paso HSC que en el paso 4 de HSC.

ET-1 en 1er paso HSC no afecta a la síntesis de ADN en presencia de 0,125%, 5% o el 10% de suero de ternera fetal (FCS) (Fig. 2A], o en presencia de 10 ^-6 M, de BQ123, de forma selectiva ETAR antagonista, o BQ788, un antagonista selectivo ETBR (datos no presentados). En contraste, ET-1 (10 ^-10, 10 ^-8, 10 ^-6 M) dosis-dependiente la síntesis de ADN reducido de 4 º paso HSC sólo en el 10% FCS, con la máxima inhibición (49,3%) a 10 ^-7 M ET - 1 (Fig. 2B]. Este efecto es mediado por el ETBR, desde Sarafotoxin (S6c), un agonista selectivo ETBR, la relación dosis-dependiente inhibe la síntesis del ADN (40% de inhibición a 10 ^-6 M), incluso en ausencia de ET-1 (Figura 2B]. La participación de la ETBR se confirmó cuando ET-1 (10 ^-6 M) en presencia de la ETAR antagonista BQ123 (10 ^-6 M) todavía reducida síntesis de ADN, mientras que la combinación de ET-1 y la ETBR antagonista BQ788 (10 ^-6 M) derogó el efecto inhibidor de ET-1 en suero estimulada síntesis de ADN.

Apoptosis espontánea tasa de 0,99 ± 0,08% (media ± DE, n = 6) en la 1 ª y 2,86 ± 0,52% en 4 º paso HSC (n = 6) cuando cultivadas en el 10% FCS durante 24 h. Además de ET-1 (10 ^-10, 10 ^-8, 10 ^-6 M) no alteró el nivel basal de la apoptosis (1,03%, 1,32% y 1,19%, respectivamente, en el paso 1 de HSC, y del 1,46%, 1,53% y el 1,25%, respectivamente en 4 º paso HSC). Para inducir la apoptosis significativo, las células fueron privados de suero o tratados con ligando de Fas (Tabla 1, Fig. 3A]. ET-1 (10 ^-8 M o 10 ^-6 M) no tuvo ningún efecto sobre la apoptosis inducida por privación de suero a principios y finales de paso HSC, y no rescatar a la apoptosis de las células cuando se añade una h antes de la adición de ligando de Fas (Fig . 3B]. Además simultánea de ET-1 y la ETAR y ETBR también antagonistas no alteró ligando Fas-inducida por la apoptosis tanto en 1 ª y 4 ª paso HSC.

ET-1 en concentraciones de 10 ^-8 M y 10 ^-6 M aumentó procollagen α1 (I) mRNA expresión 1,4 y 1,8 veces, respectivamente, en el paso 1 de HSC, si bien no se encontró efecto en el paso 4 de HSC (Fig. 4 ). Tejido inhibidor de metalloproteinase-1 (TIMP-1) los niveles de transcripción se mantuvo sin cambios tanto en 1 ª y 4 ª paso HSC (Fig. 4]. Sólo la ETAR antagonista, BQ123, completamente bloqueado ET-1 mayor procollagen α1 (I) mRNA expresión, mientras que el antagonista ETBR, BQ788, no tuvo ningún efecto (Fig. 5]. ET-1 (10 ^-8 M y 10 ^-6 M) aumentó la transformación del factor de crecimiento β-1 (TGF-β 1) mRNA expresión 1.2-1.3 veces en 1er paso HSC que fue bloqueada por el antagonista ETAR. Además, ET-1 (10 ^-8 M y 10 ^-6 M) upregulated metaloproteasa de matriz extracelular-2 (MMP-2) mRNA transcripciones 4 - y 6 veces, respectivamente, en el paso 1 de HSC, y tanto la ETAR y la ETBR antagonista inhibió por completo esta inducción (Fig. 6]. En 4 º paso HSC ningún efecto de ET-1 en TGF β-1 y MMP-2 mRNA expresión fue encontrado (datos no presentados). [Estos resultados muestran claramente que la ET-1 estimuló profibrogenic la expresión génica, es decir, procollagen α1 (I), TGF β-1 y MMP-2 mRNA, sólo en la 1 ª y HSC paso a través de la ETAR.]

Varios estudios han implicado ET-1 en fibrogenesis de los riñones, el sistema cardiovascular y fibrosis hepática. Sin embargo, el papel de ET-1 en fibrogenesis hepática y, en particular en HSC matriz de la apoptosis y la producción sigue siendo controvertido. Por lo tanto, hemos examinado la proliferación celular, apoptosis y el metabolismo de la matriz extracelular de ET tratados con HSC en un temprano y tardío estado de activación. Se utilizó 1 ª y 4 ª paso paso HSC como una temprana y tardía estado de activación. Nuestro estudio ha demostrado que ETAR es dominante en 1er paso HSC y ETBR es dominante en el paso 4 de HSC. Nuestros resultados coinciden con los reportados por otros investigadores [11, 20]. La progresiva activación de HSC en la cultura se asocia con cambio progresivo de un familiar predominio de la ETAR relativa a predominio de ETBR. Un predominio de ETBR se observó cuando las células ha sido objeto de completar la transición a myofibroblastic-como fenotipo. Estudio in vivo, ETBR es predominantemente expresado en tanto normal del hígado y cirrosis del hígado y overexpressed especialmente en cirrosis hepática [21, 22]. Tomados en conjunto, HSC predominantemente expresar ETAR a principios de estado, activado por varias citocinas o daño al hígado, y sobre todo expresar ETBR a finales de estado activado.

Anteriores estudios informaron el potencial mitogénica de ET-1 en coronaria células musculares lisas y fibroblastos alveolares [23, 24], y Rockey et al. [8] y Pinzani et al. [11] ha demostrado que el ET-1 estimula la síntesis de ADN a principios de HSC cultivadas en la presencia de bajas concentraciones de FCS. No hemos podido demostrar ningún efecto mitogénica de ET-1 en 1 ª y 4 ª paso HSC. Por otra parte, encontramos la inhibición de la proliferación de las células de ET-1 en 4 º paso HSC. Esta discrepancia puede explicarse por la cultura y la primaria FCS bajas concentraciones (2-5%) que los autores utilizan, mientras que nosotros usamos HSC activado después de uno o 4 pasajes que parecen miofibroblastos se asemejan a los obtenidos por derivación de explantes de hígado normal de Mallat et al. [20]. En estos myofibroblastic HSC uso de la ETBR agonista selectivo sarafotoxin (6Sc) y el antagonista selectivo ETBR (BQ788) demostraron que este efecto inhibitorio del crecimiento fue mediada por el ETBR. Nos mostró que passaging de HSC inducida por un predominio de ETBR más de la ETAR. Tomados en conjunto, llegamos a la conclusión de que ET-1 induce la inhibición de la proliferación celular a largo plazo, pero no activado principios de HSC, y que ET-1 no contribuye a fibrosis hepática, debido a la estimulación de la proliferación de HSC.

A pesar de ET-1 ha sido descrita como un factor de supervivencia para los diversos tipos de células [25, 26], su efecto sobre la apoptosis HSC no se había estudiado. El uso de suero de privación fuimos capaces de inducir la apoptosis reproducible una tasa del 40% tanto en 1 ª y 4 ª paso HSC. Además, HSC apoptosis inducida a través de la cascada de señalización de Fas. Fas se ha demostrado que se expresa en el hígado y el que se overexpressed en agudas o enfermedades crónicas del hígado [27, 28]. Por otra parte, a las movilizaciones de HSC son más susceptibles a Fas-ligando de la apoptosis inducida por quiescent HSC [19, 29 - 31]. El uso de ambos estímulos proapoptótico, ET-1 no rescate 1 ª o 4 ª HSC paso de la apoptosis.

Hemos podido demostrar que ET-1 dosis-dependiente estimulado la expresión de procollagen α1 (I) mRNA en la 1 ª, pero no en el paso 4 de HSC. Del mismo modo, ET-1 upregulated la expresión de TGF β-1, el más fuerte profibrogenic de citoquinas. Estas funciones fibrogénicos de ET-1 se inhibió de la ETAR antagonista. Nuestros resultados están de acuerdo con datos que muestran que la pronta aprobación HSC predominantemente expresar la ETAR, mientras que el 4 º paso HSC y miofibroblastos obtenidos fruto principalmente de expresar la ETBR [11, 20]. Contrariamente a nuestros resultados, Gandhi et al. [32] informó de que ET-1 estimula la síntesis de colágeno en HSC a través de la ETBR. Aunque la causa de esta diferencia es desconocida, muchos informes han demostrado que el efecto estimulante de ET-1 para procollagen síntesis en fibroblastos y músculo liso vascular celular está mediada por la ETAR [13, 14], de acuerdo con nuestros hallazgos en la actualidad HSC . Por otra parte, se podría demostrar [16] que sólo un ETAR en contraste con una sociedad mixta (ETAR y ETBR) antagonista [33] inhibe la fibrosis hepática en ratas con fibrosis secundaria biliar debido a la ligadura del conducto biliar y escisión en vivo.

El exceso de matriz extracelular las proteínas son degradadas por metaloproteinasas de la matriz (MMPs), que están reguladas por inhibidores específicos, en particular el tejido inhibidor de MMPs 1 (TIMP-1), que parece desempeñar un importante papel en profibrogenic hepática fibrogenesis [34]. No se encontraron efectos de ET-1 en TIMP-1 de expresión en la 1 ª y 4 ª paso HSC. Sin embargo, ET-1 estimula la expresión de MMP-2 mRNA en 1er paso HSC. El upregulation de MMP-2 favorece la degradación de la matriz subendothelial normal, con la consiguiente sustitución por un nonfunctional intersticial matriz extracelular, incluidos procollagen I. Asimismo, se acelera la activación de HSC y de invasión [35, 36]. Por lo tanto, ET-1 más probable promueve la matriz desfavorable volumen de negocios a través de la estimulación del colágeno 1, TGF β-1 y MMP-2.

Aunque procollagen α1 (I) o TGF β-1 de expresión fueron suprimidas sólo por la ETAR antagonista, MMP-2 expresión inducida por ET-1 se inhibió tanto por la ETAR y la ETBR antagonista. La razón de esto es aún poco clara. Se puede especular que la regulación de MMP-2 expresión puede implicar otras promotor elementos que los que estimulada por TGF-β 1. Por lo tanto, la NF κ B familia de factores de transcripción induce la expresión y la activación de MMP-2 [37]. Por otra parte, ET-1 aumenta el ADN vinculante actividad de NF κ B, a través de ETBR [38]. Por lo tanto, MMP-2 puede ser upregulated de ambos receptores ET-a través de NF κ B.

Si bien aún no es posible examinar a los que las etapas de la progresión de la fibrosis del hígado temprano y tardío paso HSC corresponden, hepática las concentraciones de ET-1 y la densidad de los receptores ET-se incrementan en humanos y experimentales de cirrosis hepática [8, 11, 32], parte de los cuales son aportados por las células endoteliales sinusoidales [39]. Curiosamente, un informe reciente ha demostrado que la TGF β-1 reduce la densidad de los receptores de ET en HSC, especialmente el de la ETBR [40]. Nuestra observación de que el paso 4 de HSC expresar más funcional ETBR que ETAR están en consonancia con las conclusiones que el paso 4 de HSC son menos sensibles a la auto-y paracrinos TGF β-1 de estimulación [41].

ET-1 estimula la expresión de procollagen α1 (I) y TGF-β 1 (a través de la ETAR) y MMP-2 (a través de ETAR y ETBR) en el paso 1 de HSC, mientras que inhibe la proliferación de HSC en las etapas finales de activación de HSC. Esto sugiere que ET-1 es profibrogenic a principios de antifibrogenic y posiblemente en las etapas finales de fibrogenesis hepática.

Cultivo celular se compraron los materiales de Biochem AG (Berlín, Alemania) o la vida de Tecnología (Karlsruhe, Alemania). ET-1, el ETBR agonista sarafotoxin S6c, la ETAR antagonista BQ123, la ETBR antagonista BQ788. Fas ligando se compraron de Alexis bioquímicos (Gruenburg, Alemania). BrdU colorimétricas la proliferación celular se realizó mediante ELISA de Roche (Mannheim, Alemania). Primers y sondas para PCR en tiempo real fueron sintetizados en MWG-Biotech AG (Ebersberg, Alemania) y Superíndice RNasa H II ^- la transcriptasa inversa fue de Tecnologías de la Vida (Karlsruhe, Alemania). Random hexamers y oligo (dT) fueron de primer Promega (Mannheim, Alemania). Otros reactivos fueron adquiridos de Sigma (Seele, Alemania).

HSC fueron aislados de ratas Wistar macho (400-500 g, de Schoenwalde, Alemania) alimentados ad libitum mediante la colagenasa-método de perfusión y se purifica en un gradiente Nycodenz tal y como se describe (17). En resumen, el hígado fue perfundido a través de la vena porta y la utilización de una vena cava inferior utilizando salida de calcio libre Hank equilibrado de solución de sal (HBSS) (Tecnología de la Vida, Karlsruhe, Alemania) mantuvo a 37 ° C, a razón de 10 ml / min para 10 min. La perfusión se continuó con HBSS que contiene 1,3 mM CaCl _2, 0,08% proteasa E, 0,05% colagenasa tipo IV y del 0,001% DNasa 1 a razón de 10 ml / min durante 30 min. La suspensión celular fue sometido a centrifugación gradiente de densidad. El HSC enriquecido fracción fue suspendido en DMEM que contengan penicilina (250 U / ml), estreptomicina (250 μ g / ml) y un 10% FCS, y sembró a una densidad de 1 × 10 ⁶ células / ml. Célula de viabilidad fue superior al 91% según lo determinado por Trypan Blue exclusión. HSC pureza, según la evaluación de contraste de fase microscopio y vitamina A autofluorescence inmediatamente después de placas, y de inmunoreactividad para desmina una semana después de placas, fue superior al 95%, con un rendimiento que van desde 1,2 × 10 ⁷ a 1,5 × 10 ⁷ HSC / rata. Las células fueron subcultured (split ratio 1:3) en DMEM con 10% FCS, penicilina (100 UI / ml), estreptomicina (100 μ g / ml) y la anfotericina B.

Se utilizó 1 ª paso HSC como un estado temprano activado º y 4 º paso HSC como un estado activado tarde.

Las células fueron chapados a 96-así los platos en una densidad de 8 × 10 ³ células / así en medio de cultivo completo. Después de 24 horas las células fueron lavadas con PBS y se colocan en DMEM con 0,125% FCS durante 48 horas. Este medio fue removido y las células fueron colocadas en fresco DMEM con 0,125%, 2% o el 10% FCS contiene ET-1 en diferentes concentraciones. Después de 48 horas de incubación con BrdU a 37 ° C, BrdU incorporado en el ADN se midió por ELISA de acuerdo con la fabricación del protocolo.

Cualquiera de privación de suero [18] o ligando de Fas [19] se utiliza para inducir la apoptosis en HSC. En suero privación apoptosis, el control se hizo con un 10% de suero. En ligando Fas-inducida por la apoptosis, el control se ha ejecutado sin ligando de Fas. No hubo control del vehículo. Por privación de suero, las células fueron chapados a 6-y platos a una densidad de 2 × 10 ⁴ / así en medio de cultivo completo. Después de 24 h las células fueron lavadas con PBS y se colocan en DMEM con 0,125% FCS contiene ET-1 en concentraciones crecientes de 72, 120 o 168 h. El medio se intercambió después de 72 o 120 h y la tasa de apoptosis medido por citometría de flujo. Para Fas ligando-inducida por la apoptosis, las células fueron sembradas en 6 platos y completa en un medio de cultivo y se coloca en DMEM con 0,125% FCS durante 24 h como antes. Después de 24 h el medio fue reemplazado por un nuevo DMEM con 0,125% FCS contiene 1 μ g / ml de Fas potenciador (mouse IgG) y 10 a 50 μ g / ml-ligando de Fas durante 24 h. Para investigar la influencia de ET-1 en ligando Fas-inducida por la apoptosis, HSC se cultivaron con el aumento de las concentraciones de ET-1 se ha descrito anteriormente.

HSC trypsinized y se centrifuga durante 10 minutos a 500 g. Las células fueron fijadas en 3 ml de 75% ethanol/25 PBS%, diluida en 10 ml de PBS y se centrifuga durante 10 minutos a 500 g. Después de la resuspensión en PBS, la digestión de ARN con RNasa A (500 μ l de 500 μ g / ml) a 37 ° C durante 30 minutos y se tiñeron con yoduro de propidio a una concentración final de 100 μ g / ml, las fases del ciclo celular se determinaron por citometría de flujo (Coulter, Epics X / XL Sistema de citometría de flujo, Krefeld, Alemania). SubG1 eventos fueron cuantificados como para correlacionar la tasa de apoptosis. Al menos 12000 eventos fueron recogidos para cada muestra analizada.

HSC se chapada a 25 cm ² platos a una densidad de 1,0 × 10 ⁵ células / plato en DMEM que contenga 10% de FCS. Después de confluencia, las células fueron lavadas con PBS y se colocan en DMEM con 0,125% FCS durante 48 horas. Posteriormente, las células fueron incubadas con ET-1 durante 48 horas en presencia de la ETAR antagonista BQ123 (10 ^-6 M) o ETBR antagonista BQ788 (10 ^-6 M).

Total RNA de HSC se extrajo utilizando el ácido fenol-guanidium método. La concentración del ARN se determinó por absorbancia a 260 nm y el ARN de calidad comprobada por electroforesis en un bromuro de etidio manchadas 1% en gel de agarosa. Total ARN transcrito fue invertir en un volumen final de 20 μ l que contenga 1 × RT buffer (500 μ M de cada dNTP, 3 mM MgCl2 75 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.3), 10 unidades de Superíndice RNasa H II ^- la transcriptasa inversa ( Gibco BRL, Life Technologies, Karlsruhe, Alemania), 1 μ l de 50 ng / μ l azar hexamers (Promega, Mannheim, Alemania), 0,5 μ l de 100 pmol / ml oligo (dT) y cartilla 1 ~ 5 μ g de RNA total. Las muestras fueron incubadas a 20 ° C durante 10 minutos, 42 ° C durante 30 min y la transcriptasa inversa se inactiva por calentamiento a 99 ° C durante 5 min y refrigeración a 5 ° C durante 5 min.

Se utilizó un termociclador Light System (Roche, Tokio) y un termociclador Light-FastStart DNA Master SYBR Green I kit para cuantificar mRNA de ETAR y ETBR. Las secuencias de nucleótidos de la ETAR y ETBR para los primers son las siguientes; ETAR (no la adhesión. NM012550) sentido:-ACCAGTCCAAAAGCCTCA-, antisentido:-TCTGCACAGGGTTAGTTCA-; ETBR (no la adhesión. NM017333) sentido:-AACTTCCGCTCCAGCAAT-, antisentido:-TCCCGAGGCTTCATTCAT - . Condiciones de PCR en tiempo real fueron las siguientes: 10 min de desnaturalización a 95 ° C, 10 s recocido a 64 o 62 ° C, s 5-9 y amplificación a 72 ° C. Cuarenta ciclos se realizaron y, a continuación, seguido por análisis de la curva de fusión para verificar la exactitud de la amplificación. Análisis de los datos se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante, utilizando luz termociclador versión del software 3.5.3.

La tecnología Taqman se utilizó para cuantificar procollagen I, TIMP-1, TGF β-1 y MMP-2 mRNA. Este método se basa en la correlación entre la abundancia de ARNm y el número de ciclos de PCR necesaria para alcanzar un umbral de detección de una sonda fluorescente en libertad durante cada repetición. Una curva estándar realizada con una serie de dilución de una muestra mostró una inclinación constante de amplificación cuando se produjeron entre 10 y 40 ciclos. En tiempo real PCR cuantitativa se realizó un análisis con un PE Applied Biosystems 7700 Detector de secuencia (Perkin-Elmer Applied Biosystems, más rápido City, CA), que es un combinado termociclador y detector de fluorescencia. Primers específicos y sondas para PCR en tiempo real fueron elegidos con la ayuda del software Primer Express (Perkin-Elmer Applied Biosystems, más rápido City, CA). Rat las secuencias de nucleótidos para los primers y sondas de hibridación fueron los siguientes; glyceraldehyde 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (no la adhesión. M17701) sentido: GCC-AAC AAG TAT GAT GAC ATC AAG-A, antisentido:-GTA GGC CAG GAT CCG CTT T-TAG, sonda:-CTC GGC CGC CTT CTG CAC-CA; procollagen I (α1) (no la adhesión. Z78279) sentido:-TTC GGC TCC TGC TCC TCT-TA, antisentido: GTA-TGC AGC CAG TGA CTT GGA TGT --, La sonda:-TTC TTG GCC ATG CAG CGT GAG-GG; TIMP-1 (no la adhesión. U06179) sentido:-TCC TGT TGC TCT TAT CAT TGA CTT-TAG, antisentido: CGC-TGG GTG AAG TAT GTC TCG AT - , Sonda: TTC TGC-AAC TCG GAC CTG GTT-AGG ATA; TGF-β 1 (no la adhesión. X52498) sentido:-AGAAGTCACCCGCGTGCTAA-, antisentido:-TCCCGAATGCTCGACGTATTGA-, la sonda:-ACCGCAACAACGCAATCTATGACAAAACCA-; MMP-2 (no la adhesión. X71466 ) Sentido:-CCGAGGACTATGACCGGGATAA-, antisentido: CTTGTTGCCCAGGAAAGTGAAG-, la sonda:-TCTGCCCCGAGACCGCTATGTCCA-.

Diez microlitros de la RT muestras se utilizó para cuantitativa de dos pasos de PCR con 5 minutos a paso de desnaturalización a 95 ° C, seguido por 40 ciclos de 15 segundos a 95 ° C y 1 min a 65 ° C en presencia de 200 Nm con interés específico e invertir los primers, 100 mM específicas fluorogenic sonda, 5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris buffer (pH 8.3), 200 μ M de cada dNTP, y 1,25 unidades de ADN polimerasa. Cada muestra fue analizada por duplicado y una curva de calibración utilizando a 2 veces la serie de dilución de un nivel de preparación de cDNA obtenido a partir de ARN total de HSC sin tratar corren en paralelo con cada análisis. Para cada muestra, los importes de procollagen α1 (I), TIMP-1, TGF β-1 y MMP-2 se divide por la cantidad de GAPDH para obtener normalizado procollagen α1 (I), TIMP-1, TGF β-1 o MMP - 2 valores.

Se realizaron análisis estadísticos con Statview versión 5 (SAS Institute Inc NC). Importancia de las diferencias se estudió con la de Mann-Whitney U test para no paramétrico de las variables. Significación estadística fue considerada cuando p <0,05.

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

MS realiza la mayoría de los experimentos y escribió el manuscrito. AK MB y ayudó a realizar experimentos. DS, EH y YM participó en el diseño del estudio y ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.