Journal of Orthopaedic Surgery and Research, 2006; 1: 7-7 (más artículos en esta revista)

Los efectos directos de la cafeína sobre el metabolismo de las células osteoblásticas: el posible efecto causal de la cafeína en la formación de la osteoporosis

BioMed Central
Yang-Hwei Tsuang (tsuang66@ms71.hinet.net) [1], Jui Sheng-Sun (jssun@ym.edu.tw) [1], Ting Li-Chen (chenlt@ha.mc.ntu.edu.tw ) [3], Samuel Chung Kai-Sun (3scs@qlink.queensu.ca) [4], San-Chi Chen (albertscchen@yahoo.com.tw) [5]
[1] Departamento de Cirugía Ortopédica, Hospital de la Ciudad de Taipei, Taipei, Taiwan, ROC
[2] Instituto de Rehabilitación de Ciencia y Tecnología, Nacional Yang-Ming University, Taipei, Taiwan, ROC
[3] HealthBanks Biotecnología Cooperación Limited, Taipei, Taiwan, ROC
[4] Departamento de Bioquímica, Queen's University, Kingston, Ontario, Canadá
[5] Departamento de Cirugía Ortopédica, Cathay General Hospital, Taipei, Taiwan, ROC

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Resumen
Fondo

El consumo de cafeína se ha informado a disminuir la densidad mineral ósea (DMO), aumentan el riesgo de fractura de cadera, y de influir negativamente en la retención de calcio. En este estudio, se investigó la influencia de la cafeína en el comportamiento de los osteoblastos.

Método

Los osteoblastos derivados de los recién nacidos-rata Wistar calvaria se utilizó en este estudio. Los efectos de varias concentraciones de cafeína en las actividades de la célula ósea se evaluó mediante el uso de ensayo MTT. Fosfatasa alcalina (ALP) tinción, tinción de von Kossa y parámetros bioquímicos incluyendo ALP, lactato deshidrogenasa (LDH), la prostaglandina E 2 (PGE 2) y proteínas totales se realizaron en el día 1, 3 y 7. La degradación de análisis de ADN bajo la influencia de cafeína También se realizó.

Resultados y discusión

Los resultados mostraron que la viabilidad de los osteoblastos, la formación de ALP tinción positiva colonias y la formación de nódulos de mineralización en los osteoblastos culturas disminuyó significativamente en presencia de 10 mM de cafeína. La LDH intracelular, ALP y 2 GPE contenido disminuido significativamente, la LDH y GPE 2 secretada en el medio aumentó de forma significativa. La activación de un compromiso irreversible de la muerte de las células de cafeína puso de manifiesto con la tinción de escalera del ADN.

Conclusión

En resumen, nuestros resultados sugieren que la cafeína tiene el potencial efecto perjudicial sobre la viabilidad de los osteoblastos, lo que puede aumentar la tasa de apoptosis de osteoblastos.

Fondo

La cafeína y los relacionados con metil xantinas se distribuyen ampliamente en las plantas en todo el mundo. Todos estable las culturas indígenas que tienen acceso a estas plantas han desarrollado productos que contengan estas bebidas estimulantes. De este modo la cafeína es probablemente el más comúnmente consumido compuestos farmacológicamente activas en el mundo, sobre todo en Europa y América del Norte. La cafeína que contienen el consumo de bebidas se ha informado de que se asocia con una reducción de la masa ósea y el aumento del riesgo de fracturas en algunos estudios observacionales. En 1982, Heaney y Recker la primera publicación mostró un efecto negativo de la cafeína en la economía de calcio [1]. Poco después, Massey y sus colegas [2] demostró que la cafeína una diuresis inducida por el aumento de la pérdida urinaria de calcio aguda. Más tarde controlados humanos equilibrio fisiológico estudios muestran una clara pero sólo un pequeño efecto depresor de la cafeína en la absorción intestinal de calcio, y ningún efecto sobre el total de las 24 h la excreción urinaria de calcio [3].

El papel de la cafeína como un factor de riesgo para la pérdida ósea es todavía controversial. El consumo de cafeína se ha informado a disminuir la densidad mineral ósea (DMO) [4], aumentan el riesgo de fractura de cadera [5], y, influir negativamente en la retención de calcio [6, 7]. Sin embargo, la mayoría de los estudios informó de que no se global asociación entre la ingesta de cafeína y la DMO, la tasa de fracturas, o el metabolismo del calcio [8 - 14]. En un estudio longitudinal sobre la interacción entre la ingesta de cafeína, los receptores de vitamina D (VDR) polimorfismo, y la densidad mineral ósea (DMO), Rapuri et al. demostrado que si la ingesta de cafeína en cantidades más de 300 mg / d (aproximadamente 514 g, o 18 oz, café) se aceleró la pérdida de hueso en la columna vertebral en mujeres posmenopáusicas de edad avanzada [15].

Hay cuatro posibles maneras de un agente puede aumentar el riesgo de fracturas y / o fragilidad del esqueleto de un anciano de personas [16]: (1) una injerencia en el proceso de remodelación ósea destinadas a la reparación de micro-fractura y / o la fatiga de los daños en estructuras óseas; (2) redujo la actividad diaria seguida por una disminución de tejido óseo en masa y el cambio en la orientación óptima de trabéculas óseas; (3) una injerencia en los reflejos posturales y / o un aumento de la caída de frecuencia, y (4) una reducción de la grasa corporal sobre prominencias óseas durante el proceso de envejecimiento. Por estas razones, la cafeína puede dar lugar a modificaciones sustanciales de la probable contribuyente a la enfermedad osteoporosis. En general, los dos primeros mecanismos son aún insuficientemente explorado para los huesos y su importancia para las fracturas osteoporóticas sigue siendo indefinido. Además, no hay reconocido los datos relativos a la cafeína y la tercera estipula mecanismos. En este estudio, se investigó la influencia de la cafeína en los osteoblastos in vitro el metabolismo. La biocompatibilidad se ha evaluado por medio de la citotoxicidad y cito-pruebas de compatibilidad. La proliferación celular, así como la expresión de algunos parámetros bioquímicos de osteoblásticas fenotipos han sido controlados, el efecto de la cafeína en los osteoblastos viabilidad se evaluó también.

Métodos
Preparación de soluciones de cafeína

El polvo de cafeína (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) se compraron y diluida en solución tampón fosfato (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.). En la primera parte de este estudio, los efectos de varias concentraciones de cafeína en las actividades de la célula ósea se evaluó mediante el uso de MTT ensayo como se describe a continuación. Siete diferentes concentraciones (100, 50, 10, 5, 1, 0,5, 0,1 mM) se realizarán las pruebas de 1 día, 3 días, 7 días y 14 días.

Osteoblástica de cultivo celular

Secuencial de la digestión del recién nacido-rata Wistar calvaria se realizó mediante la modificación de los métodos descritos anteriormente [17]. Para subcultura, las células fueron lavadas con PBS estéril seguido por el tratamiento con mezcla 1:1 de la colagenasa 0,03% y 0,05% de tripsina (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) durante 20 minutos a 37 ° C en 5% C0 2. La suspensión celular resultante fue aprobado y se centrifuga a 1500 rpm durante cinco minutos para que sedimenten las células. El sobrenadante fue removido y el precipitado volver a suspenderse en α-mínimo indispensable los medios de comunicación (α-MEM; Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) como se describe a continuación. Identificación inequívoca de las poblaciones de células como los osteoblastos es complejo y ninguno de los parámetros utilizados para definir los osteoblastos-al igual que las células son únicas a este tipos de células. La presencia de fosfatasa alcalina, un marcador temprano de los osteoblastos [18], se utiliza para evaluar la osteoblásticas el carácter aislado de las células [19].

Ensayo colorimétrico para la viabilidad celular [20]

La actividad de las mitocondrias de las células óseas después de la exposición a diversas concentraciones de cafeína se determinó mediante ensayo colorimétrico que detecta la conversión de 3 - (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro (MTT, Sigma Co, St . Louis, MO, EE.UU.) a formazan. Para el ensayo, 2,5 × 10 4 células por así fueron incubadas (5% de CO 2, 37 ° C) en presencia de diversos concentración de cafeína. Después de varios intervalos de tiempo el sobrenadante fue removido, 100 μ l por pocillo de solución MTT (1 mg / ml en medio de ensayo) se añadió y los pozos fueron incubadas a 37 ° C durante 4 h para permitir la formación de cristales de formazan. Todos los cristales se disolvieron, las placas fueron leídas en Micro Elisa lector (Emax Ciencia Corp, Sunnyvale, California, EE.UU.) en longitud de onda de 570 nm frente a una referencia de longitud de onda de 690 nm.

Diferenciación osteoblástica

Los osteoblastos cultivados en los medios de comunicación en presencia de dexametasona han demostrado ser capaces de sintetizar y mineralizantes una matriz extracelular y forma a la fosfatasa alcalina in vitro [21]. Para probar la diferenciación de los osteoblastos, una concentración de 1 × 10 5 cells/100 μ l fue agregado a 35 mm de pozos de 6 y placa. Los osteoblastos fueron incubadas a 37 ° C en 5% C0 2 para 48 horas. Después de 48 horas, los medios de comunicación se cambiaron y las células fueron incubadas en α-MEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS; Gibco BRL, Rockville, MD, EE.UU.), antibióticos (gentamicina 50 μ g / ml, penicilina G 100 μ g / ml [Gibco BRL, Rockville, MD, EE.UU.]), ácido L-ascórbico (50 μ g / ml, Gibco BRL, Rockville, MD, EE.UU.), complementados con 5 mM β-glicerofosfato (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) y 10 -8 M dexametasona (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.). El día de la evolución a medio día fue cero. Desde el día cero de la cultura, 10 mM de cafeína solución se añadió. El medio se cambió cada 3-4 días; fosfatasa alcalina (ALP) tinción, von Kossa mancha de nódulos mineralizados y los parámetros bioquímicos incluyendo la fosfatasa alcalina, lactato deshidrogenasa, la prostaglandina E 2 y el total de proteínas se realizaron en el día 1, 3 y 7.

Fosfatasa alcalina (ALP) tinción

Después de la fijación de las células, los platos se incubaron durante 30 minutos en Buffer TRIS (0,2 M, pH 8.3) con AS-MX fosfato (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) como sustrato y Fast Blue (Sigma, St Louis , MO, EE.UU.) como una mancha. El ALP células positivas teñidas de color azul / morado. Para cada experimento, un mínimo de tres platos se había contado y los experimentos se repitieron tres veces.

Von La tinción de Kossa mineralizado en la formación de nódulos

Mineralización de los nódulos en las culturas se evaluó a través de von Kossa-mancha. La matriz se lava con PBS, y culturas fueron tratados con 5% de solución de nitrato de plata de 100 μ l / pocillo en la oscuridad a 37 ° C durante 30 minutos. El exceso de solución de nitrato de plata fue completamente arrasada utilizando doble destilada H 2 O la cultura y la placa fue expuesta a carbonato de sodio / formaldehído solución para unos minutos para desarrollar color. El von Kossa-teñidas se consideraban zonas de microscopía de luz. Para cada experimento, un mínimo de tres platos se había contado y los experimentos se repitieron tres veces.

Análisis de la fosfatasa alcalina, lactato deshidrogenasa, la prostaglandina E 2 y el total de proteínas en medio de cultivo

Fosfatasa alcalina (ALP), lactato deshidrogenasa (LDH) a las actividades y puestos en libertad total de proteínas de las células en el medio se midió con un kit de ensayo disponible (ALP: Procedimiento no. ALP-10; Procedimiento No. 435, LDH: Procedimiento no. 228-UV, LDL-10, TP: Procedimiento no.690-A, Sigma Co, St Louis, MO, EE.UU.). La producción de prostaglandina E 2 (PGE 2) en medio de cultivo también se analizaron con un kit de ensayo disponible (Cayman Chemical Company, MI, EE.UU.).

Análisis de intracelular ALP, LDH, PGE 2 y proteínas totales

Al final del período experimental, ALP, LDH, PGE 2 y TP actividades se determinaron después de la lisis de las células con el detergente Triton X-100 (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.). Intracelular ALP, LDH, PGE 2 y TP valores se determinaron como los métodos descritos para las mediciones de medios de cultivo.

El análisis estadístico

Todos los datos se expresaron como media ± desviación estándar y fueron analizados por análisis de varianza. Significación estadística fue determinada por Bonferroni's t-test. Valores de probabilidad inferior a 0,05 se consideró significativo.

La degradación de análisis de ADN

Por la fragmentación del ADN, una concentración de 1 × 10 6 cells/100 μ l se añadió al disco de 90 mm. Desde el primer día de la cultura, seis diferentes concentraciones de cafeína solución (0, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0 nM) se han añadido. El medio se cambió cada 3-4 días, la fragmentación de ADN se realizaron análisis en el día 1, 3 y 7. Para el ensayo, flotantes y las células adheridas cultura de cada estado se combinaron, centrifugada, pildoradas a 400 × g durante 5 min, y lavado dos veces con PBS. El precipitado fue resuspendido en 0,2 ml de buffer de lisis [100 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0,5% de sulfato dodecyl de sodio, 0,20 mg / ml de proteinasa K, 200 μ g / ml de ribonucleasa A]. Los lisados celulares fueron incubadas a 37 ° C durante 2 h. El ADN genómico fue extraído por dos separaciones, con fenol / cloroformo y luego con cloroformo. El ADN fue precipitado luego se lavan en el 70% de etanol y resuspendido en 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) a una concentración final de 20 μ g / ml. El análisis de fragmentación de ADN se realizó con un 1,5% en gel de agarosa 1 mM EDTA, 40 mM Tris acetato (pH 7.6) para visualizar el laddering de las muestras.

Resultados
Análisis cuantitativo de células osteoblásticas

La Figura 1 muestra el efecto de diferentes concentraciones de cafeína en las células osteoblásticas viabilidad medido por el ensayo MTT. Cuando osteoblástica células cultivadas con cafeína durante un día, no hubo variación estadísticamente significativa en la formación de formazan, mientras que en los 100 mm a 1 mM concentración de cafeína, la formación de formazan disminuyó significativamente en el tercer día de la cultura (Fig. 1 ). En el 7 º día de la cultura, la disminución de osteoblastos actividades se observaron en presencia de varias concentraciones de cafeína. Hemos seleccionado los 10 mM concentración de cafeína para la ulterior estudio bioquímico los osteoblastos, porque mostró la mayor actividad durante el 3 º y 7 º período de prueba (Fig. 1].

La tinción de fosfatasa alcalina y la formación de nódulos mineralizados

En las muestras de control, los osteoblastos diferenciados como las cultivadas período aumentó. A las 3 horas, poco fosfatasa alcalina tinción positiva colonia se encontró en la cultura. La fosfatasa alcalina tinción positiva colonias apareció por primera vez en la 1 ª jornada de la cultura de los grupos de control y, a continuación, aumentó progresivamente la cultura como período pasado, y alcanzó un grado significativo en el 7 º día de la cultura (Fig. 2]. Cuando los osteoblastos cultivados con 10 mM de cafeína, la aparición de manchas de fosfatasa alcalina era probable afectados (Fig. 2]. En presencia de 10 mM de cafeína, la viabilidad de los osteoblastos y se redujo la pérdida de células residuales de su reacción a ALP mancha y resultados similares se observaron en los von Kossa-tinción (Fig. 3]. La formación de ALP tinción positiva colonias y la formación de nódulos de mineralización en la osteoblástica culturas fueron significativamente afectados por la cafeína.

Fosfatasa alcalina (ALP), lactato deshidrogenasa (LDH), prostaglandina E 2 (PGE 2) y proteínas totales (TP)

Para la cultura células óseas, intracelular de proteínas totales, ALP y LDH síntesis se aumente de forma gradual, mientras que la síntesis de PGE 2 disminuyeron durante the7 días de la cultura período (Fig. 4]. Al mismo tiempo, ALP, LDH, y la secreción de PGE 2 en medio se redujo, mientras que el total de proteínas en el medio de cultivo es relativamente constante (Fig. 4]. Después de añadir 10 mM de cafeína a los osteoblastos de cultivo celular de 3 a 7 días, la ALP contenido intracelular disminuido significativamente, mientras que el ALP secreta en la media era relativamente preservada (Fig. 4]. La LDH intracelular disminuido considerablemente y la LDH en el medio aumentó significativamente a la presencia de 10 mM de cafeína de 3 a 7 días (Fig. 4]. Tanto la PGE 2 intracelular y la PGE 2 secretada en medio disminuyó significativamente en el 3 º y 7 º día de la cultura (Fig. 4]. Al mismo tiempo, el contenido total de proteína son relativamente preservada (Fig. 4].

La degradación de análisis de ADN

La activación de un compromiso irreversible de la muerte de las células de la cafeína se demostró claramente en el análisis de la fragmentación del ADN. La formación de fragmentos de ADN se observa fácilmente cuando los osteoblastos cultivados con cafeína. Electroforesis de ADN genómico de los osteoblastos que fueron expuestos a 5,0 y 10 nM cafeína mostraron el patrón característico laddering (del tamaño de 500 - 1000 bp) que condujo a la muerte celular en el primer día de la cultura, mientras que en las concentraciones del 0,5, 1,0 o 2,5 nM cafeína, la aparición de fragmentación DAN apareció en la 3 ª jornada de la cultura con la característica laddering patrón en el tamaño de 200 - 1000 pb (Fig. 5].

Discusión

El café es uno de los que más se consumen bebidas psicoactivas en todo el mundo. Muchos investigadores han demostrado que la cafeína, uno de los principales componentes de café, tiene una variedad de celulares y farmacológicas respuestas en los sistemas biológicos [22]. Estos incluyen la estimulación del sistema nervioso central y músculo cardíaco, el aumento de la producción de orina, y la relajación del músculo liso [23]. Los efectos del café en el metabolismo óseo siguen siendo controversiales, aunque varios estudios han sugerido que la cafeína y / o pesados el consumo de café se asoció con un aumento significativo del riesgo de fractura, osteoporosis, enfermedad periodontal y [24, 25].

De hecho, varios estudios epidemiológicos han reportado la influencia de la cafeína sobre la osteoporosis, pero los efectos del café en el metabolismo óseo siguen siendo controvertidas [26, 27]. Las hipótesis para explicar estas asociaciones se han centrado en el contenido de cafeína del café [26]. De hecho, la cafeína tiene una variedad de acciones farmacológicas y las respuestas celulares en el metabolismo óseo, lo que resulta en aumento de la excreción urinaria de calcio y la inhibición in vitro sobre la proliferación osteoblástica, al igual que las células [25]. En este estudio, hemos encontrado que cuando los osteoblastos cultivados con 100 mM a 1 mM concentración de cafeína, la formación de formazan disminuyó significativamente en el tercer día de la cultura. Este efecto es aún más evidente en el 7 º día de la cultura (Fig. 1]. Corresponde a la viabilidad de los osteoblastos se redujo significativamente en presencia de 10 mM de cafeína, el intracelular y ALP LDH disminuyó significativamente el contenido y la LDH secretada en el medio aumentó significativamente (Fig. 4].

Los osteoblastos es una diferenciación en varios eventos modulado por una cascada integrada de la expresión génica. Estos acontecimientos inicialmente proliferación de apoyo, seguida de la matriz de maduración, y la mineralización ósea de la matriz extracelular [28]. Fosfatasa alcalina expresión se considera un marcador temprano de diferenciación de los osteoblastos fenotipo, mientras que el de von Kossa mancha de la formación de nódulos mineralizados representado el marcador final diferenciación de los osteoblastos. En este estudio, la diferenciación de los osteoblastos cuando se indujo β-glicerofosfato y dexametasona se añadieron en el medio de cultivo [21, 29], el grado de diferenciación como el aumento de los cultivos de período aumentó (Figs. 2 y 3] y las culturas de los osteoblastos también había detectable la deposición de calcio, como se ha visto en-von Kossa tinción de 7 días después de la confluencia de células alcanzado [30]. En presencia de 10 mM de cafeína, la viabilidad de los osteoblastos y se redujo la pérdida de células residuales de su reacción a la tinción y ALP-von Kossa tinción (Figs. 2 y 3]. La formación de ALP tinción positiva colonias y la formación de nódulos de mineralización en la osteoblástica culturas fueron significativamente afectados por la cafeína.

Las prostaglandinas producidas por los tejidos óseos tienen efectos complejos en tanto catabólicos y anabólicos actividades de células óseas [31]. Las prostaglandinas (págs) son mediadores locales que tienen diversos efectos sobre el metabolismo óseo. Ellos han demostrado para estimular la osteolisis en los huesos órgano culturas [32] y cuando administrado sistémicamente a nivel local o in vivo, debido a una mayor pérdida de hueso [33]. Por el contrario, PGs inhibe directamente la actividad celular y la resorción ósea de los osteoclastos aislados [34]. PGs estimulación de la actividad osteoclástica en el hueso intacto se cree que mediado indirectamente por la acción de otro tipo de células en el hueso, más probable es que el osteoblastos [35]. En este estudio, después de añadir 10 mM de cafeína en el medio de cultivo, tanto la PGE 2 intracelular contenido y GPE 2 secretada en medio aumentó significativamente (Fig. 4); que probablemente estrechamente correlacionados con los efectos de la cafeína en las actividades de los osteoblastos.

La apoptosis, o muerte celular programada, es un modo fisiológico de la remodelación de los tejidos durante la organogénesis y la edad adulta. El papel fisiológico de muerte celular programada (PCD) tiene por objeto la eliminación de redundante, fuera de lugar, o las células dañadas, o se activa en la defensa contra la infección o la mutación de las células, impidiendo la proliferación de un agente patógeno o enfermedad. El proceso se caracteriza por cambios morfológicos, incluyendo la condensación de la cromatina nuclear, la fragmentación de DNA, encogimiento celular, y la formación de órganos creados en virtud de apoptosis, que son sujetos a la membrana celular constituyentes [36]. En las células animales, PCD a menudo se asocia con la aparición de bioquímica específica y características morfológicas, como la condensación del núcleo y el citoplasma, la fragmentación del ADN genómico en las grandes (50 a 300 kb) y, posteriormente, los pequeños (200 bp) nucleosomal fragmentos (DNA laddering ), Y la fragmentación de la célula en la membrana de vesículas confinados (apoptosis órganos) y es esencial para el desarrollo y mantenimiento de organismos multicelulares [37]. En este estudio, la activación de un compromiso irreversible de la muerte de las células de cafeína quedó claramente demostrado cuando los osteoblastos cultivados con cafeína (Fig. 5]. Este hecho implica que la cafeína puede inducir apoptosis de osteoblastos que luego dio lugar a una disminución de células óseas viabilities. La cafeína la apoptosis inducida por los osteoblastos es probablemente uno de los principales factores en la ingestión de cafeína de la osteoporosis asociada a la medicina clínica. Sin embargo, esta hipótesis se necesita para ser validado en los nuevos estudios.

En resumen, nuestros resultados sugieren que la cafeína tiene el potencial efecto perjudicial sobre la viabilidad de los osteoblastos, lo que puede aumentar la tasa de apoptosis de osteoblastos.

Agradecimientos

Los autores sinceramente las gracias al Consejo Nacional de Ciencia (ROC) por su apoyo financiero de esta investigación y Samuel, Chung Kai-SUN para la asistencia en la experimentación y editorial de obras para la preparación de este manuscrito.