Journal of Orthopaedic Surgery and Research, 2006; 1: 9-9 (más artículos en esta revista)

Efectos de TGF-β1 y de IGF-1 en humanos la proliferación de células de núcleo pulposo en medios con diferentes concentraciones séricas

BioMed Central
Rongfeng Zhang (zhangrongfeng200@163.com) [1], Dique Ruan (ruandike@yahoo.com.cn) [1], Zhang Chao (zcmail2002@yahoo.com.cn) [1]
[1] Departamento de Cirugía Ortopédica, Hospital General de la Marina de PLA, Beijing, 100037, República Popular de China

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.

Resumen
Fondo

La baja de proliferación de viabilidad humanos núcleo pulposo (NP), las células se considera como una causa de la degeneración de los discos intervertebrales. Factores de crecimiento, como el TGF-β1 y de IGF-1, han estado implicados en la proliferación celular y la síntesis de matriz.

Objetivo

Para investigar la relación dosis-respuesta y tiempo-por supuesto efecto de la transformación del factor de crecimiento β1 (TGF-β1) y factor de crecimiento tipo insulina-1 (IGF-1) en la proliferación de las células NP.

Diseño del estudio

3 - (4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-difenil-bromuro de tetrazolio (MTT) se reduce de deshidrogenasa en las mitocondrias de las células vivas. La viabilidad proliferativa de las células corresponde a la cantidad de MTT reducido, que se mide con un inmunoensayo enzimático lector de placas. En este estudio, se evaluaron dosis-y tiempo-dependiente efectos de NP células a TGF-β1 y de IGF-1 en medios con diferentes concentraciones séricas de ensayo MTT.

Métodos

Tras el despacho del consentimiento informado, muestras de tejidos de NP se obtuvieron a partir de anteriores intervenciones quirúrgicas realizadas en los cinco donantes con escoliosis idiopática. Aisladas células fueron cultivadas en medio F12 suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB). Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos a 1 × 10 3 células /. Después de la sincronización, medio fue reemplazado por el F12 que contengan 1% o el 10% de SFB, ya sea con el único o una combinación de TGF-β1 y de IGF-1. Dosis-respuesta y tiempo-efecto luego fueron examinados por MTT ensayo.

Resultados

En presencia de un 1% de SFB, la respuesta a IGF-1 es menos llamativa, mientras que el TGF-β1 tenido un notable efecto estimulante sobre la proliferación celular. En el 10% de SFB, tanto de los dos factores de crecimiento ha estadísticamente significativas mitogénica efectos, especialmente TGF-β1. La dosis-dependiente efecto de IGF y TGF en la proliferación celular se encontró dentro de las distintas concentraciones de cada factor de crecimiento (TGF-β1 1-10 μ g / L, IGF-1 10-100 μ g / L). El transcurso del tiempo mostró un efecto significativo de elevación tres días más tarde.

Conclusión

TGF-β1 y de IGF-1 fueron eficaces para estimular la proliferación celular de las células NP humanos in vitro con una dosis-y tiempo-dependiente. Estos resultados avalan el potencial terapéutico de los dos factores de crecimiento en el tratamiento de la degeneración del disco.

Fondo

Disco intervertebral (DIV) degeneración de la columna vertebral y trastornos asociados son la fuente principal de morbilidad, lo que resulta en dolor y sustancial aumento de los costes sanitarios. El mecanismo exacto de la degeneración del disco no se entienden plenamente. El NP tejido avascular, gelatinosa y se encuentra en el centro de la DIV. Al igual que el cartílago articular, NP recibe todos los nutrientes de difusión masiva en los patrones de flujo [1]. Como resultado, NP tejido es propensa a degenerar. Una característica central de NP degeneración es la pérdida de tejido celular. Se ha sugerido que la apoptosis puede ser un acontecimiento importante que contribuye a la muerte de células en el disco [2].

Factores de crecimiento, como el TGF-β1 y de IGF-1, se ha demostrado que los condrocitos y estimular la proliferación y endotheliocytes matriz síntesis in vitro [3 - 5]. Muchos investigadores han estudiado los efectos de factores de crecimiento en las células NP, pero un gran número de ellos fueron confinados en el sentido de un solo factor en el fenotipo celular, por otra parte, el exprimential objetos eran principalmente de roedores animales [6, 7]. Para investigar el potencial terapéutico en el tratamiento de la degeneración del disco, que investigó los efectos del TGF-β1 y de IGF-1 en la proliferación de células humanas NP sola o en combinación de ensayo colorimétrico MTT. El ensayo detecta la reducción de MTT de deshidrogenasa mitocondrial a azul formazan producto, lo que refleja el normal funcionamiento de las mitocondrias y, por tanto, la proliferación celular [8]. Diferentes condiciones de cultivo fueron utilizados para evaluar la influencia de los cambios en el entorno externo de las células en su capacidad de respuesta a los factores de crecimiento. Factores de crecimiento se han añadido en el aumento de las concentraciones para el medio de cultivo para su estudio dosis-respuesta y tiempo-por supuesto efecto sobre las células NP.

Materiales y métodos
De aislamiento de células y la cultura

Protocolo para el estudio experimental fue aprobado por nuestro institucional del Comité de Examen de Investigación. DIV muestras se obtuvieron a partir de anteriores intervenciones quirúrgicas realizadas en los cinco donantes con escoliosis idiopática (3 mujeres y 2 varones, edad media, 15,4 años; rango, 11-19 años). Los especímenes fueron transportados en un tubo estéril al laboratorio inferior a 30 minutos después de cirugía eliminado. El annulus fibrosus y zona de transición se ha retirado con bisturí. El NP fue cuidadoso de tejidos separados de superior e inferior del cartílago vertebral bajo un microscopio binocular. Después de enjuagarse dos veces en Ham's / F12 (Hyclone) para eliminar los desechos residuales, NP tejido picada con un bisturí en pequeñas porciones (1-2 mm2) y digerida durante 30 minutos a 37 ° C en 0,25% trypase (Gibco), seguido por 4 horas en el 0,2% colagenasa tipo II (Gibco). El compendio fue filtrada a través de un 75 - μ m-colador de células cultivadas y en frascos T25 (Costar) a una densidad de 1 × 104 células / ml en F12 que contiene 10% de SFB (Hyclone) en un 37 ° C, 5% de CO2 ambiente . El medio se cambió cada 72 horas. Cuando las culturas mostró un 80% de confluencia, las células fueron trypsinized y una relación de separación de 1:4 se utiliza para la subcultivo. Célula de viabilidad, determinada por trypan azul (Hyclone) la exclusión, un promedio de 96% en monocapa cultura. Morfología celular cultivadas en placas de 96 pocillos se observó al microscopio todos los días a fin de observar los efectos de factores de crecimiento en las células.

Efectos de TGF-β1 y de IGF-I en la proliferación celular

Después de alcanzar el 80% confluencia, las células (paso = 2) se trypsinized y cultivadas en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10 4 / ml en F12 que contiene 10% de SFB, con 0,1 ml por pocillo. Después de 24 horas de la adhesión, el medio fue cambiado de F12 sin FBS y las células fueron cultivadas por otros 12 horas para garantizar la sincronización de las células.

Los análisis estadísticos

Norma los métodos de análisis estadísticos se realizaron mediante el sistema de SPSS11.0 para Windows. Los efectos de los diferentes grupos fueron evaluados con una forma de análisis de varianza (ANOVA) seguido de un Fisher LSD test post hoc. Signifcance se asumió cuando p <0,05.

Resultados
Efecto dosis-respuesta de los factores de crecimiento en la proliferación celular

Por debajo del 1% de SFB condición, la densidad óptica del grupo control fue de 0,085 con un menor nivel de viabilidad, tal y como se muestra en la Fig. 1. En particular, no hubo significación estadística entre la IGF-1 grupo y el grupo control. El 10 μ g / L TGF-β1 grupo mostraron un marcado incremento en la proliferación en comparación con el grupo control (96,5%).

En presencia del 10% de SFB, la densidad óptica del grupo control había una evidente elevación y llegó a 0,178, casi el doble de la densidad óptica en el 1% de SFB. La viabilidad de las células tenían un mayor altitud como consecuencia de la exposición a factores de crecimiento. Como se muestra en la Fig. 2, un importante efecto estimulante del TGF-β1 más dosis de 1.0-500.0 μ g / L en NP células, y el máximo estímulo con 10 μ g / L de la TGF-β1 alcanzó un 72,4% de aumento en comparación con el nivel medio. Los resultados también mostraron un efecto mitogénica de IGF-1 en dosis de 10.0-500 μ g / L después de 72 horas de exposición. Las células mostraban las más significativas en la proliferación de elevación a la concentración de 100 μ g / L de IGF-1 en comparación con los controles (50,6%). Dependiente de la dosis efectos de TGF-β1 y de IGF-1 en la proliferación celular se encontró entre 1-10 μ g / L y 10-100 μ g / L, respectivamente. Sin embargo, la viabilidad de células mostraron una tendencia decreciente en respuesta a más elevación de las concentraciones.

Time-supuesto efecto de los factores de crecimiento individual o en combinaciones

La densidad óptica se evaluó NP células cuando se cultivaron en el medio suplementado con factores de crecimiento en solo o en combinaciones óptimas de sus concentraciones (10 μ g / L TGF-β, 100 μ g / L de IGF-1). La proliferación de las células no mostró significent aumento en el primer día de la cultura, ya sea cuando el factor de crecimiento se añadió al medio (como se muestra en la Fig. 3]. En el medio con el 10% de SFB, la capacidad de respuesta de las células NP a los factores de crecimiento mostraron un incremento significativo en comparación con el grupo control después de 3, 5 y 7 días de la cultura. En comparación con los datos de nivel medio en los 3 días, la proliferativa percence de TGF-β1, IGF-1 y TGF-β1 + IGF-1 en la proliferación celular se calculó como 72,4% (P <0,001), 50,6% (P <0,01), y el 86% (P <0,001), respectivamente. El importe total de la proliferación de las células por los factores de crecimiento también tuvo una marcada elevación a los 5 y 7 días. La clara en función del tiempo aumentan con los factores de crecimiento en el 10% de SFB, se observó. Estimulación de TGF-β1 + IGF-1 grupo fue el máximo respectiveness a punto cada vez que entre los factores de crecimiento, que alcanzó el 71,3% (P = 0,001) y 59,3 (P <0,01) aumentar en un 5 y 7 días en comparación con el nivel medio .

Efectos de factores de crecimiento en la morfología celular

Cuando se cultivan en monocapa cultura y el nivel medio, las células humanas normales de NP fueron en forma de huso con abundante citoplasma y dos seudópodos (Fig. 8]. Por debajo del 1% de SFB condiciones, el grupo de control NP células perdido su morfología normal y una tendencia a irregulares, como evidentemente el enlongate seudópodos y la disminución de citoplasma (Fig. 4]. La morfología de las células exposición a IGF-1 no mostró notable diferencia en comparación con el grupo control (Fig. 6]. Sin embargo, las células en el 1% de SFB la exposición a TGF-β1 o TGF-β1 + IGF-1 fueron similares a las células normales NP ordinario con forma de huso (Fig. 5, 7].

La morfología de las células de exposición a factores de crecimiento había pocos cambios en comparación con el grupo control en el medio que contiene 10% de SFB en la etapa temprana cultura (<72 horas). Considerando que 72 horas más tarde, la morfología de los factores de crecimiento de tendencia de los grupos a aparecer en breve en forma de huso o multiangular forma más breve con seudópodos, citoplasma aboundant y poder refractivo más fuerte en comparación con el grupo control (Fig. 9, 10]. Las células de la exposición al TGF-β1 (10 μ g / L) + IGF (100 μ g / L) mostraron un máximo cambios en la morfología (Fig. 11]. No hay gran diferencia se observó en la morfología celular entre TGF-β1 y de IGF-1.

Discusión

En el presente estudio, hemos observado profundos cambios en la morfología celular y la proliferación en las muestras cultivadas en soporte de TGF-β1. Esto es así también el apoyo de estudios previos en la literatura. Joon et al [9] DIV humanos cultivadas en células monocapa, bolas de alginato, o "pellets", que se encuentra el aumento de síntesis de proteoglicanos 150-180%, 250-315%, 375-425% o más de sus controles, respectivamente, a las 3 semanas. Los pellets también aumentó la síntesis de colágeno tipo II en respuesta a TGF-β1. Más recientemente, Tan et al [10] encontró un aumento significativo de los proteoglicanos y la síntesis de colágeno después de la infección de anuncios / CMV-hTGF codificación de genes en el disco degenerado células, la estructura y función de las células degeneradas cambiado notablemente. Alini et al [11] observó un aumento y mantener en la densidad de las especies bovina NP células y la síntesis de proteoglicanos. Gu [12] reportaron un efecto estimulante en proteoglicanos proteína básica de la expresión génica de TGF-β1 en la reunión de alto paso dedifferential NP células. Además, los dependientes de la dosis efecto de TGF-β1 en la proliferación celular se encontró entre los rangos de concentración de 1.0-10 μ g / L, Esta gama es muy importante en el futuro aplicaciones terapéuticas del TGF-β1 en disco degeneración humana, y No se ha informado previamente.

Desde hace tiempo se aprecia que el PN de tejidos es una región de baja nutrición. En este estudio in vitro, cuando se NP células cultivadas en medio con el 1% de SFB (necesario para el mantenimiento de células basales, las células mostraron una características morfológicas de la deficiencia de nutrición. Sin embargo, la adición de TGF (10 μ g / L) en el medio dio lugar a una total recuperación de la morfología de las células para que las células normales de culto a nivel medio y un 96,5% de aumento de la proliferación celular en el grupo control. Los resultados sugieren que el TGF-β1 desempeñar un papel importante en mitogensis a bajas condiciones de nutrientes.

IGF-1 se ha informado a estimular la proliferación celular y la síntesis de matriz, mantener fenotipo de células in vitro [13]. Osada et al [14] demostraron la generación y la expresión de IGF-1 mRNA en las especies bovina NP células. El estudio mostró una autocrina y paracrina mecanismo de IGF-1 secreción, y el efecto de estímulo que la IGF-1 sobre la síntesis de proteoglicanos en bovinos DIV. Más recientemente, Gruber [15] demostraron una reducción significativa en el porcentaje de células apoptóticas disco después de la exposición a 50-500 ng / ml de IGF-1 y sugiere que el IGF-1 podría retrasar o impedir la muerte celular programada in vitro. Los resultados presentados en este informe se pone de manifiesto la respuesta a IGF-1 es menos sorprendente en un 1% de SFB, pero una marcada elevación en la proliferación celular y la dependiente de la dosis se encontró efecto entre las concentraciones de 10-100 μ g / L de IGF-1 en la presencia de un 10% de SFB. Sin embargo, una reducción de la viabilidad celular con mayor aumento de la concentración. Esta probablemente relacionado con el obligado estado de los receptores de la superficie celular. No efecto significativo en el 1% de SFB reveló que el efecto proliferativo de IGF-1 tal vez dependen de otros componentes en el suero.

Independientemente del factor de crecimiento que se añadió, no es importante la estimulación de la proliferación de este tipo se observó en el primer día de nuestros experimentos. Esta puede ser una respuesta tardía de los factores de crecimiento en la proliferación celular. El mecanismo exacto no se entienden plenamente en la actualidad.

El objetivo final del presente estudio es proporcionar la base para el desarrollo de una eficiente aplicación de factores de crecimiento en el tratamiento de la degeneración DIV. En primer lugar, el uso de factores de crecimiento de aplicación intradiscal en vivo podría ayudar a aumentar el disco proliferación de las células y estimular la matriz de producción, especialmente para las personas en la etapa temprana de la degeneración encontrado examen de resonancia magnetica [16]. Un [17] informó de que la administración intradiscal de osteogenic proteína-1 de inyección in vivo dado lugar a un aumento de la altura actual de disco a las 2, 4 y 8 semanas y un aumento de los proteoglicanos contenido del núcleo pulposo de conejo a las 2 semanas de tiempo punto. Con ello se demostró el potencial de efectos in vivo de los factores de crecimiento en el IVD degeneración de inyección directa. En segundo lugar, la ingeniería tisular y las técnicas de terapia génica podría ofrecer una liberación sostenida de los factores de crecimiento, y los resultados de este estudio podrían utilizarse en la regeneración de la pérdida de capacidad funcional de la degenerativas DIV. Sin embargo, las células de semillas siguen siendo los problemas, como fuente limitada, pequeñas cantidades y la disminución de viabilidad. Según este estudio, TGF-β1 y de IGF-1 son factores eficaces para estimular la proliferación de células de las semillas.

En resumen, los resultados demuestran la eficacia de TGF-β1 y de IGF-1 para estimular la proliferación celular y el mantenimiento de la morfología de las células humanas NP. Existen una gama óptima de estimulación de células, y un efecto sinérgico se observó cuando dos factores de crecimiento se aplicaron al mismo tiempo. Estos resultados proporcionan información útil para su posible aplicación clínica en el futuro. Sin embargo, otros estudios como los efectos de factores de crecimiento en los tejidos degenerativa del disco en vivo, y la entrega de la compañía aérea factores de crecimiento debe realizarse en pequeños y grandes animales.

Abreviaturas

MTT = metilo thiazolyl tetrazolio; TGF-β1 = transformación del factor de crecimiento β1; IGF-1 = factor de crecimiento tipo insulina-1; NP = núcleo pulposo; FBS = suero bovino fetal; DIV = disco intervertebral.

Conflicto de intereses

nacional de ciencias naturales fondos se recibieron en apoyo de esta labor. No hay beneficios en cualquiera de sus formas han sido o serán recibidos de una parte comercial, relacionados directa o indirectamente con el objeto de este informe.

Autores de las contribuciones

RF Zhang llevó a cabo el cultivo de células y ensayo MTT, participó en la adquisición de datos y redactó el manuscrito. Z. Chao participó en el diseño del estudio y se lleva a cabo el análisis estadístico. DK Ruan concebido del estudio, participaron en su diseño y revisó el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores se agradecen a Xiaohang Zhao y Zhou Lijun de la central de la marina laborary hospital general para su asistencia técnica de expertos.