Neural Development, 2006; 1: 2-2 (más artículos en esta revista)

Polarización y orientación de las células ganglionares de la retina en vivo

BioMed Central
R Flavio Zolessi (fzolessi@fcien.edu.uy) [1], Lucía Poggi (lp255@cam.ac.uk) [1], Christopher Wilkinson, J (cjw29@mole.bio.cam.ac.uk) [1] , Chi-Bin Chien (chi-bin.chien @ neuro.utah.edu) [3], A William Harris (harris@mole.bio.cam.ac.uk) [1]
[1] Departamento de Fisiología, Desarrollo y Neurociencia de la Universidad de Cambridge, Cambridge, UK
[2] Sección Biología Celular, Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay
[3] Departamento de Anatomía y Neurobiología de la Universidad de Utah School of Medicine, Salt Lake City, UT, EE.UU.

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Resumen

En ausencia de señales externas, las neuronas in vitro polarizar mediante el uso de mecanismos intrínsecos. Por ejemplo, las neuronas del hipocampo en cultivo ampliar arbitrariamente orientadas neurites y luego uno de ellos, generalmente la más cercana el centrosoma, empieza a crecer más rápidamente que los demás. Este neurite se convierte en el axón, ya que acumula los componentes moleculares de la junctional complejo apical. Todos los demás neurites convertirse en dendritas. No está claro, sin embargo, si las neuronas in vivo, que diferenciar dentro de un epitelio polarizado, romper la simetría utilizando mecanismos similares intrínseco. Para investigar esto, el uso de cuatro dimensiones mediante microscopía de desarrollo de las células ganglionares de la retina (CGR) en embriones de pez cebra en vivo. Nos parece que la situación es muy diferente en vivo, donde los axones emerge directamente de manera uniforme polarizado células en ausencia de otros neurites. In vivo, por otra parte, los componentes del complejo apical no localizar a las nuevas axón, ni predecir el centrosoma el lugar de aparición axón. Mosaico análisis en cuatro dimensiones, utilizando mutantes en los que neuroepitelial polaridad se vea perturbado, indica que factores extrínsecos tales como el acceso a la lámina basal son fundamentales para el normal axón aparición de CGR en vivo.

Introducción

Un paso clave en la morfogénesis neuronal es la aparición de correctamente orientada hacia las dendritas y los axones. Los mecanismos celulares y moleculares que determinan cómo se neurite es seleccionado para convertirse en el axón, mientras que los otros se dendritas se han estudiado extensamente en las condiciones que este problema es más accesible experimentalmente, es decir, in vitro [1]. Si las células del hipocampo son cultivadas poco después de su final mitótico divisiones, múltiples neurites surgir simultáneamente en las orientaciones aparentemente al azar. A partir de estas neuronas jóvenes multipolar, uno neurite entonces empieza a alargar preferentemente, que marca el comienzo de la polarización. Se convierte en el axón [2], y, como crece inhibe la otra neurites de convertirse en los axones. Se convierten en lugar dendritas. El inhibidor de señal se basa en las actividades de las pequeñas GTPasas Rho Rac/Cdc42 y [3, 4], y localizada en la inactivación de GSK-3 β [5, 6]. Las proteínas que normalmente se asocian con los complejos junctional apical de las células epiteliales, como el Par-3, Par-6 y atípica la proteína quinasa C (aPKC) tienen un papel en la polarización in vitro. Ayudado por la poliposis adenomatosa coli y KIF3A (a kinesin superfamilia de proteínas), las proteínas que viajan a lo largo de microtúbulos, apical estos componentes se acumulan en las puntas de crecimiento axones. La interferencia con la actividad de cualquiera de estas proteínas compromisos polarización [7 - 9]. El centrosoma, actuando como centro de organización de microtúbulos, también tiene un papel en la formación axonal in vitro [10], y las pruebas recientes sugieren que su posición determina el lugar del axón de emergencia [11].

En disociarse cultivos celulares, las neuronas se desarrollan en la presencia de muy escasos señales externas, por lo que forzosamente debe romper la simetría intrínsecamente. In vivo, sin embargo, las neuronas se generan dentro de un muy orientado en tres dimensiones neuroepithelium. En tal situación, la diferenciación de las neuronas puede depender de pistas externas para la polarización. En apoyo de esta idea, Rolls y Doe [12] demuestra que, en Drosophila mutante que carecen de los componentes apical cruce Par-3, Par-6 o aPKC, en las neuronas del sistema nervioso central in vivo, sin embargo, son adecuadamente orientadas. Este estudio plantea dos cuestiones importantes. En primer lugar, están las diferencias en estos resultados debido a las diferencias entre vertebrados e invertebrados o son debido a las diferencias entre la situación in vitro e in vivo que? En segundo lugar, si extrínseca señales polarizar las neuronas in vivo, cómo se hace de tal manera que las neuronas se adecuadamente orientadas?

Células ganglionares de la retina (CGR) son un excelente sistema modelo con el que para estudiar las preguntas anteriores. Limitado a una capa adyacente al interior de la membrana basal, CGR show "típico" de polaridad neuronal, axones, basales y orientado apically orientado dendríticas árboles. Hace más de un siglo, Ramón y Cajal hizo observaciones de la retina de embriones de pollo y llamó la diferenciación 'CGR "con morfologías bipolar, incluido un proceso de retracción apical y un axón se extiende desde la parte basal [13]. En consonancia con esto, y Hinds Hinds [14], en su serie de estudios microscópicos de electrones de la retina en desarrollo de ratón, sugirió que los axones de las CGR se derivan de la basal proceso de neuroepitelial-como precursores. Mediante la inyección de Lucifer amarillo CGR en la diferenciación de embriones en Xenopus, Holt [15] demostró que los axones de CGR, casi siempre surgen a partir de la basal polo de la célula. Halfter y Schurer [16] encontró que los trastornos de la membrana basal interior de la retina de pollo en desarrollo llevado a aberrantes RGC axón resultado. En conjunto, estos estudios sugieren una relación entre el axón de orientación para diferenciar CGR y la superficie basal de la neuroepithelium. Sin embargo, en todos estos estudios fueron las imágenes estáticas y los análisis depende de las células que ya han asumido los inicios de la morfología RGC, incluyendo la formación de un axón primordial. Para entender lo que está pasando cuando las neuronas primero polarizar, es esencial para poder seguir solo las células de su final mitosis para el momento en que ampliar de manera definitiva axón. Sólo a través de esos estudios es posible aprender, por ejemplo, diferenciar si la CGR en vivo a través de una primera etapa multipolar en el que poner a cabo varias neurites exploratoria antes de que la estabilización de uno como el axón.

En el pez cebra, mediante el uso de los transgenes que impulsan las proteínas fluorescentes bajo el control de un potenciador de promotor de la ath5 gen (atoh7) y cuatro dimensiones (4D) de microscopía, es posible ver a la diferenciación de la CGR en vivo de su mitosis final a la superficie apical, a través de la puesta en marcha de su axonal y dendrítica procesos [17]. Hemos tomado ventaja de estas innovaciones para demostrar que CGR enviar axones directamente de su superficie basal en ausencia de otros neurites que salen de la célula. Seguimiento de los movimientos de diferentes marcadores apical, como junctional complejas o centrosomal proteínas, en estos transgénicos retinas reveló que estos componentes permanecen en el proceso de retracción apical, mientras que el axón se extiende desde el frente (basal) polo de la diferenciación de las células de cuerpo el Real Gobierno de Camboya.

Para buscar señales extrínsecas a polarizar CGR in vivo, hemos utilizado dos mutantes en los que la polaridad de la retina se vea perturbado neuroepithelium: nagie oko (NOK) y el corazón y el alma (ha) [18]. 4D análisis detallado de tipo silvestre CGR en entornos mutantes demuestran que la polarización y la orientación de la CGR está determinada por la orientación local de la neuroepithelium, incluidos factores tales como la presencia de una lámina basal. CGR no tienen acceso ni al interior o exterior lámina basal durante su diferenciación ir multipolar a través de una fase que precede a la polarización, como lo hacen in vitro. Nuestros resultados proporcionan pruebas sólidas para una extrínseca RGC influencia en la polarización.

Materiales y métodos
Animales

Pez cebra se han mantenido y criado a 26,5 ° C, y los embriones se plantearon a 28,5 ° C. El mutante líneas utilizadas fueron: nagie oko (NOK 227 m, una especie de regalo Dr Jarema Malicki) y el corazón y el alma (tiene 567 m, una especie de regalo de Abdelilah el Dr Salim-Seyfried). Ambos representan null alelos de los respectivos genes. Dos líneas transgénicas se han generado en nuestro laboratorio: Tg (pBatoh7: gap43-GFP) cb 1 ( 'ath5: diferencia-gfp') y Tg (pBatoh7: gap43-RFP) cb 2 ( 'ath5: diferencia-RFP "). Ellos expresan una proteína fluorescente (aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) monómeras o proteína fluorescente de color rojo 1 (mRFP1), respectivamente) fundido a la GAP43 N-terminal palmitoylation señal, bajo el control del pez cebra ath5 promotor (que comprende 7 kilobases de secuencia genómica aguas arriba del inicio ath5 codón). Para algunos experimentos se utilizó una línea transgénica que expresa la forma citoplásmica de EGFP bajo el control del promotor ath5 ( 'ath5: GFP ", una especie de regalo Dr Ichiro masai) [19]. El ath5: diferencia-gfp transgénicos línea se cruzaron con los transportistas de ambas mutaciones utilizados, para generar una generación F 1 a partir de la cual los embriones mutantes expresar GAP-EGFP en CGR se puede obtener, es decir, NOK 227 m × Tg (pBatoh7: gap43-GFP) cb 1 y tiene 567 m × Tg (pBatoh7: gap43-GFP) cb 1.

Construye, de expresión de proteínas exógenas y morpholino tratamiento de embriones

Construye utilizado para inyectar en que viven los embriones fueron los siguientes: ath5: diferencia-GFP, ath5: diferencia de RFP, GFP-zcentrin y Par3-GFP [20]. Para generar el ath5: diferencia-gfp y ath5: diferencia-RFP vectores de expresión, un fragmento que contiene 7 kilobases de los 5 'de reglamentación región del pez cebra ath5 gen [19], ha sido subcloned río arriba para cualquiera de las BPA-GAP o EGFP-mRFP codificación de las regiones [21]. El promotor y la región de codificación se subcloned en la IsceI pBSII SK + vector, amablemente prestada por el Dr Jochen Wittbrodt [22]. Para la GFP-zcentrin construir, pCJW263 es un pCS2 + basados en el plásmido en el que centrin pez cebra se suman a los de estructura, 3 'a EGFP. Se creó en los siguientes pasos. El sitio Sal I + de pCS2P fue retirado luego de la digestión relleno con Klenow enzima y religation. Este plásmido fue cortado con Bam HI, el 5 'domina llenado con la enzima Klenow y luego cortar de nuevo con Xba I. Este fragmento se ligated con la AFE I-Xba I fragmento de pEGFP-C2 (Clontech, Mountain View, CA, EE.UU.) que contiene la codificación EGFP región y múltiples sitios de clonación para crear el vector pCS2P + EGFPN. Pez cebra centrin fue amplificado por PCR utilizando IMAGEN 5899515 clon como plantilla y estas primers: 5'-TTGGATCCTCATGGCGTCCGGCTTCAGGAAAAGC-3 '(avance) y 5'-TTCTCGAGGTACAGATTGGTTTTCTTCATAATCCG-3' (al revés). El producto de PCR fue digerido con BGL II y Xho Iy ligated con BGL-II y I-Sal corte pCS2P + EGFPN. GFP-zcentrin ARNm se transcribe a partir de la SP6 promotor de pCJW263, con linearized No I, utilizando la máquina mMessage transcripción in vitro kit (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). ARN fue purificado con la purificación del ARN RNeasy kit (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania).

Por la expresión transitoria de proteínas fluorescentes, los embriones fueron inoculados con el plásmido conteniendo ya sea el gen de interés, bajo el control de un general (citomegalovirus) promotor o el Real Gobierno de Camboya progenitoras específicos (ath5) promotor, o con el ARNm transcrito in vitro. Inyecciones de ADN se realizaron en la celda en la celda de una etapa, mientras que el ARNm inyecciones se realizaron en la yema de huevo en la celda de una a cuatro células, utilizando un micromanipulador montados y una micropipeta Picospritzer microinjector. El volumen máximo de inyección fueron del 2,5 nl en la célula y el 5 de nl en la yema. Para el promotor ath5 impulsado por las construcciones, los plásmidos fueron inyectados junto con meganuclease I-CPE-I en una concentración de 10 ng / μ l en una sola célula de embriones de etapa, tal como se describe [22]. Para estable la transgénesis, los embriones que expresa la proteína fluorescente en la ubicación correcta fueron seleccionados y criados para la madurez sexual; transgénicos portadores fueron identificados por outcrossing a la naturaleza tipo de pescado.

Morpholinos diluido en agua se inyecta en la yema de huevo en la celda de una a ocho células. Morpholinos utilizados fueron los siguientes: anti-Nok, la traducción de bloqueo (MORPH1116, Open Biosystems); anti-slit1b, la traducción de bloqueo (LDHMO2, 5'-GCTCGGTGTCCGGCATCTCCAAAAG-3 ', diseñado por L Hutson y C-AC) y anti-slit1a, empalme de bloqueo (S1ASDMO1, 5'-GAAATAAACTCACAGCCTCTCGGTG-3 ', diseñado por M Hardy y C-BC). La cantidad ideal para ser inyectada se determinó mediante el análisis de una serie de concentraciones. Encontramos, por la Slit1b morpholino, diferentes respuestas a diferentes orígenes genéticos, pero estos se corrigieron para el ajuste de la cantidad inyectada, por lo que en el mismo reproducible fenotipos. Para el análisis de los datos se tomaron en cuenta sólo los embriones que habían recibido la misma cantidad relativa de morpholino (es decir, 2 a 3 ng para los ath5: diferencia-gfp línea y 6 a 8 ng para los ath5: diferencia RFP-line) que no causa efectos evidentes en la supervivencia celular.

De imágenes en vivo de todo montado en embriones

Embrión y procesamiento de imágenes 4D se realizaron como se describe anteriormente [17]. Por lo general, se acumula alrededor de 100 μ m de espesor, compuesto de secciones separadas por 1 μ m, se tomaron cada 5 a 10 minutos durante un período medio de 20 a 24 horas. Para evitar dañar los embriones, hemos mantenido el poder del láser a un mínimo (normalmente 12 a 20%). El 4D datos así obtenidos fueron procesados y analizados con Volocity (Improvisación, Coventry, Reino Unido). A menos que se indique lo contrario en la figura de leyendas, las imágenes mostradas son de máxima intensidad de las proyecciones de la totalidad o la mayor parte de la pila confocal. Cuantificaciones se describe en el texto se realiza mediante Volocity, Openlab (Improvisación, Coventry, Reino Unido) o ImageJ (Institutos Nacionales de Salud) de software.

In situ inmunoticción, neuronal retrógrada etiquetado y microscopía electrónica de transmisión

Cryosections se realizaron a 10 μ m de espesor de 4% de paraformaldehído-fijo, montado OCT-embriones de pez cebra. El bloqueo fue durante 30 minutos a 20 a 23 ° C, en el 10% inactivado por calor suero de cabra (HIGS), el 1% de albúmina sérica bovina, 0,2% Tritón X-100 en PBS. La enseñanza primaria y secundaria de anticuerpos fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente, se diluye como se describe a continuación. Para todo el montaje inmunoticción, los embriones (crecido en 0,003% phenylthiourea) se fijaron la noche a la mañana a 4% paraformaldehido en PBS, y todos los lavados se realizaron en PBS que contenía 0,2% Tritón X-100. Además se logró permeabilización de la incubación a los embriones en el 0,25% de tripsina-EDTA a Hanks equilibrada solución de sal de 15 a 25 minutos a 0 ° C. El bloqueo y la dilución de anticuerpos fue el de las secciones. Los anticuerpos fueron incubadas durante al menos 36 horas a 4 ° C, con agitación ocasional.

Los anticuerpos primarios, diluido en la solución de bloqueo, fueron los siguientes: Zn-5, 1 / 100 a 1 / 500 de dilución (MAB anti-Ben/DM-GRASP, específico para la CGR en la diferenciación neural retina; Zebrafish International Resource Center ( ZIRC), Eugene, Oregón, EE.UU.; Zpr-2, 1 / 100 de dilución (MAB específicas para el epitelio pigmentario (RPE); ZIRC); anti-laminina 1, 1 / 60 de dilución (poli-clonal de anticuerpos (PAB), L9393 ; Sigma, St Louis, MO, EE.UU.); anti-Tau 1, 1 / 500 de dilución (PAB; Dr Itzhak Fischer); anti-aPKC-ζ, 1 / 250 a 1 / 500 de dilución (PAB; New England Biolabs, Hitchin , Reino Unido) y anti-α-catenina, 1 / 2000 de dilución (PAB, Sigma). Anticuerpos secundarios utilizados fueron de cabra anti-IgG de ratón y de cabra anti-conejo IgG Cy3-conjugado (Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.), cabra anti-IgG de ratón y de cabra anti-conejo IgG Alexa 488-conjugado (1 / 1000 a 1 / 2000 de dilución; Molecular Probes, Eugene, Oregón, EE.UU.). Cuando sea necesario, phalloidin-Texas Red (sondas moleculares) se mezcla con la secundaria anticuerpos. núcleos se counterstained con 4 ',6-diamidino-2-phenylindole. retrógrada Para el etiquetado de CGR, micro-inyectado pequeñas cantidades de 1,1'-dioctadecyl-3, 3,3 ', 3'-tetra-methylindocarbocyanine perclorato (DiI; Molecular Probes) diluido en cloroformo, a la derecha tectum fijo de los embriones de pez cebra 79 horas después de la fecundación (HPF). Después de un período variable de incubación (temperatura ambiente o 4 ° C), los embriones fueron counterstained y procesado de imágenes de confocal.

Fotomicrografía se realizó con un sistema de láser confocal, tal como se describe o Nikon con microscopios de fluorescencia, equipado con enfriado dispositivo acoplado por carga (CCD) Hamamatsu Orca cámaras y automatizado z-fluorescencia conducir y persianas. Adquisición de z-pilas de deconvolución y se realizaron con Openlab software.

Por microscopía electrónica de transmisión, los embriones fueron disecados rápidamente y fija durante 4 horas a 4 ° C en un 4% glutaraldehyde/0.3% H 2 O 2, en un tampón fosfato isotónica.

Después de ser procesadas para microscopía electrónica de transmisión con el uso de procedimientos estándar, ultrathin secciones fueron imágenes en un FEI-Philips CM100 sistema.

Desprendimiento de retina de cultivo celular y el trasplante de blastomere

Ojos extrajeron embriones de pez cebra justo antes o en torno a la aparición de la CGR, la diferenciación (25 a 28 HPF) se disocian con tripsina-EDTA a 28,5 ° C, y las células fueron sembradas a una densidad de ocho ojos en el plato por 13 mm de fondo cubreobjetos platos cubierto con laminina. Después de la incubación durante 1 hora a 200 μ l de L15 medio que contiene 10% FCS, 3 a 4 ml de L15 complementado con N-2 (Invitrogen, Paisley, Renfrewshire, Reino Unido) se añadió. Las células fueron entonces mantenerse a 28,5 ° C hasta que se precise o se utiliza inmediatamente para time-lapse análisis. De las Culturas ha mutantes (y sus parientes en estado natural de tipo controles) se hicieron de 30 a 32 HPF embriones, como la diferenciación celular parece ser demorado en los mutantes. Time-lapse estudios de cultivos de células de la retina se llevaron a cabo en una Nikon TE300 invertido microscopio de fluorescencia, equipado con un Hamamatsu Orca AG enfriado CCD cámara digital y automatizado z-conducir y persianas. Para la adquisición de datos y el análisis se utilizó el software Openlab, teniendo un montón de imágenes (1 μ m pasos) cada 10 a 20 minutos.

Por inmunoticción, las células fueron fijadas mediante la adición al medio de cultivo en una cantidad igual de paraformaldehído al 4%, 15% de sacarosa × 1 en PBS, durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de ser lavados, las células fueron permeabilized con 0,1% Triton X-100 en PBS, y inmunoticción y fotomicrografía se realizaron según lo descrito para cryosections.

Con el objetivo de generar mosaico genético de embriones, trasplantado de 10 a 40 Blastómeros de la etiqueta de embriones (que expresa ath5: diferencia-gfp transgen y / o inyectados con dextrano-rodamina o H2B-YFP ARNm (YFP se proteína fluorescente de color amarillo) para obtener un general etiquetado) en los polos de animales sin etiqueta blastulas. En breve, los embriones fueron incorporados en metilcelulosa 2% en un cubreobjetos, y por lo general se transfirieron las células de un donante a un máximo de seis huéspedes con una micropipeta de vidrio, tal como se describe [23]. Los embriones fueron incubadas como de costumbre, el mantenimiento de los donantes al margen cuando sea necesario para identificar los mutantes morfológicamente.

Resultados
Pez cebra células ganglionares de la retina polarizar intrínsecamente in vitro

Para determinar si CGR pez cebra, al igual que las neuronas del hipocampo de mamíferos, tienen la capacidad de polarizar intrínsecamente, las células explantadas disociarse del 26 al 28 HPF retinas de pez cebra transgénico que expresa en CGR EGFP bajo el control de la CGR, precursores específicos de ath5 promotor. Time-lapse análisis de estas células reveló etapas iniciales de polarización que, aunque mucho más rápido, son fundamentalmente similares a las descritas para las células del hipocampo de ratas [2] (Figura 1a, b]. Inmediatamente después de explantation, ath5: GFP-positivas las células son redondas y muestran una intensa actividad en la superficie en forma de pseudopodia corto y filopodios. En algunos casos, un rápido movimiento circular de pseudopodia, conocido como 'los movimientos de circo "[24], fue visto. Esta "fase 1" dura alrededor de 7 horas (Figura 1b]. "Fase 2" es más corto (que dura aproximadamente 4 horas) y se caracteriza por la aparición de varios cortometrajes neurites que alternativamente se retracte y alargados, de modo que las células en la fase 2 a menudo tienen dos o más neurites al mismo tiempo. De repente, y que marca el inicio de la «fase 3 ', uno neurite muestra un crecimiento notable de cono y comienza a crecer más rápido (Figura 1 bis y archivo adicional 1]. En 24 horas, la mayor parte de la CGR aparecen unipolar (Figura 1c]. 'Stage 4' suele ser visible desde el segundo día de la cultura (Figura 1c] en CGR con un largo Tau-1-positivas como axón-neurite y unos pocos, Tau-1-negativos neurites ramificación en el polo opuesto de la célula cuerpo (Figura 1d, e]. Nuestra siguiente pregunta era si podríamos observar un proceso similar en vivo.

Polarización de las células ganglionares de la retina en vivo es diferente del que in vitro

Mediante el uso de una membrana plasmática orientada de forma EGFP bajo el control del promotor ath5 (ath5: diferencia-GFP), fuimos capaces de seguir, utilizando 4D-microscopía, la diferenciación de CGR en vivo (que se resumen en la figura 2a]. La proliferación de células precursoras normalmente abarcan el ancho de la retina neuroepithelium. Poco después de su última división celular (I) la célula RGC órganos de precursores hacia la parte basal de la neuroepithelium de translocating sus núcleos basales a lo largo de un proceso que sigue, ya sea a través de la citocinesis o se extiende inmediatamente después (II). Entonces el proceso apical, que se mantiene en contacto con la superficie apical en todo neuroepitelial proliferación, detaches y comienza a retirar (III a IV; Figura 2b y archivo adicional 2]. En cada diferenciar RGC analizados (un total de 65 células de 13 embriones diferentes), la primera neurite formas en la superficie basal de la neuroepithelium, en las proximidades de la retina membrana limitante interna o lámina basal, e inmediatamente la diferencia como un axón, formando un cono de crecimiento (IV a VI). En estos estudios in vivo, se define el axón como neurite que crece en el vítreo superficie de la retina y se dirige hacia la salida del nervio óptico. Ningún otro transitoria neurites se observaron a surgir en cualquiera de los casos observados. Justo antes de axón aparición, las células muestran muy dinámicas filopodios en su polo basal (IV) (Figura 2b, c, véase también la figura 6b abajo), a menudo sesgadas hacia el lugar de la salida del nervio óptico (figura 2c]. Así, a diferencia de la situación in vitro, no hay pruebas de que no orientado (etapa 1) o multipolar (etapa 2) etapas en la polarización de la CGR en vivo. Por el contrario, axón aparición es rápida, reproducible orientado, y ocurre antes de la formación de cualquier otro neurites.

Anterior 4D de imágenes revela que dividir neuroepitelial células en la retina de pez cebra suele mantener un proceso basal en contacto con la superficie interna de la neuroepithelium [21]. Electron estudios microscópicos de Hinds Hinds y [14] de la CGR en la diferenciación de la retina del ratón sugiere que los axones de las CGR se derivan de tales procesos basal. Sin directa time-lapse observaciones, sin embargo, no fue posible para estos autores para descartar la posibilidad de que los procesos basal de tales células se retracte antes de salir de sus axones. Por lo tanto, aprovechó la oportunidad que ofrecen las imágenes 4D a volver a examinar esta cuestión. Hasta hace unos 40 HPF, el crecimiento conos forma en la punta de la ampliación del proceso basal en aproximadamente la mitad de la CGR examinados (Figura 2b, d]. En la otra mitad, en particular las adyacentes a la membrana limitante interna de la neuroepithelium, el axón emerge sin un proceso visible basal (Figura 2b, b, d, véase también la figura 6b a continuación para otro ejemplo). Después de 40 HPF, casi todos los CGR forma sus axones de un proceso basal (Figura 2d]. Estos resultados confirman la interpretación de Hinds Hinds y [14], sino demostrar que, en las primeras etapas, RGC axones no tiene por qué salir de un largo proceso basal.

AXON resultado por lo general precede y es independiente de retracción apical

Después de observar la dinámica de la CGR en axonogenesis in vivo, se pregunta si la formación del axón en CGR podría estar relacionada con la retracción del proceso apical. Para probar esto, la diferenciación de seguimiento CGR en el que el proceso apical fue claramente visible. Como se muestra en la Figura 2e, en la mayoría de diferenciar la CGR (37 de 44 células, a partir del 12 de diferentes embriones), el axón de hecho, comienzan a crecer después del inicio de la retracción del proceso apical, con una mediana de retraso de aproximadamente 1 horas (29 de los 44 células presentan un retraso de entre 0 y 2 horas). El tiempo entre el inicio y la terminación de la retracción apical (como promedio de 23 celdas en las que hemos podido seguir retracción total) fue de 4,0 ± 2,3 horas (media ± desviación estándar), con una importante variabilidad en el curso temporal de la retracción ( Figura 3]. Así, en la mayoría CGR, el axón surge después de la aparición de retracción apical, pero antes de su finalización. En casi la mitad de los casos, los procesos apical o incluso dejar de volver a prorrogar por una distancia corta (5 a 10 μ m) en diferentes momentos durante la retracción. También hay menor frecuencia (1 a 4 μ m) atrás y adelante oscilaciones del proceso apical antes de retracción es completa (Figuras 3 y 4 bis]. Figura 4a es un conjunto de vídeo poco espaciados regularmente a partir de la retracción apical de las células se muestra en la Figura 2b y archivo adicional 2.

Colapso proteínas se han propuesto como mediadores importantes de orientación axón neuronal y la migración [25], y Slit1b ARNm se expresa en el desarrollo de la capa nuclear interna de la retina [26]. Curiosamente, los mutantes de ratón para mostrar Slit2 ocasionales anormal presentan trayectorias (L Erskine, comunicación personal). Por lo tanto, algunos seleccionados Slit morphants (Figura 5] en el caso de los defectos RGC polarización. Inesperadamente, encontramos que los embriones tratados con Slit1b morpholino muestran un importante retraso en la retracción del proceso apical y la migración del núcleo basal para el lado de la retina (Figura 4b]. Sólo unas pocas células (6 de 32) en estos morphants ampliar sus axones después de la apertura apical proceso de retracción, y en estos casos, la demora media es más corta que en los controles (0,98 ± 0,35 horas frente a 1,68 ± 1,4 horas, media ± SD ). En la mayoría de las células examinadas (26 de 32), axonogenesis comienza antes del inicio del proceso de retracción apical en estos morphants (Figura 4c y archivo adicional 3]. Este efecto inesperado de la Slit1b morpholino tuvo el fortuito beneficio de lo que evidente que la retracción del proceso apical no es esencial para el resultado orientado axón.

El efecto de la Slit1b morpholino a la polarización parece temporal. El Real Gobierno de Camboya de anticuerpos específicos-Zn-5 puso de manifiesto que en el morphants, CGR eventualmente hacer apical retractarse de sus procesos y la forma normal de las células ganglionares de capa, aunque lo hacen mucho más tarde que sus parientes en estado natural de tipo homólogos (Figura 4d-f].

Durante axonogenesis, siguen siendo componentes apical apical

Los resultados descritos anteriormente muestran que no existe una relación temporal obligatoria entre la retracción del proceso apical y la aparición de axón resultado y que el axón, incluso de tipo silvestre CGR, casi siempre antes de las formas apical proceso completo se retrae. Este proceso de retracción apical es un vestigio del compartimento apical de la neuroepitelial progenitoras. Los estudios in vitro han demostrado que las moléculas normalmente se limita a este compartimento apical comienzan a acumularse en las nuevas axón [9]. Por lo tanto, podría ser que in vivo, aunque la morfología muestra un proceso apical en el momento de aparición axón, molecularmente la situación es similar a lo que ocurre in vitro. Si es así, tenemos que ser capaces de probar esta idea siguientes apical de las proteínas en CGR durante este período de transición.

Decidimos investigar este problema mediante el uso de la proteína de fusión ASIP/PAR-3-EGFP (Par3-GFP) como in vivo apical marcador. Esta proteína se había demostrado que se acumulan en la parte apical del epitelio del tubo neural en el pez cebra [20]. De las tres isoformas de empalme de pez cebra Par-3 se describe hasta la fecha [27], este es el más similar a los 150 kDa PARD-3a, que no causa defectos de la retina del patrón cuando overexpressed [28]. En consonancia con todas estas observaciones, encontramos que la sobreexpresión de Par3-GFP no afecta a la retina o la diferenciación de laminación y que se acumula en la frontera apical de la retina neuroepithelium en las primeras etapas. Curiosamente, sólo en la fase en la CGR que empezar a diferenciar, que contienen gránulos Par3-GFP pasar de la apical hacia la parte basal de la retina (Figura 6 bis y archivo adicional 4]. No obstante, viajar por todo el camino hacia la superficie basal, pero parecen en lugar de acumular todos los países en desarrollo neuroepithelium, especialmente en torno a la región central, en las fases examinados (archivo adicional 4]. ¿Estos Par3-GFP gránulos, nos preguntamos, siendo la apical en los procesos de diferenciación de las células? De hecho, 4D análisis de los embriones de doble etiquetado con el presente y construir ath5: diferencia-RFP revela que estos gránulos dinámicamente co-localizar con las puntas de los procesos de retracción apical de CGR (Figura 6b y archivo adicional 5]. En nuestras condiciones experimentales, pero no hemos podido ver una acumulación de este apical marcador en la punta de la creciente axones (véase la figura 6 ter y archivo adicional 5]. Por otra parte, la tinción de anticuerpos de diferenciar CGR reveló que apical otros marcadores, como aPKC, α-catenina y F-actina, siguen en las puntas de CGR procesos de retracción apical (Figura 6c-e]. En el Slit1b morphants, apical proceso de retracción se inhibe, y el Par3-GFP en señal CGR se mantiene en la frontera apical de la retina, incluso después de la formación del axón (Figura 6f].

Otra estructura asociada con el compartimento apical de muchos epitelios, incluida la retina neuroepithelium, es el centrosoma [14, 29]. Para visualizar la localización del centrosoma en la diferenciación in vivo CGR, que generó una proteína de fusión que contiene la secuencia completa de pez cebra de la pericentriolar proteína centrin [30], adjunto a la EGFP ( 'GFP-zcentrin'), y lo utilizaron para seguir las subcelular localización del centrosoma en ath5: diferencia-RFP-etiquetados diferenciar CGR.

Nos parece que las buenas prácticas agrarias-zcentrin etiquetas pequeños puntos situados en la parte apical de la retina neuroepithelium indiferenciada. Algunos de estos centrosomes están claramente en el apical consejos de ath5: diferencia-RFP-células positivas. Cuando estas células entrará en el proceso de diferenciación que dará lugar a una RGC, el proceso apical se retrae como hemos descrito, y el centrosoma sigue siendo asociado con la punta del proceso de retracción (20 de las 20 celdas de cinco embriones), incluso cuando la célula es la extensión de su axón en el lado opuesto (Figura 6g y archivo adicional 6]. En todos los casos estudiados, el centrosoma se acerca al núcleo (en su parte apical) sólo justo antes de la terminación apical de retracción. Por analogía con lo que hemos encontrado para Par3-GFP, pero no hemos podido ver una localización basal del centrosoma en la diferenciación de la CGR. Dos de las 20 células que fueron seguidas mostró una localización lateral de la GFP-zcentrin-positivas centrosoma, a partir de alrededor de 1,5 horas después de que el proceso apical había completado la retirada y el resto se mantuvo claramente apical.

En conjunto, estas observaciones ponen de manifiesto que, durante su diferenciación, CGR someterse a una fase de transición en el que conservan algunas características de una célula neuroepitelial, tales como la localización apical de junctional moléculas y el centrosoma, mientras que la formación de la axón. También muestran que, al menos por CGR diferenciación in vivo, el axón emerge basales, mientras que las proteínas apical y el centrosoma siendo apical.

La polaridad de la neuroepithelium es crucial para la orientación de CGR

Las anteriores experimentos muestran que polarizar CGR en armonía con la neuroepithelium en que se producen. Esto sugiere que el entorno local puede influir en el sitio del axón resultado en la diferenciación de CGR. Si es así, axón aparición en CGR puede verse afectada si la polaridad de la retina neuroepithelium se vea perturbado, como lo es en el pez cebra mutantes y NOK tiene. El NOK mutante es defectuoso en Pals-1 (también conocido como Stardust o MPP5), un MAGUK (membrana asociados guanilato-cinasa) proteína que se asocia con el complejo apical junctional. El atípico proteína quinasa C-aPKC λ, la proteína ha afectado a los mutantes, es un componente básico de este complejo. Para investigar cómo RGC axones en estos ambientes perturbados, que inyecta la ath5: diferencia-gfp construir o cruzado ath5: diferencia-gfp peces transgénicos en estos mutantes antecedentes.

Un análisis de 4D CGR en NOK mutantes demuestra que cuando ath5: diferencia-gfp de células positivas se encuentran en la posición basal normal, forman un axón en la superficie interna de la retina y crecer hacia el lugar de la salida del nervio óptico al igual que en el medio silvestre tipo de retina (Figura 7b]. Curiosamente, sin embargo, son muchos CGR malpositioned en NOK mutantes y llegar a mentir a la parte apical de la neuroepithelium. Estas células fuera de lugar, después de mostrar filopodial actividad similar a la observada en las células normales (Figura 7], también se extienden un solo axón (29 de los 29 a 11 células de embriones). Sin embargo, la primera de estas neurites ectópico CGR son siempre dirigidas hacia la superficie exterior de retina, lo que indica una reversión de las células de orientación (Figura 7b]. Tal inversamente orientado "axones" parece crecer más lentamente y de manera irregular más de axones que normalmente coloca CGR (Figura 7c]. Sorprendentemente, sin embargo, también parecen crecer hacia el lugar de la salida del nervio óptico. A time-lapse estudio de grueso confocal pilas (Figura 7d y archivo adicional 7] revela que muchos de los axones apical y encontrar eventualmente fusionarse con el nervio óptico. Porque nuestro criterio definido para la identificación de un axón en vivo es difícil de aplicar en la situación de la diferenciación ectópica CGR, se inyecta el colorante lipofílicas DiI en el tectum fijo de 79 HPF embriones mutantes con el objetivo de etiquetar las neuronas retrogradely. Con esta técnica, ectópico CGR apical y sus axones están etiquetados en la misma proporción que normal CGR con sus axones basal (Figura 7e, f]. Por otra parte, NOK - / - CGR no son perjudicados en su capacidad de polarizar o diferenciar cuando se cultivan en disociar los cultivos celulares (datos no presentados).

¿Son estos mutantes NOK CGR polarizada en la dirección equivocada desde el comienzo de su proceso de diferenciación? Los estudios anteriores [31] han demostrado que la actina filamentosa normalmente se concentran en la parte apical de la neuroepithelium, pero en posiciones aleatorias central en NOK mutante retinas. Figura 7g muestra uno de estos F-actina acumulaciones en las proximidades de la no axonal proceso de un embarazo ectópico RGC, lo que sugiere que su polaridad es totalmente invertida, es decir, su proceso dirigido basales es el equivalente de la apical en un proceso normal de CGR . En consonancia con esta observación fue nuestro, por microscopía 4D, de 12 de la diferenciación ectópica CGR de 8 diferentes NOK embriones, que se retracte claramente de este "proceso apical", mientras que el axón que forman en la superficie exterior de retina (Figura 7j y archivo adicional 8]. También estudió los movimientos de Par3-GFP gránulos en ath5: diferencia-RFP-positivos en estas células mutantes de retina (Figura 7i]. Figura 7h muestra un Par3-GFP gránulo en la punta de un basales dirigido 'apical' en un proceso RGC ectópico, que es de ampliación de un axón en la superficie exterior de retina. Sin embargo, hemos encontrado nunca ninguna acumulación de Par3-GFP en el cono de crecimiento axonal.

En ha mutantes, también encontramos desplazados ath5: diferencia-gfp de células positivas. Sin embargo, en contraste con NOK mutantes, la formación de los axones de estas putativo CGR era difícil de observar. La mayoría de los apical ath5: diferencia-gfp-positivo en las células mutantes ha muestran un alto grado de actividad en la superficie celular, ya menudo forma breve varios neurites. De hecho, se comportan de una manera que recuerda de CGR en la fase 2 in vitro (Figura 8 bis y archivo adicional 9]. En más extendido sesiones de grabación, de ath5: diferencia de los transgénicos gfp cruzaron en un mutante tiene antecedentes, ectópico CGR con los axones pueden ser vistos. A diferencia de las observadas en los mutantes de coronas noruegas, ha embriones en el axón ectópico neurites-como a menudo no se extienden a grandes distancias y muchos de ellos crecen hacia la periferia de la retina en lugar de hacia el nervio óptico (Figura 8b; cuantificación ver en la Figura 10 abajo). Los problemas que estas células parecen tener en su capacidad para crecer axones o dirigirlos adecuadamente, en principio, podría deberse a una celda autónomos efecto de la mutación, sobre todo porque aPKC actividad ha demostrado ser importante para la determinación axón en las células del hipocampo de rata [9]. Sin embargo, esto es poco probable que sea así, porque mutante CGR coloca en la parte basal de la retina forma axones normalmente (Figura 8 bis y archivo adicional 9]. Además, ha mutante CGR polarizar in vitro con la misma eficiencia como de tipo salvaje células (Figura 8c-e]. De este modo, las diferencias en la polarización entre ectópico y ha NOK CGR mutantes tienen más probabilidades de ser debido a un medio ambiente más que una célula autónoma-efecto.

Factores extrínsecos a CGR son necesarios para una eficiente RGC polarización en vivo: el papel de la Minga y la lámina basal

Los resultados se describen en la sección anterior sugieren un papel de la retina neuroepithelium medio ambiente en la orientación de la CGR, polaridad, sino plantear la cuestión de qué elementos del medio ambiente son más importantes para influir en el sitio de crecimiento axonal en CGR. Una pista para responder a esta pregunta, pensamos, puede provenir de explorar las diferencias entre NOK y ha mutantes. La diferencia más saliente entre esos mutantes es la pigmentación del ojo (Figura 9a]. Esto nos sugiere que la integridad del RPE podría ser un factor importante. En silvestres de tipo embriones, el pigmento se refiere a la retina neuroepithelium exterior, mientras que en NOK mutantes, grandes áreas de superficie de la retina carecen de pigmento [32], y, en estas zonas la lámina basal de la RPE, la membrana de Bruch, se yuxtapone a la epitelio de la retina neural (Figura 9b, c]. En ha mutantes, las lagunas en la RPE son raros y los pequeños (Figura 9d], con la RPE sólo aparente realmente escasos en el borde periférico.

La Minga-anticuerpos específicos Zpr-2 ha permitido comparar la distribución de estas células con que ectópica de neuronas en los diferentes entornos mutantes. En NOK mutantes, la ectópico ath5: diferencia-gfp-expresando células y axones parecen estar concentrados en las zonas de la retina carece de RPE (Figura 9b, f]. En los embriones tiene, sin embargo, ath5: diferencia-gfp de células positivas parecen ser más distribuidas de manera uniforme en toda la anchura de la retina (Figura 9f]. Para cuantificar esta que mide los perfiles de ath5: diferencia-gfp intensidad de fluorescencia confocal en las secciones de este doble marcado de retina. Los resultados, presentados en la figura 9 sexies, muestran que la acumulación de etiquetas en la parte interna de la retina en la naturaleza del tipo de retina se convierte en una acumulación de señal, tanto en las superficies de la retina en la retina NOK mutante. En NOK morphants (que muestran una leve NOK-como fenotipo) está claro que hay un pequeño pico de apical ath5: diferencia-gfp señal en las zonas donde la RPE está ausente. Estos datos son coherentes con la CGR está cerca de la superficie sobre la que están creciendo los axones. Esto puede ser así, porque una vez que el axón formas, es probable que ejerza suficiente tensión en el cuerpo celular para arrastrar hacia la superficie. En ha mutantes, a pesar de que la RPE cubre la mayor parte de la superficie apical de retina, sólo hay algunas zonas carece de RPE. En estas zonas también encontramos en una proporción ligeramente superior apical ath5: diferencia-gfp señal.

Estos resultados sugieren que el acceso a una membrana basal, ya sea el centro de la lámina basal o la retina neural o el exterior de la membrana de Bruch de la RPE, puede ser suficiente para obtener orientado axón aparición. Si esto es así, entonces ectópico apical CGR que se les impide acceder a la membrana de Bruch debería tener problemas para polarizar, mientras que incluso de tipo salvaje CGR debe mostrar la polarización inversa si se le da acceso a esta membrana basal. Para probar esta hipótesis se realizó el trasplante blastomere entre experimentos de tipo silvestre y mutante NOK embriones. Como era de esperar los resultados de las anteriores, algunas células trasplantadas de ath5: diferencia-gfp-positivas de tipo salvaje donantes en NOK anfitriones parecen ectópica localizada (Figura 10b]. Estos salvajes del tipo de células son por lo general se permite polarizado y crecer axones en la superficie exterior de retina, dirigida hacia la salida del nervio óptico (Figura 10c]. Cuando NOK células mutantes son trasplantados en de tipo salvaje embriones, los pequeños clones mutantes de ath5: diferencia-gfp-positivos se comportan como células normales CGR (no se muestra), tal como se describe anteriormente [31]. Sin embargo, cuando los clones trasplantado son mayores, existe una clara locales de la interrupción del anfitrión neuroepitelial polaridad (Figura 10d]. En la mayoría de estos casos, la retina neural son clones junto al de tipo salvaje intacta RPE (Figura 10e y archivo adicional 10], por lo que ectópico NOK CGR mutantes que no tienen acceso a la membrana de Bruch. ¿Qué es particularmente revelador en este caso es que la mayoría de estos ectópico CGR, ya sea dejar de crecer a largo neurites o crecer axones que están mal dirigidas (Figura 10f].

Los gráficos en la figura 10g-h muestra una comparación cuantitativa de dirigirse resultado de los axones de ectópico CGR en NOK y ha mutantes, en comparación con la de trasplantados ectópico CGR en mosaicos. Los datos apoyan la hipótesis de que la inversión de ectópico RGC orientación en NOK mutantes depende de la ausencia de la RPE. Para probar esta nueva, hemos utilizado dosis bajas de una traducción de bloqueo morpholino NOK (0,17 a 0,20 pmoles por embrión; Figura 9a], que, aunque capaces de producir ectópico CGR, no son eficientes en la eliminación de la RPE. Por lo tanto, CGR ectópico en estos embriones son usualmente apposed a la RPE en lugar de la membrana de Bruch. De acuerdo con la hipótesis de que se esté ensayando, estas células deberían también tener dificultades para polarizar. De hecho, estos ectópico CGR no suelen orientar, ya sea en el normal o dirección, y los axones de estas células, cuando están presentes, tienden a crecer aberrantly, a menudo hacia la periferia de la retina (archivo adicional 11]. Un resumen de los comportamientos observados de la CGR en las condiciones analizadas se presenta en la figura 10 decies.

Discusión

Intrínseco mecanismos se utilizan principalmente para romper la simetría en las neuronas que se desarrollan en un período de dos dimensiones simétricas en el medio ambiente vitro, in vivo, pero la polarización en tres dimensiones ofrece el medio ambiente extrínseca señales que orientan la diferenciación de las neuronas. Para el enfoque de los mecanismos que impulsan la polarización neuronales in vivo, hemos utilizado 4D microscopio para examinar la manera CGR en el pez cebra hacer morfológicas de transición post-mitótico neuroepitelial en forma de células de las neuronas con basales orientado a los axones. Comparación de la polarización de las neuronas del hipocampo de mamíferos, de hecho o de pez cebra CGR in vitro, muestra que existen diferencias cruciales entre RGC polarización en la cultura y en los tejidos vivos. Estas diferencias pueden explicarse sobre la base de las influencias ambientales. Las células cultivadas son casi en un entorno completamente artificial. Ellos están en contacto con un sustrato plano (a menudo rico en laminina) y rara vez entran en contacto con otras células. In vivo, sin embargo, la diferenciación de las neuronas son, naturalmente, casi completamente rodeada por las células con las que interactúan ampliamente. Además, el ambiente nativo ofrece heterogénea posicional claves que son difíciles de emular in vitro.

Estas diferencias son susceptibles de influir en las etapas iniciales de diferenciación. In vitro, las células se redondea y se extiende pseudopodia filopodios y todos alrededor de su superficie libre, mientras que en el recién nacido vivo RGC primero se extiende desde el apical a la superficie basal de la neuroepithelium suponiendo una huso forma, típica de neuroepitelial células, y luego comienza retractarse de su proceso apical. CGR in vivo muestran filopodial actividad en la parte basal para 1 ó 2 horas antes de axonogenesis, mientras que la diferenciación de CGR en extender la cultura a corto neurites en varios puntos de sus órganos de células, antes de que uno de ellos comienza a alargar en un axón de la misma manera. Esto parece muy comparable a la fase 2 de las neuronas del hipocampo de rata diferenciación in vitro, aunque hemos encontrado que CGR, en nuestras condiciones de cultivo, por lo general no presentan una morfología multipolar, pero sólo una alternativa de crecimiento y retracción de neurites en diferentes puntos. Otra diferencia de las células del hipocampo de ratas es que parece pez cebra CGR para formar sus dendritas de novo en la transición entre las etapas 3 y 4. La segunda etapa, que puede durar hasta varias horas en cultivos de CGR, no se considera normal en la diferenciación in vivo CGR, debido a que estas células parecen pasar directamente de un neuroepitelial-como en forma de huso a una celda en la que el Real Gobierno de Camboya sólo tiene una único rápida ampliación de neurite, que invariablemente se convierte en el axón. Esto es siempre neurite formado en el polo basal de la célula, frente a un proceso de retracción apical. Señales distribuidos heterogéneamente en la retina neuroepithelium podría ser responsable de restringir el axón formación a la parte basal [33]. A una restricción del mismo tipo celular comportamiento muy recientemente ha sido descrito para diferenciar HSN motorneurons que viven en C. elegans larvas [34].

El trabajo seminal de Hinds Hinds y [14] en la retina del ratón en desarrollo, después de mucho antes las observaciones de Ramón y Cajal [13], sugiere que en la CGR axón y el proceso basal fueron la misma cosa, o que el axón se formó de la basal. Recientes time-lapse bipolar observaciones de las células in vivo mostraron que la neurites se extiende hasta la capa plexiforme externa y la capa plexiforme interna, respectivamente, de desarrollar la unretracted apical y basal de los procesos de migración de precursores [35]. En el presente estudio, 4D de imágenes nos permitió observar la dinámica de la CGR en axonogenesis en vivo y ver que en muchos casos, especialmente en las primeras etapas, el axón surge directamente del cuerpo celular después de que llegue a la superficie basal de la neuroepithelium y está en aposición a la misma. Es interesante que la actividad filopodial en la parte basal de dicha diferenciación CGR comienza antes de la ampliación del axón, similar a lo que fue descrito anteriormente para diferenciar rata CGR [36]. En etapas posteriores, sin embargo, la mayoría de los axones RGC parecen crecer de un proceso basal. La razón por la cual basal proceso sin diferenciar CGR son sólo relativamente visto en las primeras etapas de diferenciación de la retina puede reflejar el hecho de que la primera CGR son capaces de translocate sus misiones por todo el camino a la basalmost posición, mientras que más tarde-la diferenciación de las misiones están bloqueados de llegar a la superficie basal de una capa de CGR envasados herméticamente y deben formar los axones de una distancia (véase la figura 2a].

Nos pregunta si la retracción del proceso apical o componentes que normalmente están localizadas a este proceso de proporcionar la información intrínseca que cuenta la CGR, diferenciando el momento y el lugar para formar el axón. En la retina, después de los precursores mitótico RGC transitoriamente adquirir un huso-como, neuroepitelial morfología. Empiezan a perder esta neuroepitelial morfología con la retracción del proceso apical, y el axón suele ser formado después de este retroceso se ha iniciado pero aún no ha terminado. Sin embargo, nuestras observaciones también muestran que los axones pueden salir de la CGR ante la retracción del proceso comienza apical. En Slit1b morphants, la mayoría de los axones CGR forma antes apical comienza proceso de retracción. Nuestros resultados con Slit1b son compatibles con trabajos anteriores que muestran un papel de las proteínas Colapso en la migración neuronal [25], y será muy interesante para investigar cómo Slit1b participa en retracción apical, a pesar de que tendría que ser objeto de otro estudio. Todas estas observaciones indican que el axón de extensión se produce con independencia del momento de retracción apical.

Se ha confirmado por los diferentes grupos que el Par-3-Par-6-aPKC complejo se acumula en la punta de la creciente axón de las neuronas del hipocampo en cultivo, donde tiene un papel fundamental en la determinación del axón identidad [7, 9]. No hemos encontrado detectable acumulación de Par3-GFP en el Real Gobierno de Camboya que forman los axones in vivo. Por el contrario, esta proteína, aunque está presente en la diferenciación de CGR, sigue siendo apical. Este hallazgo apoya la aparente ausencia de un papel complejo apical de los componentes en las neuronas de setas cuerpo durante axonogenesis (o dendritogenesis) en que viven las larvas de Drosophila [12]. También muestran que aPKC-λ-deficiente (tiene - / -) CGR son capaces de polarizar de manera eficiente y ampliar los axones in vivo cuando estas células están en contacto con la superficie interna de la retina y que también pueden polarizar in vitro. En este caso, puede ser que porque tiene la mutación afecta aPKC-λ y no aPKC-ζ, esta última compensa la ausencia de los primeros y doble mutantes que pueden ser necesarias para revelar si aPKCs son necesarios para orientado RGC axón resultado en vivo y la polarización intrínseca in vitro.

Se informó recientemente que la localización del centrosoma está involucrado en el establecimiento de la sede del axón aparición de cultivos de células de hipocampo de rata [11]. Los autores del estudio que sugiere que durante telofase de un neurogénica apicobasal la división celular [37 - 39], el centrosoma del basal posterior a la hija de células mitóticas, que se encuentra enfrente de la superficie apical, determinaría la aparición del axón de la basal lado. Sin embargo, esto podría no funcionar en nuestro caso porque no hay apicobasal divisiones celulares en la diferenciación de la retina de pez cebra, y proceden de CGR plana orientada a las divisiones [17, 21]. La ausencia de apicobasal divisiones en la retina de pez cebra es también coherente con nuestra observación de que los precursores RGC heredar componentes, tales como Par3-GFP, aPKC, α-catenina y F-actina de los complejos de adhesión apical en las puntas de sus procesos de retracción apical. Sorprendentemente, a través del análisis dinámico de la CGR, la diferenciación de microscopía 4D, también encontró que el centrosoma no se mueva de su posición apical durante todo el proceso de axonogenesis. Esta observación no excluye la posibilidad de una función esencial de este orgánulo en el axón axón o determinación crecimiento, pero pone de manifiesto que su localización cerca del lugar del axón formación no es necesaria para la normal polarización de pez cebra CGR en vivo. Además, nuestros datos apoyan anteriores datos obtenidos de los análisis ultraestructural de diferenciación de la retina del ratón [14] y otros sistemas, incluidas las células piramidales del hipocampo [40, 41]. Muchos estudios han demostrado que el centrosoma, que es esencial para la translocación nuclear, se encuentra en la vanguardia de lado el núcleo en la migración de las neuronas [42]. En nuestro sistema, el centrosoma localiza al borde como el núcleo translocates basal hacia la superficie. Esta diferencia puede deberse a que CGR no emigrar, pero en realidad sólo alargar y translocate sus núcleos.

Hemos utilizado dos mutaciones, y NOK tiene, para analizar el papel de neuroepitelial polaridad en la orientación de polaridad RGC in vivo. Hemos encontrado en NOK mutantes que ectópico CGR son capaces de polarizar adecuadamente (es decir, para formar un único axón), sino que su orientación es a menudo invertida (es decir, el axón se dirige hacia el exterior retina). De acuerdo con hallazgos anteriores de que los marcadores apical, incluyendo F-actina y Par-3, se acumulan en posiciones aleatorias dentro de la retina en estos mutantes [28, 31], encontramos que, basales dirigidos estos procesos de diferenciación ectópica CGR expresar Par3-GFP en la proximidad de F-actina de tinción. En la retina NOK mutante hay grandes lagunas donde el RPE no está presente y donde la membrana de Bruch, la lámina basal de la RPE, se convierte en apposed a la superficie de la retina neuroepithelium. En estas regiones la neuroepitelial parece completamente polaridad invertida (es decir, el complejo apical se encuentra basales con respecto a una lámina basal presente en la superficie apical de la neuroepithelium).

También inesperadamente encontró que había menos ectópico CGR se concentró en la parte apical de la retina, así como muchos menos en los axones ectópico ha mutantes que en NOK mutantes. La Minga es más intacto tiene en mutantes. Esta observación sugiere que el RPE normalmente inhiben revertir la polarización, ya sea mediante la generación de un inhibidor de señal o bloqueando el acceso a las señales permisiva en la membrana de Bruch. Ha sido demostrado en pollito de codorniz y que una pequeña proporción de los axones naturalmente escapar de la capa del nervio óptico y crecen entre las células del EPR y la membrana de Bruch, y que el Bruch de la lámina basal es un buen sustrato in vitro para el crecimiento axonal RGC [43]. Esto favorece la verosimilitud de la segunda hipótesis. Además, la inversión de CGR se ha observado en los órganos de retina cultivadas en la que el vítreo superficie ha estado expuesta al chondroitin sulfato [44]. En este caso, también, ampliar ectópico CGR axones en la superficie exterior de la retina. Muchos estudios anteriores han propuesto que el RPE tiene un papel esencial en la retina de laminación [31, 45 - 47], y es tentador especular que nuestras observaciones también podrían ayudar a explicar sus resultados.

Conclusión

La polaridad de la neuroepithelium parece ser un importante factor determinante en el sitio del axón resultado de CGR. Nuestro trabajo sugiere que existe una tendencia intrínseca a la CGR para polarizar (para formar un único axón), sino que la diferenciación de CGR en vivo el uso de señales, como las que normalmente se encuentran en la membrana limitante interna de la retina, para definir la orientación de esta polarización y la posición del axón aparición.

Abreviaturas

= 4D de cuatro dimensiones; aPKC = atípico proteína quinasa C; CCD = dispositivo acoplado por carga; EGFP = aumento de proteína verde fluorescente; ha = corazón y el alma; HPF = horas después de la fecundación; MAB = anticuerpo monoclonal; mRFP monomérica = proteína fluorescente de color rojo ; NOK = nagie oko; Pab = anticuerpo policlonal; PBS =-buffer fosfato salino; PCR = reacción de polimerasa en cadena; RGC = células ganglionares de la retina; RPE = epitelio pigmentario.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

FRZ diseñado, realizado y analizado la mayoría de los estudios descritos. LP realizó el diseño y la clonación de la Ath5: diferencia de la construcción de buenas prácticas agrarias y la generación de la corresponsal de peces transgénicos, ayudó a diseñar la Ath5: diferencia-RFP construir y se lleva a cabo en vivo el 4D estudio de GFP-zcentrin/Ath5: diferencia-RFP expresión. CJW diseñado y clonado el GFP-zcentrin construir y ayudó en el diseño de la Ath5: diferencia-RFP construir. C-BC diseñado y siempre que la Slit morpholinos a las proteínas. WAH concibe el estudio y participó en el diseño de la mayoría de los experimentos. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Material complementario
1 de ficheros adicionales
A Quick Time archivo de vídeo que muestra
ath5: GFP
- diferenciación positiva CGR
in vitro
a y b son dos GFP-expresando que las células se someten a las etapas iniciales de diferenciación en la cultura. Fluorescencia sólo aparece al principio y al final de la película. El tiempo se muestra en horas: minutos: segundos.
2 ficheros adicionales
A Quick Time archivo de vídeo que muestra la diferenciación RGC
in vivo
en un embrión inyectado con
ath5: diferencia de las buenas prácticas agrarias
plásmido de ADN, para obtener un mosaico de expresión. Dos diferenciar CGR están marcados como 1 y 2. Las puntas de flecha a punto las puntas de los proceso apical y del axón alargándose. El asterisco marca la diferenciación de las dendritas en la celda 2. Etapa en la puesta es de 32 HPF. El tiempo se muestra en horas: minutos: segundos.
3 ficheros adicionales
A Quick Time archivo de vídeo donde se muestran los efectos de Slit1b morpholino RGC inyección en la diferenciación. El embrión es transgénico para Ath5: Gap-GFP. La flecha señala el cuerpo celular de una de CGR, que constituye un axón marcados con la punta de flecha. Etapa en la puesta es de 48 HPF. El tiempo se muestra en horas: minutos: segundos.
4 de ficheros adicionales
A Quick Time archivo de vídeo que muestra la localización de Par3-GFP proteína de fusión en un embrión de pez cebra retina durante RGC diferenciación. Las puntas de flecha marca dos Par3-GFP gránulos visto pasar de la frontera apical de la neuroepithelium. Etapa en la puesta es de 32 HPF. El tiempo se muestra en horas: minutos: segundos.
5 de ficheros adicionales
A Quick Time archivo de vídeo que muestra la diferenciación de CGR en un embrión de doble etiquetado con Par3-GFP (mRNA, expresión ubicua) y Ath5: Gap-RFP (ADN, del mosaico de expresión). Azul punta de flecha, punta de la retracción apical de un proceso de diferenciación de CGR. Pink punta de flecha: punta del axón alargándose de la misma celda. Etapa en la puesta es de 32 HPF. El tiempo se muestra en horas: minutos: segundos.
6 ficheros adicionales
A Quick Time archivo de vídeo que muestra la diferenciación de CGR en un embrión de doble etiquetado con GFP-zcentrin (mRNA, expresión ubicua) y Ath5: Gap-RFP (ADN, del mosaico de expresión). Varios CGR se consideran para empezar a retractarse de sus procesos apical, la mayoría de ellos claramente muestran un centrin-GFP marcado centrosoma a sus consejos. Etapa en la puesta es de 32 HPF. El tiempo es en cuestión de minutos.
7 ficheros adicionales
A Quick Time archivo de vídeo que muestra el crecimiento ectópico axón en un
NOK
mutante /
ath5: diferencia de las buenas prácticas agrarias
embriones transgénicos. Vista ventral de la retina y el nervio óptico, tomado de una película 4D, compuesto por un montón de grosor, que fue girada a través de 90 °. Etapa en la puesta es de 48 HPF. El tiempo se muestra en horas: minutos: segundos.
8 de ficheros adicionales
A Quick Time archivo de vídeo que muestra de retracción de un ectópico, basales de la CGR, dirigida en un proceso
NOK
mutante /
ath5: diferencia de las buenas prácticas agrarias
embriones transgénicos. El Real Gobierno de Camboya marcado con una flecha es la diferenciación de cerca de la superficie apical de una
NOK
mutante retina. Las puntas de flecha indican un proceso de retracción, dirigida basales, y la punta de un neurite en la ampliación de la superficie apical, de la misma celda. Etapa en la puesta es de 48 HPF. El tiempo se muestra en horas: minutos: segundos.
9 de ficheros adicionales
A Quick Time archivo de vídeo que muestra el fracaso de diferenciar apical de las células que expresan Ath5: Gap-GFP en una
tiene
mutante retina. La célula señalado con una flecha al comienzo de la película se divide ectópica para dar lugar a dos células hijas (a1 y a2). La celda A2 el tiempo forman un axón en la retina la superficie basal, pero la celda A1 se moverá hacia la superficie apical, donde se divide de nuevo. Ambos a1 la hija de células (a1 'y a1 ") se mantendrán en esta posición apical, el aumento de GFP expresión (un indicador de destino RGC), pero ninguno de ellos se forma un axón durante el tiempo de grabación. Un ejemplo similar se muestra como las células b (dividiendo como B1 y B2). Etapa en la puesta es de 32 HPF. El tiempo se muestra en horas: minutos: segundos.
10 ficheros adicionales
A Quick Time archivo de vídeo que muestra el fracaso para crecer a largo neurites de un
NOK
apical en una celda de tipo salvaje. La celda marcada con una flecha se deriva de una
NOK
mutante /
ath5: diferencia de las buenas prácticas agrarias
transgénicos cuyo embrión Blastómeros se trasplantaron en una de tipo salvaje de acogida (sin etiquetar). En el momento del punto 16 minutos 49 segundos, un doble marcado con la rotación en tres dimensiones de reconstrucción se muestra en la que, además de las buenas prácticas agrarias, la señal roja de dextrano-rodamina presente en todas las células trasplantadas se muestra. Esta reconstrucción muestra cómo las células marcadas se encuentra en la superficie apical de retina, y que no está en contacto con los mutantes trasplantado células RPE (que sería la etiqueta roja). La célula crece solamente un corto neurite que convierte al cuerpo celular y no se extiende aún más durante la grabación. Etapa en la puesta es de 32 HPF. El tiempo se muestra en horas: minutos: segundos.
11 ficheros adicionales
A Quick Time archivo de vídeo que muestran que en
NOK
morphants, CGR puede diferenciar ectópica pero no directo a los axones hacia la salida del nervio óptico. Un RGC apical (flecha) se demuestra que se han extendido a muy largo neurite (punta de flecha) en la superficie apical de retina, pero, en lugar de ser dirigida hacia la parte posterior del ojo (donde se reuniría el nervio óptico), se dirige a un dirección opuesta, hacia la periferia de la retina. Etapa en la puesta es de 48 HPF. El tiempo se muestra en horas: minutos: segundos.
Agradecimientos

Damos las gracias a un Reugels J Wittbrodt y para compartir los plásmidos utilizados en este trabajo; Abdelilah S-Seyfred, J Malicki y yo masai de las líneas de pez cebra; Fischer I de anticuerpos; Bate M, A Brand, C Holt R Wong y para la lectura crítica del manuscrito ; Pradel y de asistencia técnica en la clonación molecular.