Malaria Journal, 2006; 5: 104-104 (más artículos en esta revista)

Gota gruesa para examen Plasmodium falciparum malaria ha reducido la sensibilidad y la densidad de parásitos subestima

BioMed Central
Philip Bejon (pbejon@well.ox.ac.uk) [1], Laura Andrews (laura@well.ox.ac.uk) [2], Angela Hunt-Cooke (angelahuntcooke@yahoo.co.uk) [1] , Frances Sanderson (frances.sanderson @ imperial.ac.uk) [1], Sarah Gilbert C (sglibert@well.ox.ac.uk) [2], Adrian VS Hill (adrian.hill @ well.ox.ac. Reino Unido) [1]
[1] Centro de Vacunología Clínica y Medicina Tropical de la Universidad de Oxford, Oxford, OX3 7LJ, Reino Unido
[2] Wellcome Trust Centre for Human Genetics de la Universidad de Oxford, Roosevelt Drive, Oxford OX3 7BN, UK

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Resumen
Fondo

De espesor de sangre películas son utilizados habitualmente para diagnosticar la malaria por Plasmodium falciparum. Aquí, se utiliza para diagnosticar voluntarios expuestos a la malaria desafío experimental.

Métodos

La frecuencia con que las películas de sangre fueron positivos con un determinado parásito mide la densidad de PCR fueron analizados. La Poisson distribution se utilizó para calcular la probabilidad teórica de diagnóstico. Otros estudios in vitro utiliza diluciones seriadas para preparar películas de espesor de la malaria en las culturas conocidas parasitemia.

Resultados

Incluso en manos expertas, películas gruesas de sangre eran considerablemente menos sensible que podría haberse esperado de los números parásito mide por PCR cuantitativa. In vitro mostraron que el trabajo grueso preparado películas de la malaria en las culturas conocidas parasitemia parásito subestimado constantemente densidades.

Conclusión

Al parecer, un gran número de parásitos se pierden durante la tinción. Esto limita su sensibilidad, y da lugar a estimaciones erróneas de densidad de parásitos.

Fondo

Microscopía de películas gruesas de sangre habitual es la prueba de diagnóstico de malaria por Plasmodium falciparum. Densidad suele ser evaluados por gruesas películas, ya sea por conteo de parásitos por campo microscópico, o por el recuento de parásitos por cien glóbulos blancos [1]. De espesor películas contienen varias capas de células rojas, mientras que películas delgadas contienen una sola capa de células rojas propagación. Así, por un número fijo de campos microscópicos, de espesor películas permitir que el microscopista para examinar un mayor número de glóbulos rojos por la presencia de parásitos, y bajo parasitaemias pueden ser más fácilmente identificados por la película de espesor. Películas delgadas son preferibles a examinar la morfología de parásitos y determinar las especies. No inmune individuos pueden ser mal cuando un parásito o menos está presente en toda una película de espesor, lo que exige laborioso, repitió los exámenes para hacer un diagnóstico.

Esporozoito desafío experimentos se llevaron a cabo, donde los voluntarios fueron expuestos a la malaria desafío experimental para evaluar las vacunas contra la malaria candidato [2 - 5]. Tratamiento decisiones se basaron en análisis de sangre película, pero PCR se realizó en todas las muestras de sangre [6]. PCR datos no se hizo disponible hasta después de que el juicio se ha completado.

La sensibilidad de las películas de espesor de sangre se estudió con los datos obtenidos durante estos ensayos, en comparación con los datos de PCR cuantitativa, y seguir investigando estos hallazgos con los estudios in vitro.

Métodos
Esporozoito desafío

Los voluntarios dieron su consentimiento informado. Los procedimientos fueron examinadas por OXREC (Oxford Comité de Ética de Investigación), el comité de ética local, y de conformidad con la declaración de Helsinki (revisada en 1983). Dos veces al día muestras de sangre fueron tomadas desde el día 6 hasta el día 14, a continuación, todos los días hasta el día 21. Al menos 100 campos de alta potencia de una gota gruesa fueron visitadas y PCR cuantitativa realizada en cada una de las muestras. Los voluntarios fueron tratados cuando un solo parásito fue visto por la sangre de cine, después de la aparición del parásito fue confirmado por un segundo microscopista. Ni los médicos ni la gestión de microscopistas fueron conscientes de PCR de datos durante el juicio.

De espesor de sangre películas

Giemsa tinción se utilizó para los dos primeros estudios de esporozoito desafío, y sobre el terreno de la mancha en coplin frascos para las últimas dos estudios. El grueso película fue secado al aire en ambos métodos. Para la tinción de giemsa, la película se mantuvo en 5% Giemsa durante 30 minutos, luego lavar suavemente en el agua del grifo y secado al aire. Campo de la mancha se aplicó por inmersión en la diapositiva sobre el terreno de una mancha durante 3 segundos, y luego en el agua del grifo durante 3 segundos (con agitación suave), en Campo B de la mancha por un nuevo 3 segundos y luego lavar suavemente en el agua del grifo para eliminar el exceso de mancha. La diapositiva se seca al aire durante al menos 30 minutos. El plomo microscopista celebró un puesto en la Escuela de Londres de Higiene y Medicina Tropical, Laboratorio de Parasitología Clínica, el Reino Unido laboratorio nacional de referencia, y otros en el Consejo de Investigación Médica, Gambia. El plomo microscopista examinado diapositivas producidas por diluciones seriadas, ciegos a la fuente. El promedio de grosor de película utiliza 10 μ l de sangre propagación más de mil campos de alta potencia, por lo que los 100 campos de alta potencia sistemáticamente examinados durante opiniones 1 μ l de sangre [7].

PCR

La PCR método se describe en otro lugar [6]. En pocas palabras, EDTA anticoagulados muestras de sangre se filtra para eliminar los leucocitos, el ADN fue purificado de 0,5 ml de sangre filtrada, y eluye en 50 μ l. Una parte de la multicopy 18S (subunidad menor) ribosomal RNA genes de P. falciparum fue amplificado por PCR y el aumento de producto de PCR detectó vinculante por el tinte fluorescente SYBR Green I usando el Rotor-Gene Real-Time PCR máquina (Corbett Research), utilizando μ l l ADN extraído por duplicado. El aumento de producto de PCR es su cuantificación por comparación con las preparaciones de parásitos conocidos números.

870 pares de las películas de sangre y la PCR se examinaron muestras de 80 voluntarios con que cuenta el aumento de parásito.

Resultados
La sensibilidad de las películas de sangre durante el esporozoito desafío

La Poisson distribution se utilizó para calcular la probabilidad de muestreo de un parásito en el volumen de sangre examinados en el microscopio, con un determinado parásito densidades identificados por PCR. A bajas parasitaemias había una discrepancia entre la probabilidad calculada de diagnóstico por PCR lecturas, y la frecuencia de diagnóstico a que la densidad de espesor de película. Para el grueso películas preparado entre 100 y 1000 ml por parásitos, la probabilidad calculada de la toma de muestras en un parásito 1 μ l fue de 26%. Sin embargo, las películas de grosor había una sensibilidad de sólo el 9% (95% IC 4-15%) en este rango. Entre 1000 y 10000 parásitos por ml, calcula la probabilidad de un parásito que se presente es del 84%, pero la sensibilidad de las películas de espesor fue de 29% (IC 19-39%). Fue sólo por encima de 10000 parásitos por ml de espesor películas cuando había mayor sensibilidad (81% CI 65-97%), cuando se calcula la probabilidad de toma de muestras fue del 99%.

Este sorprendente hallazgo sugiere que un número importante de parásitos no se visualizan en una gruesa película a pesar de ser teóricamente presente en la original muestra de sangre utilizada para hacer la película. Los resultados no varían en función de la tinción de protocolo (Giemsa o mancha sobre el terreno) o por microscipist. Un umbral de densidad similares fiables para el diagnóstico de la malaria de película gruesa examen se informa en otra parte [8].

Dilución de serie

Los experimentos utilizando serie de dilución de un conocido densidad de parásitos luego se llevó a cabo la ampliación de esta observación. Un cultivo in vitro de Plasmodium falciparum se preparó en un 5-10% parasitemia. El parásito contar por primera vez determinar con precisión por una delgada película (por duplicado). La cultura se diluye en serie con la no infectada, toda la sangre fresca. Red de células fueron hechas por Coulter ™ para contrarrestar tanto la cultura originaria y la no infectada la sangre utilizada para diluciones seriadas. Esto permitió el cálculo exacto del número de parásitos predijo, sin tener que contar con películas delgadas en cada dilución. En cada serie de dilución, el análisis de PCR se realizó en 0,5 ml de sangre, y 2 de grosor películas realizadas, utilizando exactamente 10 μ l. Toda la película fue leer, ciegos a la fuente.

Las densidades de sangre visto en el cine de serie de dilución

Para la serie diluido parásito culturas, la densidad de parásitos medida por PCR y de espesor de película se comparó con la media calculada a partir de serie de dilución (Fig 1]. Aunque las lecturas de PCR correspondía bien con los números reales de parásitos generados a partir de diluciones seriadas, de espesor películas eran menos reproducible, pero tienden a medir la densidad de parásitos aproximadamente un registro inferior a los calculados por la dilución de serie.

Discusión

Es poco probable que las células o los parásitos están ocultos durante microscopía, desde la preparación adecuada de la diapositiva asegura la visibilidad a través de todos los planos de foco. Es más probable que los parásitos son o bien lavados fuera sometido a lisis o durante la tinción, PCR desde la tinción de reactivos para la detección de parásitos fue positiva, y la transferencia de parásitos de positivo a negativo diapositivas diapositivas durante la tinción ha sido reconocida desde hace algún tiempo [8].

Película delgada película de espesor y densidad de parásitos estimaciones se han comparado en los estudios anteriores. Aunque las películas de espesor son más sensibles que las películas delgadas, que subestimar significativamente la densidad de parásitos en algunos estudios [7, 9, 10], pero no en otros [11]. Estos estudios previos carecían de precisión, ya que a altas parasitaemias películas gruesas son difíciles de contar con precisión, películas delgadas y no se puede contar con precisión a baja parasitaemias. En el estudio que aquí se presenta, esta dificultad fue evitado mediante el uso de dilución en serie conocido para proporcionar concentraciones de parásitos, y la precisión de la serie de dilución fue confirmada por cuantitativos de PCR en tiempo real. PCR cuenta el número de copias de genes, y esto podría haber conducido a una sobre-estimación del número de parásitos cuando el recuento multi-nucleadas schizonts. Sin embargo, sólo mononucleated parásitos se identifican en la sangre periférica a la baja parasitaemias visto en este estudio, e in vitro culturas fueron sincrónicos.

Conclusión

De espesor películas son considerablemente menos sensible que podría ser posible subestimar parásito y densidades. En el trabajo clínico de rutina no en áreas endémicas de la pérdida de sensibilidad hace que la película de espesor examen mucho más laborioso, y un método de fijación que impiden que los parásitos se lavan fuera mejoraría la sensibilidad del método. En las zonas endémicas de malaria, la pérdida de la sensibilidad no es crítico, ya semi-inmune pacientes son propensos a tener una alta parasitemia en caso de que presente febril con el paludismo. En los estudios epidemiológicos, los umbrales de densidad de parásitos se definen a distinguir la malaria febril de parasitemia crónica [12, 13]. Una sistemática subestimación de la densidad no alterará la clasificación de los individuos, pero si cuenta con la densidad de algunos se hacen de algunos de grosor y de película delgada, y esto dará lugar a una subestimación de la parte inferior parasitaemias contados grueso de la película. Por otra parte, en caso de que los estudios epidemiológicos para definir la densidad de parásitos se repetirá de PCR cuantitativa, considerablemente mayor densidad de parásitos umbrales se determinarán para definir los casos de paludismo. Estas no serán comparables a los estudios anteriores.

Autores de las contribuciones

Diseño Experimental: PB, SL, SG

Trabajo experimental: Luisiana, SL, AHC.

Manuscrito escrito de PB, SG, AVSH.

Agradecimientos

El estudio se realizó con el permiso de OXTREC, la Universidad de Oxford Tropical de Investigación Comité de Ética, y financiado por el Wellcome Trust. P Bejon posee un Wellcome Trust de becas de formación (073597) y AVSH es un Wellcome Trust Investigador Principal. No hay conflictos de intereses. F Sanderson desde entonces ha movido a Imperial College School of Medicine.