Journal of Nanobiotechnology, 2006; 4: 11-11 (más artículos en esta revista)

Nanorods fosfato inorgánico es un nuevo sello fluorescentes en la biología celular

BioMed Central
Chitta Ranjan Patra (patra.chittaranjan @ mayo.edu) [1], Resham Bhattacharya (bhattacharya.resham @ mayo.edu) [1], Sujata Patra (patra.sujata @ mayo.edu) [1], Sujit Basu (Basu . sujit@mayo.edu) [1], Priyabrata Mukherjee (mukherjee.priyabrata @ mayo.edu) [1], Debabrata Mukhopadhyay (mukhopadhyay.debabrata @ mayo.edu) [1]
[1] Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Mayo Clinic Cancer Center, Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, EE.UU.

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Resumen

Se presenta el primer uso de compuestos inorgánicos fluorescentes lantánido (Europio y terbium) orto-fosfato [LnPO 4 H 2 O, Ln = Eu y Tb] nanorods como nuevo fluorescentes etiqueta en la biología celular. Estos nanorods, sintetizado por la técnica de microondas, conservan sus propiedades fluorescentes después de la internalización en la vena umbilical humana células endoteliales (HUVEC), 786-O células, o carcinoma de células renales (CCR). La internalización celular de estos nanorods y sus propiedades de fluorescencia se caracterizaron por espectroscopía de fluorescencia (FS), contraste diferencial de interferencia (DIC), microscopía, microscopía confocal, y la microscopía electrónica de transmisión (TEM). En las concentraciones de hasta 50 μ g / ml, el uso de [3 H]-timidina incorporación ensayos, los ensayos de apoptosis (TUNEL), y azul trypan exclusión ilustra la falta de naturaleza tóxica de estos nanorods, una importante ventaja sobre los tintes orgánicos tradicionales

Fondo

La nanotecnología, la creación de nuevos objetos en nanoescala dimensiones, es una tecnología de vanguardia tener importantes aplicaciones en la investigación biomédica moderna [1 - 7]. Debido a que la dimensión de los dispositivos de nanoescala es similar a los componentes celulares como el ADN y las proteínas [8, 9], las herramientas desarrolladas a través de la nanotecnología puede utilizarse para detectar o controlar varias enfermedades a nivel molecular [3, 10, 11]. Bio-imágenes inorgánicos con sondas fluorescentes nanorods recientemente han atraído un gran interés en la biología y la medicina [1 - 4, 12 - 14] en comparación con nanospheres. Según informó la literatura [15], hay una drástica reducción de la tasa de plasmones dephasing en nanorods frente a los pequeños nanospheres debido a la supresión de interband amortiguamiento [15]. Estas barras muestran muy poca amortiguación de la radiación debido a su pequeño volumen. Estos resultados implican grandes ámbito local y mejora los factores relativamente alta dispersión de la luz-eficiencia, lo que hace metal nanorods muy interesante para aplicaciones ópticas. Por lo tanto, estamos muy interesados en examinar la posibilidad de utilizar fluorescentes nanorods inorgánicos, especialmente lantánido orto fosfato LnPO 4 H 2 O [= Ln UE o Tb], como las etiquetas fluorescentes en la biología celular. En el otherhand, en comparación con tintes orgánicos (incluidos los de fluoresceína, Texas Red ™, lismina rodamina B, y Tetramethylrhodamine) y las proteínas fluorescentes (proteína verde fluorescente, GFP), inorgánicos nanopartículas fluorescentes tienen varios única óptica y electrónica de propiedades-incluyendo su tamaño y la composición - sintonizar las emisiones de visible a longitudes de onda de infrarrojos, un gran cambio stokes, simétrica espectro de emisión, los grandes coeficientes de absorción a través de un amplio rango espectral, excitación simultánea de múltiples colores fluorescentes, muy altos niveles de brillo, [4, 13], alta resistencia a photobleaching , Y una excepcional resistencia a la foto-químicos y la degradación [2 - 5, 13, 16, 17]].

Bio-conjugado con nanopartículas inorgánicas han planteado nuevas posibilidades para el ultrasensible y multiplexado de imágenes de dianas moleculares en las células vivas, modelos animales y, posiblemente, en sujetos humanos. En este contexto, lantánido inorgánicos a base de fluorescentes, especialmente Eu y Tb-fosfato nanopartículas, han atraído una gran atención a la biología celular. Propiedades ópticas de Europio (UE) y terbium (Tb) y sus sales quelatos se han utilizado en diversas aplicaciones biomédicas, es decir, con resolución temporal y ensayos fluorométricos inmunoensayos [18 - 26]. Por otra parte, hay algunos informes anteriores en relación con la introducción de elementos inorgánicos luminiscentes nanospheres como CdSe, ZnS, PbSe, ZnSe, y ZnS en células [4, 27, 28], sin embargo, estos compuestos son tóxicos para las células. A medida que el potencial de efectos tóxicos de los nanomateriales (nanospheres o nanorods) es un tema de considerable importancia, la toxicidad in vivo de Eu y Tb sales será un factor clave en determinar si la imagen fluorescente lantánido sondas pueden utilizarse en vivo. En nuestro estudio, lantánido fosfato [LnPO 4 H 2 O, donde Ln = Eu y Tb] nanorods se rechazaron por no-tóxico para las células endoteliales como analizados por la proliferación de células de ensayos [29] y el ensayo de TUNEL. Por otra parte, a lo mejor de nuestro conocimiento, no se conoce ningún informe internalización de los desnudos (nanorods superficie sin modificaciones de péptidos, moléculas orgánicas, o polímeros) fluorescentes nanorods (EuPO 4 H 2 O y TbPO 4 H 2 O) en células . Con el fin de functionalize la superficie de nanorods, hemos utilizado aminopropyl trimethoxy silano (APTMS) o mercapto-propilo trimethoxy silano (MPTMS) como en la literatura [30]. La funcionalización de estas nanorods utilizando la técnica de microondas [30] se encuentra actualmente en curso en nuestro laboratorio.

Sobre la base de nuestros conocimientos, este es el primer informe de fosfato inorgánico lantánido fluorescentes nanorods como etiquetas fluorescentes en la biología celular. En el presente estudio, EuPO 4 H 2 O y TbPO 4 H 2 O nanorods, ha sido preparado por la calefacción y el horno de microondas se caracteriza, tal como se describe anteriormente [31]. El microondas técnica es sencillo, rápido, limpio, eficiente, económico, que no sean tóxicas y medio ambiente [31]. El objetivo de nuestro estudio fue investigar si estas inorgánicos fluorescentes nanorods fueron capaces de entrar en las células y conservar sus propiedades fluorescentes para la detección posterior a la internalización. Si es así, las drogas o biomoléculas adjunta a este nanorods puede entonces ser detectada después de la internalización y el beneficio futuro de imágenes, las terapias, el diagnóstico y propósitos. El objetivo de este trabajo no es para comparar la toxicidad de los compuestos inorgánicos fluorescentes nanorods con otros compuestos inorgánicos de nanopartículas fluorescentes como CdSe o CdTe, sino para explorar y encontrar nuevos materiales inorgánicos fluorescentes que pueden ser usados como etiquetas fluorescentes en la biología celular.

Resultados y discusión

La morfología de LnPO 4 H 2 O [Ln = Eu y Tb] nanomateriales se caracteriza además por microscopía electrónica de transmisión (TEM) en diferentes aumentos (Figura 1A-D]. Las imágenes de TEM-como los productos sintetizados puso claramente de manifiesto que EuPO 4 H 2 O material (Figura 1A-B] se compone totalmente de nanorods [6 a 8 nm de diámetro y de 100 a 300 nm de longitud] y TbPO 4 H 2 O productos (Figura 1C-D] son una mezcla de dos tipos de vara en micrómetros de tamaño (pequeñas varillas a 0,5 a 1,5 μ m de longitud y 6 a 8 nm de ancho y más grande a barras de 1,1 a 2,2 μ m de longitud y 80 a 130 nm en de ancho).

La excitación y espectros de emisión de LnPO 4 H 2 O se muestra en la Fig. 2A-D. Los principales picos de emisión (Fig. 2B] para EuPO 4 H 2 O se observaron a 588 nm, 615 nm y 695 nm después de excitación a 393 nm (Figura 2A]. Del mismo modo, los principales picos de emisión (Fig. 2D] para TbPO 4 H 2 O se observaron a 490 nm, 543 nm (principales), y después de 588 nm de excitación a 378 nm (Fig. 2C]. Las otras longitudes de onda de excitación para EuPO 4 H 2 O fueron 415 nm, 444 nm, 464 nm, 488 nm (una semana), 525 nm, 535 nm, etc (datos no presentados). Longitudes de onda de excitación para TbPO 4 H 2 O fueron 283 nm, 302 nm, 317 nm, 340 nm, 350 nm, 367 nm, 460 nm, 488 nm, etc (todo no se muestran aquí). Excitación en cualquiera de estas longitudes de onda dado lugar a espectros de emisión similares (datos no presentados) para EuPO 4 H 2 O y TbPO 4 H 2 O. El espectro de excitación de Eu 3 + (Fig. 2A] y Tb 3 + (Fig. 2C] ha puesto de manifiesto una intensa banda a 393 nm y 283 nm en (debido a las transiciones y ss), respectivamente. El espectro de emisión (Fig. 2B] se compone de un 5 D 0 - 7 F J (J = 1, 2, 3, 4) de múltiples líneas de emisión de Eu 3 + con el dipolo magnético-permitió 5 D 0 - 7 F 1 transición (588 nm) fue el más destacado líneas de emisión. TbPO 4 H 2 O dado el característico azul 5 D 4 - 7 F J '(J' = 4,5) y la emisión verde 5 D 3 - 7 F J (J = 3, 4,5,6) de emisión de Tb 3 + aunque la 5 D 4 - 7 F 5 (543 nm), verde de emisión fue la más destacada banda (Fig. 2D]. Estas propiedades de fluorescencia inorgánicos nanorods (LnPO 4 H 2 O) han atraído una gran atención a la biología porque tienen una fuerte emisión óptica que presenta una mayor espectral pico más típicos tintes orgánicos, tienen un gran desplazamiento de Stokes, y son mínimamente influenciado por otros productos químicos. El espectro de emisión tiene las siguientes características: (i) gran cambio Stokes (615-393 = 222 o 543-283 = 260 depende de la longitud de onda de emisión de Europio excitación a 393 nm o terbium excitación a 283 nm), (ii) un estrecho y simétrico de emisión a 615 nm para Europio y 543 nm para terbium, y (iii) una larga existencia. Por lo tanto, nuestra nanorods, a pesar de su tamaño ligeramente más grande, cumplen todos los criterios de nanopartículas inorgánicas fluorescentes.

Con el fin de determinar si la actividad de fluorescencia de estas LnPO 4 H 2 O nanorods siguen siendo los mismos dentro de la célula, 786-O células HUVEC y se incuban durante 24 horas con estos nanorods en varias concentraciones y la emisión (fluorescencia) espectros se registraron en un Fluorolog-3 Spectrofluorometer tras extensas lavado con PBS (buffer fosfato salino) y se muestra en la Figura 3A-B. Figura 3A muestra los espectros de emisión de 786-O células cargadas con EuPO 4 H 2 O nanorods a diferentes concentraciones: 0 μ g / ml (curva-a), 50 μ g / ml (curva-b), y 100 μ g / ml ( curva-c), respectivamente. Del mismo modo, la Figura 3B muestra los espectros de emisión de las células HUVEC cargado con TbPO 4 H 2 O nanorods a diferentes concentraciones: 0 μ g / ml (curva-a), 20 μ g / ml (curva-b), 50 μ g / ml (curva - c), y 100 μ g / ml (curva-d), respectivamente. Resultados similares se obtuvieron al 786-O células fueron tratadas con TbPO 4 H 2 O y HUVEC células fueron tratadas con EuPO 4 H 2 O nanorods (datos no presentados). Se observó que con el aumento de las concentraciones de LnPO 4 H 2 O nanorods (0 a 100 μ g / ml), la tasa de acumulación nanorod dentro de los 786-O y el aumento de células HUVEC como la intensidad de fluorescencia de una curva a curva-c / d se incrementó (Figura 3A-B]. Como estas nanorods mostrar sus distintas propiedades de fluorescencia en el interior del HUVEC y 786 células-O, indirectamente, demuestra que estos nanorods son internalizados (lo cual es confirmado por TEM, como se comenta más adelante).

Una serie de métodos tales como contraste diferencial de interferencia (DIC), microscopía, microscopía confocal y microscopía electrónica de transmisión (TEM) se ha utilizado para determinar las trayectorias de celulares nanorods y se describen a continuación. Contraste diferencial de interferencia (DIC) de imágenes de microscopía HUVEC (Fig. 4A-F] muestran claramente una diferencia significativa en el contraste entre las células control sin tratar (Fig. 4A], las células tratadas con EuPO 4 H 2 O (Fig. 4B - D], y las células tratadas con TbPO 4 H 2 O nanorods (Fig. 4E-F] a distintas concentraciones. Se obtuvieron resultados similares al 7886-O células fueron tratadas con LnPO 4 H 2 O nanorods (datos no presentados). Estos resultados demuestran una vez más indirectamente que estas LnPO 4 H 2 O nanorods están internalizados.

Inorgánicos fluorescentes EuPO 4 H 2 O y TbPO 4 H 2 O nanorods en el interior del 786-O células (Fig. 5] y HUVEC (datos no mostrados aquí) fueron detectados por microscopía confocal. La fluorescencia (columna izquierda) y su correspondiente fase de imágenes de células control sin tratar (Fig. 5A], las células tratadas con EuPO 4 H 2 O nanorods (Fig. 5B], y las células tratadas con TbPO 4 H 2 O nanorods (Fig . 5C] se muestra. El EuPO 4 H 2 O nanorods útil tener una región de excitación de 250 a 535 nm con un máximo a 393 nm [26]. En este estudio, la microscopía confocal de fluorescencia imágenes y las imágenes de fase las células se obtuvieron a través de la utilización de un Zeiss LSM 510 láser confocal de barrido con un microscopio C-Apochromat 63 X / NA 1,2 de agua lente de inmersión en conjunción con un láser de iones de argón (488 nm de excitación). La emisión de fluorescencia se recogieron mediante un microscopio de 100X objetivo entonces espectralmente filtrada utilizando un 515 nm de largo pasa el filtro. Análisis de escaneo láser confocal de microscopía (excitación a λ = 488 nm), muestra la presencia de verde fluorescente estructuras dispersas en el citoplasma de las células compartimentos tratados con nanorods (Fig. 5B-C]. También se observó que había muy pocos verde fluoróforos (Fig. 5A] dentro de las células debido a la auto-fluorescencia que en la Fig. 5 (B-C], fluoróforos se observó claramente debido a la presencia de Eu 3 + y 3 Tb + Iones en cristalizado LnPO 4 H 2 O nanorods. En general, hay una diferencia significativa en fluorescencia entre las células control sin tratar (Fig. 5A] y nanorods células tratadas (Fig. 5B-C]. Estos resultados demuestran la internalización de LnPO 4 H 2 O nanorods dentro de 786 células-O. Se obtuvieron resultados similares cuando HUVEC fueron tratados con LnPO 4 H 2 O nanorods (datos no presentados). En el otherhand, un rojo de emisión que se esperaba de las células tratadas con EuPO 4 H 2 O nanorods. Lamentablemente, no pudimos distinguir la enorme intensidad de fluorescencia entre las células control sin tratar y tratada con nanorod células cuando se recogieron los espectros de emisión en rojo región. Por lo tanto, hemos recogido los espectros de emisión para EuPO 4 H 2 O-células cargadas en la región de emisión verde (515 nm de largo filtro de paso). Sin embargo, los experimentos confocal de fluorescencia para las mejores imágenes son actualmente objeto de investigaciones detalladas en nuestro laboratorio.

Excitación y espectros de emisión de EuPO 4 H 2 O y TbPO 4 H 2 O nanorods se detectaron en la longitud de onda recomendado por un spectrofluorometer, lo que indica que las propiedades de la nanorods se mantuvo sin cambios a la internalización en las células (Fig. 3A-B]. Sin embargo, para la microscopía confocal, las mismas longitudes de onda de excitación se recomienda no estaban disponibles en el instrumento. Por lo tanto, tomamos confocal de imágenes después de excitación a 488 nm y de emisión recogidos con un 515 nm de largo pasa el filtro. Hemos encontrado que después de excitación a 488 nm y se recoge el espectro de emisión con 515 nm de largo pasa el filtro, se produjo un importante y clara distinción entre la intensidad de fluorescencia de células no tratadas (Fig. 5A] y nanorod tratados con células (Fig. 5 -- C]. Sin embargo, después de escanear a través de una serie de diferentes longitudes de onda de excitación como se informa en la literatura [26], pero no hemos podido establecer una distinción clara entre la intensidad de fluorescencia de células sin tratar y tratada con nanorod células. Debido a que este es nuestro primer informe con los fosfatos inorgánicos lantánido (EuPO 4 H 2 O y TbPO 4 H 2 O) como una etiqueta fluorescente biológicas, no hay pruebas que demuestran que una emisión sea detectable con un 515 nm de largo pasa el filtro. Sin embargo, se informó en la literatura que una excitación de 488 nm de longitud de onda [26] fue utilizado en microscopía confocal para detectar las propiedades luminiscentes de Europio (III) de las nanopartículas.

La imagen de TEM 786-O células tratadas con EuPO 4 H 2 O nanorods se muestra en la Fig. 6. Esta cifra indica claramente que en la mayoría de las células, la absorción de estos nanorods ocurrido. Fig. 7A-C y Fig. 7D-F representan el TEM imágenes de células HUVEC tratados con EuPO 4 H 2 O nanorods y con TbPO 4 H 2 O nanorods, respectivamente, lo que demuestra que ambos nanorods podría entrar en el citoplasma compartimentos. La morfología de estas células también demostró claramente que estaban sanos después de la internalización de estos materiales (Fig. 6 y Fig. 7] aunque su forma esférica se debió a trypsinization, neutralización con TNS, y la fijación en Trumps solución para TEM. Del mismo modo, la morfología de los fluorescentes nanorods se mantuvo sin cambios después de la internalización. Se obtuvieron resultados similares cuando el 786-O células fueron tratadas con LnPO 4 H 2 O nanorods (datos no presentados). De la combinación de la Fig. 1D y Fig. 7F, parece que las pequeñas barras de verse en la Figura 1D no fueron internalizados por las células endoteliales como se ilustra con TEM (Fig. 7F]. Sin embargo, que no sea el más grande TbPO 4 H 2 O nanorods, algunos agregados varas eran visibles en el citoplasma. Es posible que estas pequeñas varillas agregado similar al cadmio a base de sales [32], pero son menos tóxicos sobre todo cuando es tomada por las células endoteliales.

Teniendo en cuenta nuestros resultados de la espectroscopia de fluorescencia, DIC, confocal, y TEM, hemos demostrado que estos fluorescentes nanorods puede ser internalizado en un sistema celular y son fácilmente visualizadas por microscopía. Estos nanorods luego ofrecer una alternativa útil como sondas fluorescentes para seleccionar los diferentes moléculas a células específicas. El mecanismo exacto para la internalización de estos nanorods sigue siendo poco claro, pero es objeto de investigación en nuestro laboratorio.

Dado que estos compuestos inorgánicos nanorods muestran fluorescencia actividad distinta a la internalización celular, hemos decidido utilizar estos materiales como una etiqueta fluorescente para HUVEC y 786 células-O. Hemos examinado su toxicidad in vitro con [3 H]-timidina incorporación ensayos [29] normal en las células endoteliales (HUVEC) y había determinado que no es tóxico (Fig. 8A-B]. Aunque hay indicios de que la exposición a ciertos nanomateriales podría dar lugar a efectos biológicos adversos, éste parece depende de las propiedades químicas y físicas del material [4, 27, 28]. El potencial de toxicidad de las nanopartículas inorgánicas fluorescentes se ha convertido recientemente en un tema de considerable importancia y el debate, sobre todo teniendo en cuenta la toxicidad in vivo es probable que sea un factor clave para determinar si las sondas fluorescentes será aprobado por los organismos reguladores para uso clínico en humanos. HUVEC proliferación [29], fue evidente que no afecta de internalización de los materiales hasta 50 mg / ml en comparación con las muestras de control (Fig. 8A-B], sin embargo, a concentraciones superiores a 50 mg / ml, se detectó nanorods a ser tóxico. Los experimentos se repitieron por triplicado y los resultados son reproducibles.

Para observar la viabilidad, HUVEC fueron tratados con 50 μ g / ml de Europio y terbium fosfato nanorods para 24-48 horas. No hubo diferencias en la muerte celular entre las células control sin tratar (sin tratamiento) y nanorod de células tratadas según la evaluación de trypan azul (datos no presentados). Estos resultados ilustran una biocompatibilidad entre los nanorods y las células.

Para investigar si la absorción de estos nanorods inducir la apoptosis, se analizaron las células endoteliales tratadas con LnPO4.H2O nanorods apoptosis mediante dos métodos: (i) usando microscopía de fluorescencia in situ Cell Death Kit de detección, TMR rojo (Roche, cat. N º # 12 156 792 910) y (ii) la citometría de flujo utilizando Annexin V-FITC Kit de detección de apoptosis (Biovision, Ref. N º K101-100). El TUNEL ensayo detecta la apoptosis inducida por la fragmentación de DNA, a través de un análisis cuantitativo de fluorescencia y se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. En el túnel de ensayo, el control positivo ha sido la apoptosis inducida en células por medio de camptotecina (~ 2,5 mM) durante 4 h de incubación (Fig. 9 (A-A2)]. El rojo-color (rojo-TMR núcleos teñidos) en apoptosis (Fig. 9A] se visualizaron bajo un microscopio, contados (6 campos por muestra), y fotografió utilizando una cámara digital de fluorescencia. El DAPI núcleos teñidos de azul aparecieron en la Fig. 9.A1 y Fig. 9.A2 muestra resultante de la fusión de imágenes FMI y DAPI de células teñidas. Los resultados del ensayo de TUNEL para el control sin tratar HUVEC y HUVEC células tratadas con LnPO 4 H 2 O nanorods se muestra en la Fig. 9B-D. En la primera columna (BD) de la Figura 9, no los núcleos de TMR-roja manchada células HUVEC se detectaron debido a la ausencia de apoptosis. Blue-DAPI manchadas núcleos se encuentran en la segunda columna (B1-D1) y la tercera columna (B2-D2) muestra imágenes de la fusionada. No hubo diferencias en el número de células apoptóticas (~ 0%) detectado en el experimento de control no tratados (Primera fila: B, B1 y B2), ni las células tratadas con EuPO 4 H 2 O nanorods (segunda fila: C, C1 y C2) y TbPO 4 H 2 O nanorods (tercera fila: D, D1 y D2). Los resultados de la Fig. 6 y Fig. 9 indican claramente que estas nanorods no eran tóxicas para las células endoteliales. Del mismo modo, el análisis de citometría de flujo arrojado ninguna diferencia en el número de células apoptóticas bewteen controles sin tratar y tratada con nanopartículas (datos no presentados).

Parak et al. [32] ha indicado que la toxicidad celular estable de los nanomateriales se debe principalmente a la agregación en lugar de la liberación de elementos Cd. Sin embargo, en nuestro caso, ya que estos nanorods se basan en un material totalmente diferente que el cadmio, su mecanismo es probable que sea diferente a la Cd basada en los materiales. Por lo tanto, si la toxicidad de Cd basado en materiales se debe a una acumulación de iones, que pueden no ser el caso de nanorods como el apoyo de nuestros datos.

Si bien no hay pruebas directas para el efecto de nanopartículas de tamaño sobre la internalización y la toxicidad, algunos informes indican que el tamaño de nanopartículas se trata de [28, 32, 33]. En nuestro caso, estamos estudiando en detalle y el mecanismo de citotoxicidad celular para la internalización de estos nanorods. Por último, debemos mencionar a nuestros experimentos, el control correcto sería no fluorescente lantánido compuesto de fosfato en lugar de células no tratadas. En estos momentos estamos trabajando en la síntesis de dicho reactivo. Junto con este trabajo, también estamos determinar: (a) el mecanismo de internalización, (b) la citotoxicidad de estas materias; (c) la photostability cuántica y la eficiencia de estos materiales, (d) la superficie de funcionalización de estas materias; ( e) la entrega de drogas el uso de estas nanorods modificaciones después de superficie, y (f) la comparación entre el fluorescente y no fluorescente lantánido compuestos de fosfatos en todos los experimentos.

Nanorods son estables a temperatura ambiente indefinidamente. Hemos realizado caracterizaciones químicas (XRD, TGA, DSC, TEM, propiedades de fluorescencia) en las muestras que son de 4-5 meses de edad y haber detectado ninguna diferencia entre los recién preparada nanorods y mayores muestras así como la ausencia de cualquier aglomeración.

Conclusión

Una nueva alternativa al tratamiento convencional tintes orgánicos, nos han informado de la utilización de compuestos inorgánicos fluorescentes EuPO 4 H 2 O y TbPO 4 H 2 O como una etiqueta fluorescente en la investigación biomédica. Hemos demostrado la internalización de EuPO 4 H 2 O y EuPO 4 H 2 O nanorods por tanto 786-O células HUVEC y utilizando la espectroscopia de fluorescencia (FS), DIC, microscopía confocal, y TEM. El nanorods se observaron principalmente para localizar en el citoplasma de las células compartimentos y no parece afectar negativamente la viabilidad celular ni cualquier inducir toxicidad después de la internalización. Estos único fluorescente nanorods ofrecer nuevos avances en la detección y diagnóstico para el tratamiento contra el cáncer en una etapa temprana y estamos trabajando actualmente en functionalizing estos nanorods así como la utilización de ellos como determinados tipos de vehículos para la entrega de drogas.

Experimental procedimientos
Materiales

Europio (III) de nitrato de hidrato [UE (NO 3) 3 XH 2 O, 99,99%], terbium (III) de nitrato de hexahidrato [Tb (NO 3) 3 6H 2 O, 99,999%], dihydrogenphosphate de amonio, [NH 4 H 2 PO 4 99,999%], se compraron de Aldrich, EE.UU.. [3 H]-timidina fue adquirido de Amersham Biosciences, Piscataway, NJ. 786-O se compraron las células de American Type Culture Collection (ATCC, TIB-186, Rockville, MD). Dulbeco la Modificación de Eagle's Medium (DMEM, 1X) fue adquirido de Cellgro, Mediatech, Inc, Herndon, VA, EE.UU.. Basal de células endoteliales Mediano (GBE), la vena umbilical humana células endoteliales (HUVEC) se obtuvieron a partir de Cambrex Bio Science alkersvile, Inc, MD, EE.UU..

Microondas con ayuda de síntesis de lantánido orto fosfato hidratos (LnPO 4 H 2 O)

Las nanopartículas inorgánicas fluorescentes (LnPO 4 H 2 O) fueron sintetizados mediante técnicas de microondas como se informa en la literatura [31]. En una típica síntesis, 20 ml de 0,05 (M) acuosa de NH 4 H 2 PO 4 se añadieron a 20 ml de 0,05 (M) de una solución acuosa de Ln (NO 3) 3 (Ln = Eu y Tb) en 100 ml de fondo redondo frasco. El pH de la solución antes y después de la reacción fue en el rango de 1,8 - 2,2. La muestra fue irradiada durante 20 minutos con el 50% de la potencia del instrumento. El aparato de microondas refluxing fue modificada horno microondas doméstico (GOLD STARR 1000 con un 2,45 GHz), descrito anteriormente [34]. En la etapa posterior a la reacción de tratamiento, los productos resultantes han sido recogidos, se centrifuga a 36303 g (20000 rpm con av r = 8,125 cm), se lava varias veces con etanol y agua destilada, y luego de un día para secarse al vacío a temperatura ambiente. El rendimiento de los preparados como los productos es más del 95%.

Experimentos de cultivo celular

HUVEC y 786-O células fueron cultivadas a 10 5 células / 2 ml en seis placas para así ~ 24 h a 37 ° C y el 5% de CO 2 en EBM DMEM completo y los medios de comunicación. Para investigar la localización celular (usando microscopio confocal), las células fueron chapados en tapa de vaso resbalones y crecido al 90% confluencia, y luego incubadas con LnPO 4 H 2 O nanorods en una concentración de 50-100 μ g / ml. Después de 20 h de incubación, la cubierta se desliza enjuagarse ampliamente con tampón fosfato salino (PBS) y las células fueron fijadas con recién preparada de paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego re-hidratados con PBS. Una vez que todas las células fueron fijadas, la cubierta se desliza montadas en portaobjetos de vidrio con Fluor Guardar montaje medios de comunicación y examinó con DIC y la microscopía confocal. Para la detección de la apoptosis mediante el ensayo de TUNEL (Roche, EE.UU., Cat. # 12 N º 156 792 910), las células fueron montados en portaobjetos de vidrio con montaje de los medios de comunicación que contiene DAPI (4'-6-diamidino-2-phenylindole).

En otra serie de experimentos, 786-O células HUVEC y (10 5 células / 2 ml) fueron cultivadas en seis platos y bien tratados con LnPO 4 H 2 O nanorods en DMEM correspondientes y los medios de comunicación GBE completa sin cubrir las caídas. Después de 20 h de incubación con la nanorods, las células fueron lavadas con PBS, trypsinized, y neutralizados. Las células fueron lavadas por centrifugación y re-suspendido en PBS y se analizaron con la espectroscopia de fluorescencia, TEM, y citometría de flujo (para la detección de la apoptosis de células por medio de annexin-FTIC-PI, Bio Vision, EE.UU., catálogo # K101-100). Célula de viabilidad para otro conjunto de células se determinó mediante la tinción con azul trypan y las células se contaron usando un hemocitómetro.

La proliferación de las células de ensayo

La proliferación de las células para medir la toxicidad in vitro se realizó con la [3 H]-timidina incorporación de ensayo, según informó a la literatura [29]. En resumen, las células endoteliales (HUVEC, 2 × 10 4) Se sembró en 24 y placas, cultivadas durante 2 días en EBM, el suero de hambre (0,1% suero) por 24 horas y, a continuación, tratados con diferentes concentraciones (1-100 μ g / mL) de LnPO 4 H 2 O (Ln = Eu, Tb). Después de 20 horas, 1 μ Ci [3 H] timidina se añadió a cada pocillo. Cuatro horas más tarde, las células fueron lavadas con PBS frío, fijado con un 100% de metanol frío, y recogidos para la medición de ácido tricloroacético-precipitable radiactividad [29]. Los experimentos se repitieron por triplicado y acompañada de todos los resultados son reproducibles.

Apoptosis ensayo

Las células fueron sembradas en 6 pozos de placas a una densidad de 2 × 10 5 / 2 ml de medio por pocillo y crecido durante la noche. Después de un tratamiento adecuado a estos nanorods (50 μ g / ml), las células fueron lavadas exhaustivamente con PBS y probado con la Annexin V-FITC Kit de detección de apoptosis (Biovision, Ref. N º # K101-100) por las instrucciones del fabricante. Además, la apoptosis también fue determinada por el ensayo TUNEL utilizando el In Situ Cell Death Kit de detección, TMR rojo (Roche, cat. # 12 N º 156 792 910). El rojo en apoptosis se visualizaron en un microscopio, contados (6 campos por muestra), y fotografió utilizando una cámara digital fluoresence.

Técnicas de Caracterización
La microscopía electrónica de transmisión estudio

Morfología de partículas (microestructuras de las muestras) se estudió con TEM en un FEI Technai 12 que operan en 80 KV. Para visualizar la internalización de las partículas dentro de las células, hemos folllowed la literatura publicada procedimientos [35, 36].

Microscopía de fluorescencia

La excitación y de emisión (fluorescencia) espectros se registraron en un Fluorolog-3 Spectrofluorometer (HORIBA JOBINYVON, Longjumeau, Francia), equipado con una lámpara de xenón como el monocromador fuente de excitación.

Contraste diferencial de interferencia microscopía (DIC)

Después de la fijación de células a cubrir los resbalones, las células fueron montados en portaobjetos de vidrio con Fluor Guardar montaje y examinó los medios de comunicación para DIC. Fotos fueron capturados con AXIOCAM digitales de alta resolución utilizando una cámara AXIOVERT 135 TV microscopio (Zeiss, Alemania).

Microscopía confocal de fluorescencia

Dos dimensiones de microscopía confocal de fluorescencia imágenes fueron recolectados a través del uso de LSM 510 láser confocal de barrido (o microscopio Carl Zeiss, Inc, Oberkochcn, Alemania), con C-Apochromat 63 X / NA 1,2 de inmersión en agua-lense, en conjunción con un láser de iones de argón ( 488 nm de excitación). La fluorescencia de las emisiones se ha recogido en un 515 nm de largo pasa el filtro.

Después de montar las células en portaobjetos de vidrio con DAPI, las imágenes se ha recogido en un LSM 510 láser confocal de barrido (o microscopio Carl Zeiss, Inc, Oberkochcn, Alemania) con un C-Apochromat 63 X/1.2 agua na-lente de inmersión. La fluorescencia de las emisiones fueron recolectados a través de una banda de 385-470 nm filtro pasa en conjunción con un láser de argón de iones de excitación de 364 nm para DAPI. La fluorescencia de las emisiones fueron recolectados a través de una banda de 560-615 nm filtro pasa en conjunción con una HeNe1 de iones de excitación láser de 543 nm para TMR rojo.

Autores de las contribuciones

CRP concibe el estudio y la hizo experimentos y análisis de datos. SP coordinado algunos experimentos en cultivos celulares. RB, SB, PM y también concibió el estudio y participó en su diseño y la coordinación y la ayudó a redactar el manuscrito. DM proporcionó orientación con el diseño experimental y preparación de manuscritos. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Agradecemos a los Dres. William Wessels, Franklyn Prendergast, Sutapa Sinha, Kaustubh Datta, Michael Muders, y Wang Enfeng para ayudar a sus científicos y el debate. También damos las gracias a Tarara J. y J. Charlesworth por su ayuda con el confocal y microscopía electrónica de transmisión, respectivamente. Este trabajo fue parcialmente apoyado por el NIH CA78383 subvenciones y HL70567 y también una donación de la Sociedad Americana del Cáncer a D. Mukhopadhyay.