Edad dependiente de la inducción de la inmunidad parlamentaria y los posteriores costes de la supervivencia en hombres y mujeres de un caballito del diablo templado

En las poblaciones naturales, muchas especies se acoge a una o más especies de parásitos, donde los parásitos son definidos de manera amplia para incluir los virus y bacterias. Sin embargo, no todos los organismos parásitos provocan una respuesta inmune de los individuos de una especie hospedadora [1, 2]. Además, la respuesta inmune y el grado de resistencia a menudo varían entre los ejércitos, incluso cuando la misma especie de parásito es objeto de seguimiento en estudios observacionales o experimentales utilizados en problemas [3 - 5]. La investigación se ha centrado ahora en los intrínsecos y extrínsecos factores que explican esta variación en la respuesta inmune entre los anfitriones y las consecuencias de la resistencia a tanto parásito y huésped los individuos y las poblaciones [5 - 7].

Evolutiva ecologistas han adoptado diversos enfoques para tratar de explicar dentro de la población variación en la respuesta inmune y la resistencia de expresión. Por ejemplo, los investigadores han examinado la medida en que la resistencia es hereditario y de acogida si las respuestas son específicas al parásito cepas utilizadas [8, 9]. Otros investigadores han considerado la idoneidad de beneficios inmune como la defensa se comercializan fuera en contra de otros rasgos, un método utilizado en el ensayo de las predicciones de la vida-la teoría de la historia [7, 10]. Es importante destacar que los costos de la resistencia intrínseca pueden incluir gastos de mantenimiento de componentes inmunes a la espera de parasitismo y / o costos de inducción, es decir, iniciar y activar una respuesta inmune. Es este último los costos que a menudo se ponen de manifiesto de vertebrados e invertebrados en respuesta a los desafíos de parásitos o sustitutos de parasitismo (por invertebrados, la inserción de un filamento de nylon o de inyección de lipopolisacáridos en solución) [11, 12].

Los costos de la resistencia se espera que sean dependientes de contexto, sólo un problema identificado recientemente [13]. Un estudio para examinar contexto dependiente resistencia comprobó que mueren de inanición o inmune impugnada abejorro trabajadores presentaron menor supervivencia que cualquiera de los dos alimentados y desafió a los trabajadores o de hambre a los trabajadores que no fueron impugnadas [14]. Ese estudio y más reciente trabajo [15] ha puesto de relieve el hecho de que el éxito de los parásitos y sus efectos sobre sus anfitriones, también debe referirse al medio ambiente pertinentes factores externos.

En condiciones naturales, los insectos son sometidos a horas o días cuando se limita la búsqueda de alimento como resultado de la variable o las inclemencias del tiempo. Ejércitos menos capaces de adquirir la dieta recursos pueden montar posteriormente una menor efectividad de la respuesta inmune [16, 17]. La temperatura también puede desempeñar un papel clave en la respuesta de acogida a parasitismo [5]. Sin embargo, poco se sabe de los costos de la resistencia cuando las temperaturas, en virtud del cual la resistencia se expresa, no se mantienen. Esperamos que cuando las condiciones meteorológicas son "buenos" (los recursos no está limitado y las temperaturas son óptimas) resistir insectos parásitos. Sin embargo, ¿qué ocurre si los insectos son sometidos a "pobres" condiciones después de la asignación de recursos a la resistencia? Resistencia costes no podrá hacerse realidad a menos que el anfitrión expresando resistencia posteriormente se impugnó el medio ambiente; además, estos gastos también puede depender del tipo de inmunidad inducida y la magnitud de la inducción.

Se han realizado varios estudios que examinaron la inmunidad de insectos, sin embargo, las pautas de cómo responder a los insectos inmunes retos son incompatibles y, a menudo se relacionan con el inmunológico rasgos ensayados [18 - 22]. Como un componente principal de la inmunidad de invertebrados, que circulan hemocitos están involucrados en el reconocimiento, la fagocitosis y la encapsulación de invadir parásitos y agentes patógenos [23, 24]. La activación de la pro-fenoloxidasa en cascada para producir melanina es un componente clave del sistema inmune de invertebrados (la producción de melanina tiene efectos citotóxicos y propiedades antimicrobianas [25]]. Además, anti-microbiana péptidos puede producirse en respuesta a un insulto inmune [25].

El principal objetivo de este estudio fue examinar la idoneidad de costes directos en relación a la inducción de una respuesta inmunitaria (s) para los adultos de la templada y la pronta aparición caballito del diablo, Enallagma boreale Selys. Para asegurar nuestro experimento incluyó las condiciones del medio ambiente (por ejemplo, los períodos de "bueno" el clima seguido por las sucesiones de días de "pobre" clima), lo primero que se evaluó la variación local de temperatura y precipitaciones durante la aparición y el período de vuelo de E. boreale durante cuatro anteriores aparición de vuelo y los períodos (2001-2004). Ambas bajas temperaturas y periodos de fuertes lluvias impedir los intentos de forrajeo de damselflies en condiciones naturales y, por lo que consideró "pobres" condiciones meteorológicas [26]. Damselflies eran inmunes desafió con una dosis de inmunogénica lipopolisacárido (LPS) en solución salina y que se les permita responder a un medio ambiente pertinentes "buena" la temperatura. LPS o pared celular bacteriana componentes son conocidos para inducir una respuesta inmunitaria en varios otros insectos sin el efecto patógeno de la bacteria (por ejemplo, [14]]. Para garantizar LPS indujo una respuesta inmunitaria en E. boreale, se analizan los rasgos inmune de una submuestra de LPS-inyectado y control (solución salina-inyectada) E. boreale. Estamos ensayaron tres aspectos fundamentales de inmunidad de los insectos: haemocyte concentración, fenoloxidasa (PO) y la actividad antibacteriana. Nuestra expectativa es que al menos uno de estos la respuesta inmune sería inducido a niveles superiores cuando E. boreale eran inmunes en tela de juicio. El resto de damselflies impugnado posteriormente fueron sometidos a un medio ambiente pertinentes "pobre" la temperatura y la privación de alimentos. Para examinar si los costes de inducción inmune se realiza cuando un individuo es responder posteriormente sometido a "pobres" condiciones del medio ambiente, se evaluó la supervivencia a temperaturas más frías. La reducción de la longevidad de adultos se espera a temperaturas más frías y se esperaba que se relacionan con el nivel de inducción inmune.

Sexo diferencias en la inmunidad están presentes, y puede entenderse por referencia a la física o sexual en la selección de sexos [10, 27]. Sin embargo, actualmente no existe una pauta general de las diferencias de sexo inmune de los insectos de inversión, tal como se ha sugerido para los mamíferos [28]. No obstante, anfitrión del sexo es un factor importante a considerar cuando se analizaron la respuesta inmune y, en última instancia, o costo evolutivo de la resistencia en previsión de parasitismo [29]. Al igual que ocurre con muchas especies de insectos, hombres y mujeres difieren damselflies en la vida-las estrategias de la historia: los hombres parecen forraje para obtener recursos suficientes para la actividad de apareamiento las hembras mientras que el forraje para obtener mayores recursos para la producción de huevos y, por ende, aumentar de peso durante la madurez [30]. Por supuesto, la cuestión más importante es si la aptitud para las relaciones difieren longevidad para los hombres o las mujeres que conduzcan a la expectativa de una mayor longevidad y la inmunidad en uno u otro sexo.

Los costos de la resistencia y / o la inducción de la defensa inmune también se espera que se refieren a la edad del huésped. Damselflies tiene dos etapas distintas de adultos, recién aparecido (dentro de las 24 h de aparición) y reproductivamente maduros [31]. Recién surgido damselflies debe asignar recursos a cuticular endurecimiento, así como lidiar con los parásitos y agentes patógenos. Enzima las vías utilizadas en la producción de melanina para la defensa inmune son similares a los utilizados en cuticular endurecimiento [23, 32]. De este modo óptimo de las inversiones en la inmunidad puede verse limitada por el proceso de maduración. Por otra parte, con base en las observaciones de cuatro años anteriores, recién surgido damselflies se espera que la experiencia más frecuentes y rachas de las inclemencias del tiempo (véase métodos). En comparación, reproducidos por los adultos maduros tienen que lidiar con los costos de reproducción, así como los gastos de defensa en caso de responder a desafío de parásitos y / o agentes patógenos. Sin embargo, los adultos maduros se espera que sean más activos más tarde en la temporada cuando las condiciones climáticas deberían ser más favorables (véase métodos). Por otro caballito del diablo Lestes virdis, inmune a las diferencias entre los parámetros recién surgido y maduro damselflies se encontraron y como explicó relacionada con la edad las diferencias en la vida-historia trade-offs [33]. El costo de inducción inmune también puede ser dependiente de la edad que reflejan los patrones óptimos de asignación de energía durante la maduración. Por ejemplo, las diferencias de sexo son evidentes inmunidad para madurar Scathophaga stercaria moscas, sin embargo, esta diferencia de sexo no se ha encontrado de nuevo surgieron las moscas [34]. Esta incoherencia entre madura y recién surgido las moscas se explicó como consecuencia de sexo-específicas necesidades fisiológicas que son dependientes de la edad.

Como parte de nuestro objetivo principal, específicamente en comparación E. boreale hombres y mujeres de recién creados y reproducidos por adultos como por la sospecha de ambos edad y el sexo que influyen en el tipo y la magnitud de expresión inmune y posteriores costes de inducción inmune. Múltiples medidas de inmunidad garantizada la identificación de diferencias en los rasgos específicos inmune expresó entre hombres y mujeres dentro de cada categoría de edad. Supervivencia, como una medida del costo de la resistencia inmune mediada por inducción, se evaluó para el control y experimental personas, que fueron recién creados o reproductivamente maduros machos o hembras.

Inmune parámetros no son correlacionados para recién creados (r variaron entre 0.02-0.35, p valores oscilaron entre 0.10-0.92) o adultos (r osciló entre 0.008-0.35, p valores oscilaron entre 0,08-0,94), por lo tanto, cada variable dependiente se analizó por separado .

Haemocyte de concentración (cells/0.2 μ l) no difirieron entre los tratamientos o entre los sexos de recién surgido E. boreale (Figura 1a, sexo F _1,21 = 2,77, p = 0,11, el tratamiento F _1,21 = 1,07, p = 0,31, la interacción F _1,20 = 0,36, p = 0.55). Sin embargo, ambos recién surgido hombres y mujeres tienen un mayor índice de melanisation (MI; nuestro sistema para medir la actividad del PO, según se detalla en los métodos) cuando se inyecta con LPS versus solución salina (Figura 2a, sexo F _1,22 = 1,59, p = 0,22, tratamiento F _1,22 = 4,21, p = 0,05, la interacción F _1,21 = 0,16, p = 0,70). Para evaluar la actividad antibacteriana, varias placas fueron sembradas con bacterias (ver métodos). El control de la variabilidad en el crecimiento bacteriano entre las placas, se produjo un sexo por la interacción de tratamiento cuando se comparan actividad antibacteriana de LPS y se inyecta solución salina recién surgido hombres y mujeres (sexo F _1,1 = 352,83, p = 0,03, el tratamiento F _{1, 1} = 0,002, p = 0,97, la interacción F _1,1 = 4984,91, p = 0,009). Las mujeres y los hombres no inyectados con LPS ha acentuado actividad antibacteriana (Figura 3a].

Pareja hombres y mujeres inyectadas con LPS tenía haemocyte una mayor concentración salina que se inyecta congéneres (Figura 1b; sexo F _1,57 = 1,64, p = 0,21, el tratamiento F _1,57 = 24,07, p <0,001, la interacción F _{1, 56} = 1,62, p = 0,21). El MI solución salina para ambos y LPS inyectado hembras maduras fue significativamente superior a conspecific hombres, pero no hubo efecto del tratamiento (Figura 2b; sexo F _1,54 = 4,09, p = 0,04, el tratamiento F _1,54 = 1,03, p = 0,32 , La interacción F _1,53 = 2,08, p = 0.16). Pareja mujeres tenían una mayor actividad antibacteriana que los hombres cuando para controlar la variabilidad entre las placas bacterianas (Figura 3b; F _1,8 = 5,15, p = 0,05). No hay diferencia en la actividad antibacteriana entre los tratamientos se observó para madurar damselflies (Figura 3b; F _1,8 = 0,09, p = 0,78, la interacción F _1,8 = 2,41, p = 0.16).

Recién salido de adultos E. boreale inyectados con LPS no tenían una menor supervivencia de congéneres inyectados con solución salina (Figura 4 bis; ANOVA F _1,88 = 0,72, p = 0,40). Sin embargo, recientemente ha surgido mujeres sobreviven más que los varones en ambos tratamientos (Figura 4 bis; F _1,88 = 3,95, p = 0,05, la interacción F _1,88 = 0,62, p = 0.43). Supervivencia de E. maduro boreale fue menor en el LPS de tratamiento en comparación con solución salina inyectada congéneres (Figura 4b; ANOVA F ₁₁₁₇ = 5,81, p = 0,02). Al igual que el recién surgido E. boreale, hembras maduras vivido más tiempo que los hombres conspecific en ambos tratamientos, sin embargo, el resultado sólo se acercó importancia (Figura 4b; F ₁₁₁₇ = 3,54, p = 0,06, la interacción F ₁₁₁₇ = 0,04, p = 0,83).

Un coste de inducción inmune en términos de longevidad de adultos era evidente para inmune impugnada madura E. boreale cuando se someten a bajas temperaturas y la privación de alimentos. Hubo aproximadamente el 25% de reducción en la supervivencia de adultos (de una media de 3,88 a 2,94 d d) cuando desafió damselflies inmune se compararon con los controles inyecta solución salina. Otros dos estudios han encontrado resultados similares a los que la activación del sistema inmune con LPS abejorros en adultos [14] y los hombres de campo grillos [35], se redujo la supervivencia. FELLOWES et al. [36] también encontraron larvas de Drosophila que había una reducción de capacidad competitiva que probablemente conduce a la reducción de la supervivencia cuando se seleccionó la resistencia. Los costes no se limitan sólo a este desafío inmunológico (LPS) y inmunológico de expresión; a la inducción de la encapsulación celular de un cuerpo extraño, Tenebrio molitor mujeres ha bajado de supervivencia en comparación con el control de las mujeres [37]. Nuestros resultados sugieren que en condiciones naturales, madura damselflies iba a pagar el costo de la resistencia cuando se enfrentan posteriormente con las malas condiciones meteorológicas. Por esta particular E. boreale población, hay muchas ocasiones en las rachas de mal tiempo siga el buen tiempo (Figura 5], pero éstos fueron más restringido a los períodos de aparición. Es importante destacar que la resistencia contra los ácaros parásitos (una de las parasitosis más frecuentes con las asociaciones de adultos Odonata [31]], cuando se inició, se produce a caballito del diablo aparición [38]. En comparación, madura E. boreale, similar a otras damselflies, ingerir parasitarias gregarines cuando la alimentación [39]. Aunque todavía no está claro cómo o si damselflies responder a gregarines en el intestino, nuestros datos sugieren que las investigaciones futuras deberían investigar si madura damselflies responder a gregarines han bajado de supervivencia, cuando se enfrentan a las inclemencias del tiempo.

Una cuestión de interés es la razón por la supervivencia de los recién creados impugnada E. boreale no fue significativamente inferior en comparación con los controles, indiscutible. Todavía hay un cierto debate en cuanto a si los costos de la resistencia debería producirse, a pesar de pruebas en los últimos estudios de trade-offs en contra de otros rasgos como la capacidad competitiva o tasa de maduración [véase [12, 40]]. Una explicación de nuestra falta de encontrar un costo en recién surgido es que los adultos recién surgido damselflies debe lidiar con los ácaros parásitos del agua, además de reparar las heridas infligidas por los ácaros del piercing la cutícula (la melanina es a menudo observado en la fijación de cada ácaro; T. Robb observación personal). Secundaria a la infección por el ácaro archivo adjunto puntos también pueden ocurrir. Para otros insectos anfitriones, el riesgo de exposición, así como el tipo de desafío de un individuo está expuesto a ha explicado cómo la inversión en la inmunidad se ha optimizado y, posteriormente, cómo los costos de la resistencia se reduzca al máximo [41, 42]. Se espera que recién surgido E. boreale con un alto riesgo de parasitismo han asignado más recursos a los posibles respuestas inmunes que han maduro reproductiva E. boreale.

Otra explicación se refiere a la naturaleza de los gastos de resistencia. En emergencia, damselflies debe invertir en cuticular endurecimiento, un proceso que utiliza la misma enzima vías (es decir, propuestas en cascada) como la producción de melanina utilizados en la defensa inmune [23, 32]. Por lo tanto, un coste más probable de la resistencia o en la reparación de heridas recién surgido damselflies ya veces es para cuticular endurecimiento después de la eclosión. También es importante que surgió recientemente E. boreale respondió a las inmune desafío por los crecientes niveles de actividad PO y mujeres respondieron con un aumento de la actividad antibacteriana, sin embargo, individuos maduros respondió a la LPS desafío con un aumento significativo en haemocyte concentración (Tabla 1]. Esta diferencia en la activación inmune también puede ser en parte responsable de nuestra incapacidad para encontrar un costo de la inducción de inmunidad en virtud de las condiciones del medio ambiente para recién surgido damselflies. Damselflies recién surgido también tienen más probabilidades de encontrar las malas condiciones meteorológicas, en particular durante largos períodos de tiempo en este estudio la población (Figura 5]. En respuesta a parasitismo en buen día no parece representar un costo para el recién surgido E. boreale cuando las inclemencias del tiempo siguiente. De hecho, en virtud de baja temperatura y la reducción de forrajeo condiciones recién surgido E. boreale podría vivir hasta un máximo de diez días a 15 ° C, a pesar de la respuesta inmune a un desafío (típico caballito del diablo es la vida útil hasta 23 d [31]].

Ambos recién surgido y hembras maduras no viven más que los hombres en ambos grupos de tratamiento. Un organismo de mayor tamaño (especialmente en masa) podría explicar la mayor supervivencia femenina en comparación con congéneres masculinos para ambos recién surgido y maduro E. boreale. Para hembras maduras, reabsorción del huevo también puede ocurrir para mantener la longevidad siguiente resistencia expresión [43]. En comparación, inmune impugnada reproductiva femenina Tenebrio molitor escarabajos sufrido reducción de la longevidad, manteniendo al mismo tiempo la fecundidad [37]. Se espera que el embrague tamaño es menos importante para el éxito reproductivo de las mujeres damselflies que es el número de nidadas durante su vida [44] - esto puede no ser el caso de T. Molitor mujeres.

Sexo inmune a las diferencias eran evidentes las medidas que había hembras maduras significativamente mayores niveles de actividad de PO cuando es cuestionado o no en comparación con los hombres conspecific. Ambos hemocitos y PO están involucrados en sclerotization o curtido de las cubiertas del huevo (que participan en la viabilidad de huevos) en invertebrados [45, 46]. De este modo, el aumento de rasgos inmune como haemolymph PO actividad en las mujeres pueden no ser indicativas de una mayor inmunidad, sino más bien un efecto secundario de una mayor necesidad de melanina. Las diferencias en actividad antibacteriana se observaron entre los sexos recién surgido sólo en respuesta al desafío inmunológico. Sin embargo, el sexo no se observaron diferencias entre el recién surgido E. boreale en nuestras medidas de actividad o PO haemocyte concentración. Nuestros resultados fueron similares a la que se encuentra para la no-territorial caballito del diablo, Lestes viridis, donde recién surgido y maduro damselflies demostrado ninguna diferencia en haemocyte totales, pero sólo cuando PO actividad fue mayor en hembras maduras que los hombres conspecific [33].

No hemos encontrado ninguna prueba que sugiera el costo de inducción inmune difiere entre hombres y mujeres. Este es un resultado sorprendente como el trabajo previo ha indicado mujeres inmune inversión es a menudo mayor que la inversión de sexo masculino [19, 21, 33, 47]. Varias hipótesis se han propuesto para predecir el sexo de invertebrados las diferencias en inversión en la inmunidad. Las mujeres se espera que inviertan en la producción de huevos, mientras que los machos deben competir para fertilizar huevos. Además, Rolff [48] sugirió que asuman una mayor longevidad de vida aumentará la producción de huevos; las mujeres va a invertir más en comparación con la inmunidad conspecific hombres. Por otra parte, los hombres downregulate o suprimir la inmunidad como resultado de costosos ornamentos sexuales secundarios y el comportamiento [49, 50]. Recientemente, McKean y Nunney [15] han sugerido que las diferencias de sexo en la resistencia de inversión surgen de hombres y mujeres respuesta diferencial al medio ambiente: un tema de considerable importancia para el presente estudio. Asimismo, sugieren el costo de la resistencia dependerá no sólo de la inversión en la reproducción, sino que también se refieren a la variación en la aptitud de limitación de la disponibilidad de recursos. Nuestros datos sugieren que, si bien la asignación a diferentes parámetros inmunes maduras entre hombres y mujeres, no hay diferencias detectables en los costos de inducción inmune (de supervivencia) a pesar de ser sometido a malas condiciones de manera similar (Tabla 1].

Los resultados sugieren que los costos de inducción inmune no dependen sólo del tipo y la magnitud de la inversión en la inmunidad. Se encontró que los costos de inducción inmune en términos de longevidad eran evidentes para damselflies maduro, pero no para recién surgido damselflies. La variación de las condiciones climáticas normalmente experimentada por diferentes individuos con edades comprendidas en este templado caballito del diablo, el tipo de expresión inmune, y cuando la resistencia contra el parasitismo suele ser montado, es probable explicación para la edad relacionadas con las diferencias en relación con los problemas experimentales que hemos observado. Es importante que la pertinencia del medio ambiente de condiciones de laboratorio están bien fundadas para futuros estudios sobre los costos de inducción inmune en el laboratorio.

Un aspecto importante de este estudio era asegurarse de que nuestros métodos de ensayo para los gastos de inducción inmune se ecológicamente pertinentes. Una norma Stevenson pantalla a 1,5 m de altura con un Campbell Ciencia 21X de datos estaba en funcionamiento cerca de nuestra colección sitio (Queen's University Estación Biológica) y se utilizó para obtener datos de temperatura. La temperatura se registró en cinco segundos, lo que nos permite examinar las temperaturas medias por hora de 0400 a 1900 h h (lo que representa el amanecer hasta el atardecer o posibles tiempos de forrajeo E. boreale en nuestra región de estudio, cf. [51]]. La media de temperaturas por hora por cada día fueron examinados durante el período de aparición de tenerals así como período de vuelo de adultos maduros (aproximadamente el 15 de mayo a 15 de junio) para los cuatro años anteriores (2001-2004) para el estudio. Se evaluaron diariamente grandes medios de la media hora de temperaturas para cada día por la aparición de vuelo y los períodos de E. boreale en el área de estudio (Figura 5]. También se determinaron las precipitaciones durante la luz del día el tiempo de forrajeo E. boreale. La mala meteorología días se determinará como el diario de la temperatura media inferior o igual a 15 ° C, y / o cuando más de 5 mm de lluvia se produjeron fuertes lluvias que indica y la prevención de los períodos de búsqueda de alimento.

Estábamos interesados en episodios de dos o más días sucesivos donde diariamente grandes temperaturas medias de 15 º C o inferiores y / o se caracterizaron por las fuertes lluvias. Se encontraron 11 de esos episodios (la mediana de duración fue de 3 d; inter-cuartil serie fue 2-9 d). Estos episodios se pueden ver mediante el examen de la Figura 5. Seis de esos episodios fueron durante los períodos de aparición de E. boreale, mientras que tres fueron ataques durante los períodos de vuelo y los dos restantes episodios entre corchetes la aparición de vuelo y períodos. La media diaria de temperatura en los días anteriores a cada uno de los episodios osciló entre 16-22 ° C (para los diez episodios donde las temperaturas se registraron el día anterior). La temperatura máxima diaria durante el tiempo de forrajeo la luz del día para esos días osciló entre 18-26 ° C. Sobre la base de estos datos, hemos elegido 22 ° C de la casa LPS-y se inyecta solución salina-damselflies inyectado durante un día y 15 ° C para posteriormente casa damselflies siguientes inmune frente a los desafíos de control de las inyecciones.

Enallagma boreale es una organización no-territorial caballito del diablo con un sistema de apareamiento que puede definirse como lucha mate competencia [52]. E. boreale se encuentra en todo el este de Ontario en castor estanques y pantanos de agua dulce [53]. La aparición de E. boreale generalmente comienza a finales de mayo y los adultos maduros están presentes a través de mediados a fines de junio [53]. Al igual que con muchos libélula caballito del diablo y las especies, E. boreale están sujetos a parasitismo larval de agua ácaros (Acari: Hydrachnida). Durante aparición de acogida, los ácaros de transferencia de agua a las nuevas eclosed adultos damselflies y convertirse en parásitos [54]. Los ácaros engorge de acogida durante el periodo de maduración y volver al agua durante la reproducción de acogida. Anfitrión resistencia a parasitismo (melanotic encapsulación de los ácaros de alimentación con resultado de muerte del ácaro) se llevará a cabo durante las primeras 24-48 h después de la emergencia [4].

Masculino y femenino E. boreale se obtuvieron de Jack's Marsh cerca de la Queen's cerca de la estación de Biología Chaffeys bloqueo Ontario, Canadá (44 ° 34 'N, 79 ° 15' W). Damselflies surgido recientemente fueron recogidos en una base diaria desde el 28 de mayo y del 1 de junio de 2005 entre 1.000 h y las 12.00 h. Para las colecciones de adultos maduros damselflies, la primera recogida personas que deben observarse en conjunto, garantizando los hombres y las mujeres fueron reproducidos por madurar y dentro de un grupo de similar edad [31]. Recogimos reproductivamente maduros damselflies en 6-8 y 10-11 de junio de 2005 (no se observaron adultos en paralelo a las 9 de junio entre 1.000 h y las 12.00 h). Hemos intentado reunir a un número igual de damselflies cada día. En total, 118 recién surgido y 180 reproductivamente maduros E. boreale fueron recogidos. Cada día damselflies fueron traídos de vuelta a la Reina de la Estación de Biología (a 15 min de la colección del sitio) en jaulas de insectos (30 cm × 30 cm × 40 cm) y se coloca en un lugar fresco (aproximadamente 18 ° C) habitación oscura durante una hora . Los individuos fueron pesados (± 0,001 g; Mettler AE100 Digital Scale) y se coloca en copas de plástico (volumen aprox. 255 ml) cubiertas con papel de aluminio. Cada vaso de plástico contenía 2 ml de agua en virtud de una pantalla de malla metálica para evitar el ahogamiento del caballito del diablo y una vara de madera fue colocado en la copa para proporcionar una perca. En este momento, se enumeran los ácaros parásitos de agua a cada persona que utiliza un 20 × lupa.

Hemos asignado dos recién creados y utilizados madura damselflies inmune a los parámetros de ensayo a los grupos de tratamiento (LPS o se inyecta solución salina) dentro de un sexo garantizar que no hay diferencias en nuestras medidas de tamaño corporal, longitud de ala y de masa corporal (p valores van desde 0,22 a 0,98 ). Antes de evaluar la supervivencia, también asignado hombres y mujeres para garantizar los tratamientos no hubo diferencias en la masa media o ala longitud entre los grupos de tratamiento dentro de un sexo (Cuadro 2].

Parasitarias agua ácaros (Arrenurus spp.) Observado en algunos damselflies no puede ser removido antes de la experimentación sin causar mayor estrés. Por lo tanto, asegurarse de que el número de ácaros en recién surgido E. boreale no difirió entre los grupos de tratamiento para cada sexo antes de los ensayos de parámetros inmunes (ceros se incluyeron en los análisis; hombres, W = 16, p = 0,99, n = 10; hembras, W = 28,5, p = 0,23, n = 16 ) Y el experimento de supervivencia (Tabla 2]. También asegurarse de que el número de individuos maduros E. boreale con ácaros fue similar entre los grupos de tratamiento para cada sexo antes de parámetros de ensayo inmunológico y antes de realizar el experimento de supervivencia. Sin embargo, no significa comparar estadísticamente ácaro intensidad entre los tratamientos como los niveles de infección son bajas (ver leyenda de la Tabla 2]. De los 60 maduro damselflies utilizados para evaluar los parámetros inmunes 5 ha ácaros-1 femenino, con 14 ácaros y 1 varón y 1 ácaro en el tratamiento LPS, mientras que 1 mujer con 18 ácaros y 2 hombres y 1 cada ácaro fueron asignados a tratamiento la solución salina. Ocho madura damselflies utilizados en el experimento de supervivencia había ácaros de los 120 en total, o aproximadamente el 7% (Cuadro 2]. Estas personas no se esperaba por objeto influir en los análisis porque eran pocos en número de ácaros y sus números fueron similares en todos los tratamientos. Sin embargo, los análisis se realizaron sin esas personas, pero no cambió el resultado global (ver Resultados).

Para evaluar si la activación de uno o más parámetros inmune se produce a 22 ° C, 16 recién creados y 10 hembras recién surgido hombres y 30 hembras maduras y maduras 30 hombres fueron examinados. Damselflies utilizados para evaluar la inducción inmune no se utilizaron en experimentos de supervivencia. Para evaluar si un parámetro es inmune inducida, en comparación Lippolysaccharide (LPS)-se inyecta a las personas-se inyecta solución salina controles. Tres ensayos se realizaron para evaluar la activación inmune de cada individuo y se completaron todos al mismo tiempo que los experimentos de supervivencia.

Cada persona asignada a LPS-inyectado grupo fue inyectado a través de la superficie ventral de la metaepimeron con 0,5 μ l de 0,5 mg / ml de LPS (Sigma) disuelto en helado de insectos timbres solución salina utilizando un calibre 32 de jeringa de Hamilton (Hamilton Company). Las personas asignadas al tratamiento de solución salina se inyecta de manera similar pero con 0,5 μ l del insecto timbres solo suero salino. Activación inmune se logró mediante la inyección de LPS y las personas fueron alojadas en 22 ° C durante 12 h. Hemos elegido 22 ° C para asegurar una respuesta inmune se produjo dentro de las 24 h. Esta temperatura también fue elegido por razones detalladas anteriormente y porque se trata de una temperatura ideal en la que los adultos damselflies podría ser alojados (T. Robb, observación personal). Después de 12 horas a 22 ° C, inmediatamente recogida de haemolymph el tórax de cada inyectada caballito del diablo empujando 40 μ l de sodio helada cacodylate buffer (0,01 M cacodylate de sodio, 0,005 M de cloruro de calcio, pH 7.4) a través del tórax utilizando un calibre 26 Hamilton jeringa. El haemolymph de amortiguación y se recogen en un 1,0 ml Eppendorf celebrada el hielo. De esta mezcla de haemolymph de amortiguación y quitamos 10 μ l de haemocyte contar y el resto fue congelado a -30 ° C para interrumpir hemocitos para la medida de la actividad PO y actividad antibacteriana. El número de hemocitos se determinó a través de una mejor hemocitómetro Neubauer.

Fenoloxidasa actividad fue determinada por la cuantificación de la conversión de L-3 ,4-dihydroxyphenylalanine (L-dopa) para catalizada por la melanina PO [55]. Papel de filtro (Whatman No.52) cortadas en mitades fue empapado en 2 mg / ml de L-dopa (Sigma) en un cacodylate buffer de sodio y 6 μ l del caballito del diablo haemolymph solución se aplicó en el centro de su papel de filtro. Las muestras se conservarán durante 30 minutos a temperatura ambiente y el papel de filtro húmedo, se mantuvo con más L-Dopa solución para permitir que el exceso de sustrato para la reacción a ocurrir. Las muestras fueron luego transferidos a toalla de papel limpia y deja secar. El resultado final fue una circular melanised terreno en el papel de filtro como resultado de la PO presentes en la solución haemolymph. La actividad PO se cuantificó mediante el cálculo de una media de los valores en escala de grises para la melanised región. La adición de amortiguación por sí sola no en color (melanisation), indicando la melanina se produjo como consecuencia de la PO en la haemolymph. Múltiples piezas de papel de filtro fueron digitalizadas mediante un escáner Cannon (CannoScan 9900F) fijado en 200 dpi, en escala de grises 8 bits por color, el tono no automáticas curva de nitidez y alta (60%). Para cada muestra una media en escala de grises pixel valor de una circular región (364 píxeles) a la estimada visualmente centro de la melanised terreno se determinó a través de UTHSCSA ImageTool programa Versión 3,0 [56]. Un crudo significa el valor de píxel (RMPV) se calcula restando la media en escala de grises pixel valor de 255; por lo tanto, un valor de 255 representados negro y blanco representados 0. Para convertir los valores RMPV a una medida normalizada la actividad de PO o el índice de melanisation (MI) un nivel de tinta solución India (Faber-Castell de agua dibujo de tinta no 4415) se utilizó. La media de tres RMPVs alícuotas a las doce de dilución de los niveles de tinta India solución se determinó usando los métodos anteriores (dilución gama de niveles sin diluir a un factor de dilución de 2 ^-12, en decrements de potencias de 2) y el mejor ajuste de la función curva (dilución frente a RMPV) se calculó. El MI caballito del diablo para cada muestra se calcula como e IM = [(RMPV - b) / m] * 100% (donde m es la pendiente de la función de mejor ajuste y b es la interceptar). Para cada uno de los MI para las tres muestras se determinó la media y la MI se ha utilizado para la comparación de LPS se inyecta solución salina inyectada frente a los controles.

Péptidos antibacterianos también se producen en respuesta a la infección y puede medirse por las pruebas haemolymph eficacia a matar bacterias vivas (por ejemplo, [14]]. Actividad antibacteriana del caballito del diablo haemolymph se determinó a través de una zona de ensayo de inhibición contra las bacterias Arthrobacter globiformis. Métodos similares se completaron a Moret & Schmid-Hempel [14]. Prueba de placas (5 para el recién surgido y 12 para adultos) se hicieron mediante la adición de 0,05 ml de A. globiformis (10 ⁵ células / ml) y 5 ml de agar nutriente y las placas se swirled bacterias para distribuir uniformemente. Las placas fueron la izquierda para liquidar a temperatura ambiente y luego al revés almacenada a 4 ° C por hasta dos días antes de su uso. Seis piezas de circular esterilizados papel de filtro (6,29 mm de diámetro) se colocaron en cada placa de prueba y 6 μ l del caballito del diablo haemolymph pipeta se mezcla en un solo papel de filtro. Colocación de las muestras en cada plato y entre las placas fue al azar para garantizar cada plato había muestras de ambos tratamientos para cada sexo. En cada placa, un control negativo que consta de 6 μ l de buffer solo se pipeta en un solo papel de filtro. Las placas fueron incubadas a boca abajo a 28 ° C durante 24 h. El diámetro de la zona clara alrededor del papel de filtro se midió utilizando un compás digital. La media de los diámetros mínimo y máximo se utiliza para la comparación. El crecimiento de bacterias no es inhibida por el buffer solo.

Tras la recogida de recién surgido damselflies adultos (50 mujeres y 42 hombres), los individuos fueron asignados a uno de los dos grupos de tratamiento: se inyecta solución salina-o LPS-inyectado. Inyecciones y dosis de LPS y de solución salina se terminaron como se indica más arriba. Después de la inyección, los individuos fueron vueltos a colocar en las copas de plástico y mantuvo a 22 ° C (16:9 luz: oscuridad ciclo, similar al que en condiciones naturales) de 24 h período de tiempo para permitir la inducción de la respuesta inmune .

Los individuos fueron luego colocadas en una temperatura de 15 ° C incubadora con la misma luz: oscuridad ciclo. Esta hambre y la temperatura de régimen debería imitar "real" de acontecimientos meteorológicos adversos y se limita la disponibilidad de alimentos. Damselflies se observaron aproximadamente cada 12 h momento en el que si las personas habían muerto el día se registró, así como ala longitud (± 0,01 mm; Mitutoyo digital calibres). Las observaciones se realizaron hasta que todas las personas que estaban muertos. Para determinar las diferencias de supervivencia LPS-inyectado y se inyecta solución salina adultos maduros, los mismos métodos como se indica más arriba se terminaron usando reproductivamente maduros E. boreale (61 hembras y 59 varones). Las diferencias en los tamaños de las muestras entre los recién creados y maduro damselflies y entre sexos se produjo como consecuencia de las diferencias en el número de personas disponibles en el sitio sobre el terreno durante los periodos de recogida.

Todos los análisis se realizaron utilizando R (versión 2.1.1; [57]] y los medios son reportados como ± 1 SE. De masa corporal, longitud del ala, haemocyte concentración y registro de MI se transforma para satisfacer las hipótesis de normalidad. Análisis de respuesta antibacteriana se completó con una placa como efecto de bloques al azar para tener en cuenta la variación de bacterias entre las placas. Dos LPS inyectado madura damselflies (un macho y una hembra) fueron eliminados de la MI y un análisis LPS inyectado recién surgido femenino caballito del diablo se retiró de la antibacterianos análisis debido a un error en el laboratorio.

Separe los análisis se realizaron para recién creados y reproducidos por individuos maduros y no cualquier interacciones significativas fueron retirados para el análisis final. Hemos completado un análisis separado porque recién creados y los individuos maduros fueron recolectados en diferentes momentos de la temporada así que sólo hemos podido explicar la variación en la supervivencia y los parámetros inmunes dentro de cada categoría de edad y discutir si hubo diferencias en las variables explicativas.

TR llevado a cabo las colecciones de campo y los procedimientos de laboratorio y redactó el manuscrito. MRF participó en el diseño del estudio y la coordinación y la ayudó a redactar el manuscrito. Ambos autores leído y aprobado el manuscrito final.