Molecular Neurodegeneration, 2006; 1: 16-16 (más artículos en esta revista)

Péptido señal peptidase (SPP) como la formación de dímero evaluada por fluorescencia de imágenes de microscopía de vida (Flim) en células intactas

BioMed Central
Andrew C Nyborg (nyborg.andrew @ mayo.edu) [1], Lauren Herl (Lauren.herl @ ucsf.edu) [2], Oksana Berezovska (oberezovska@partners.org) [2], Anne V Thomas (Anne. Thomas@nf.mpg.de) [2], Thomas B Ladd (ladd.thomas @ mayo.edu) [1], Karen Jansen (jansen.karen @ mayo.edu) [1], T Bradley Hyman (bhyman socios @ . org) [2], Todd E Golde (tgolde@mayo.edu) [1]
[1] Departamento de Neurociencias, Jacksonville Mayo Clinic, la Mayo Clinic College of Medicine, Jacksonville, Florida 32224, EE.UU.
[2] Alzheimer's Disease Research Unit, Massachusetts Instituto de Enfermedades Neurodegenerativas, Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts 02129, EE.UU.

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Resumen
Fondo

Péptido señal peptidase (SPP) es una proteasa intramembrane cleaving identificados por su división de varios membrana tipo II señal de péptidos. Conservación de la intramembrane sitio activo demuestra que los residuos SPP, SPP miembros de la familia, y presenilinas (PSS) constituyen una familia de proteasas intramembrane cleaving. SPP porque parece funcionar sin cofactores adicionales de proteínas, el estudio de SPP puede proporcionar conocimientos estructurales en el mecanismo de proteólisis intramembrane de este biomedically importante familia de proteínas. Estudios anteriores han demostrado que el SPP a partir de células aisladas que parece ser una homodimer, pero existe alguna evidencia de que in vitro SPP puede estar activo como un monómero. Hemos llevado a cabo experimentos adicionales para determinar si existe SPP como un monómero dímero o in vivo.

Resultados

Fluorescencia vida útil de imágenes de microscopía (Flim) se puede se utiliza para determinar intra o interacciones interacciones de etiquetado fluorescente epítopos en uno o dos moléculas diferentes. Si el donante y aceptor fluoróforos son menos de 10 nm de separación, los donantes fluoróforo vida acorta proporcionalmente a la distancia entre los fluoróforos. En este estudio, hemos utilizado dos tipos de transferencia de energía de fluorescencia (FRET) pares; cian proteína fluorescente (PPC) con proteína de color amarillo fluorescente (YFP), o Alexa 488 con Cy3 diferencialmente a la etiqueta o NH2-COOH-SPP termini de moléculas. Una célula basada SPP actividad de ensayo se utilizó para demostrar que todos los etiquetados SPP proteínas son proteolytically activa. El uso de Flim hemos podido demostrar que el donante fluoróforo vida de la PPC etiquetados SPP construir en las células vivas disminuye significativamente cuando ya sea una o NH2-COOH-terminal YFP etiquetados SPP construir es co-transfectadas, lo que indica la proximidad entre dos moléculas diferentes SPP. Estos datos fueron confirmados en las líneas celulares establemente co-expresan-V5 y la bandera de etiquetado SPP construcciones.

Conclusión

Flim Nuestros datos sugieren fuertemente la formación de dímero entre dos proteínas SPP. A pesar de que el etiquetado SPP construcciones se expresan en toda la célula, SPP dímero detección de Flim se considera predominantemente en o cerca de la membrana plasmática.

Fondo

Péptido señal peptidase (SPP) es un miembro de un grupo más amplio de intramembrane cleaving proteasas (I-clip) que desempeñan una variedad de papeles importantes en la celda de señalización [1] y la regulación [2], célula de vigilancia [3], comunicación intracelular [ 4], la enfermedad de Alzheimer [5], cáncer [6, 7], y virus de la hepatitis C [8]. Dentro de la I-clip familia, presenilin (PS) 1 y 2, SPP, SPPL3, y se SPPL2b putativo aspartil proteasas que cleave una variedad de sustratos transmembrana [9 - 14]. PSS, SPP, y SPPLs todos contienen un sitio activo conservado motivo de YD y GXGD adyacentes a los dominios transmembrana [15 - 17]. Además, contienen una conservadas PAL motivo cerca del COOH-terminal que ha demostrado ser fundamental para la actividad [18]. Aunque los sitios activos de PSS y SPP parecen ser conservadas, las proteínas se diferencian en que PSS cleave tipo I, proteínas de la membrana y SPP cleaves tipo II proteínas de la membrana [15, 16, 19 - 21]. Esta diferencia se piensa que es debido a la invertida sitio activo topologías de SPP y PS [11, 22, 23]. Además de la orientación diferencia entre PS y SPP, PSS requieren otros tres proteínas para funcionar como γ-secretase [24 - 29], mientras que el SPP parece ser capaz de funcionar por sí solas [11, 22, 30].

SPP fue originalmente identificado como un ~ 45 kDa N-glicoproteína vinculados utilizando un inhibidor de etiquetado enfoque [11]. Otros informes del SPP describen dos bandas, una en ~ 42 kDa, y uno en ~ 95 kDa [10, 30]. Co-purificación de epítopo dos diferentes formas de etiquetado de SPP transfectadas establemente una línea celular expresando ambas versiones etiquetadas demuestra que el ~ 95 kDa es una banda homodimer [30], sin embargo, pruebas inequívocas de la dimerización de SPP en células intactas que ha faltado. Hay pruebas de que PS1 Mayo existe como dímero así como [31 - 36]. Levadura híbrido de dos estudios muestran que NH2 y COOH-terminal de fragmentos de PS1 o intactos PS1 puede asociarse libre [32, 35]. Aunque menor, de alto peso molecular formas de PS se han detectado por los nativos Western Blot después de desnaturalización SDS-PAGE [32, 35]. PS1 NTF-NTF y CTF-NTF dímeros se detectaron tras el etiquetado con un estado de transición analógico γ-secretase inhibidor [33]. Por último, hemos demostrado que las formas dímeros PS1 utilizando ambos co-immunoprecipitation vida y fluorescentes de imágenes de microscopía (Flim) en las células intactas [36].

Aunque el I-clip miembros de la familia desempeñan una variedad de papeles importantes en la biología y los procesos de enfermedad, la escasez de información estructural existe debido a la complejidad de estudiar las proteínas de la membrana y multipaso que componen esta familia. Hasta la fecha, multipaso proteínas de membrana han demostrado ser refractarios a muchos de los actuales métodos utilizados para la obtención de estructuras de proteínas, por lo tanto, poco conocimiento de la naturaleza en vivo de las proteasas activas existe. Estamos establecidos para demostrar que el SPP homodimer existe en las células intactas mediante una resonancia de fluorescencia la transferencia de energía (FRET), con sede técnica, Flim. Nuestros datos demuestran que el NH2-terminal de una molécula SPP es inferior a 10 nm, aparte de la NH2-terminal o COOH-terminal de otro SPP molécula, lo que indica la formación de dímero. El SPP dimerización se demuestra tanto en enteros, utilizando células vivas SPP fluorescentes proteína de fusión construye, y fija en las células intactas utilizando etiquetas SPP construcciones. Tanto el etiquetado SPP construcciones y la proteína de fusión fluorescentes utilizados en las construcciones de la Flim estudios están activos en una célula basada SPP reportero de la actividad de ensayo [22]. Estos datos sugieren que el SPP homodimer observado en Western-Blots a ~ 95 kDa está presente en las células intactas.

Resultados
Epítopo etiquetados SPP construye y PPC / YFP SPP fusión construye SPP mantener la actividad

Para garantizar que todas las construcciones utilizadas para FRET Flim mediciones y estudios se activa, basada en una celda SPP actividad de ensayo se utilizó para evaluar la actividad SPP. Este ensayo utiliza un sustrato consistente en el NH2-terminal del factor de transcripción ATF6 fusionado a un dominio transmembrana susceptibles a la SPP división in vitro [12, 22, 37]. División del sustrato soluble ATF6 emisiones de la membrana, que luego translocates al núcleo y activa una ATF6 luciferase reportero construir. El uso de este ensayo, hemos demostrado que SPPNTFLAG y SPPCTV5 son a la vez activa y que la sobreexpresión de cada una da un aumento significativo de la actividad SPP [22]. Como se muestra en la Figura 1, todos los SPP y PPC-YFP-proteína de fusión se catalíticamente activa también.

Flim demuestra muy cerca de dos diferencialmente marcados SPP construcciones

La microscopía confocal de epítopo etiquetados SPP construcciones transfectadas establemente en células HEK SPP o proteínas de fusión fluorescentes transitoriamente transfectadas en células CHO demuestra que el SPP es uniformemente distribuidas a lo largo de la celda con la excepción del núcleo (Figura 2A]. Anteriormente, SPP ha demostrado co-localizar con el marcador ER Bip [38]. Aunque confocal microcopy muestra equivalente compartimiento de localización de todas las etiquetas epítopo SPP y SPP fusión construcciones empleadas en este estudio, esta colocalización no implica necesariamente que hay una estrecha interacción interacciones por igual en toda la celda.

Para evaluar in vivo la asociación SPP, un ensayo Flim medir la proximidad entre dos etiquetas distintas moléculas SPP fue creado. En este ensayo, los donantes fluoróforo vida se mide, que varía según el microambiente que rodea y se acorta en presencia de un fluoróforo aceptor FRET en la vecindad inmediata (<10 nm). Esta disminución de los donantes fluoróforo vida es proporcional a la distancia entre el donante y el aceptor fluoróforos y pueden ser visualizadas usando un pseudocolor de escala. En esta escala pseudocolor, azul píxeles indicar que no FRETing moléculas con un donante sin cambios fluoróforo vida y de color rojo indican píxeles FRETing moléculas con un resumen de donantes vida fluoróforo (Figura 2B y 2C].

En la presentación en vivo de células Flim análisis, en primer lugar el donante fluoróforo (PPC), toda la vida se determinó en ausencia de un aceptor fluoróforo (~ 2200 psec vida) (Tabla 1]. Una vez SPP-YFP proteína de fusión se construye cotransfected junto con la SPP-PPC construye en las células, una disminución significativa en la vida política pesquera común se observó, indicando enérgicamente la formación de dímero entre dos moléculas diferentes SPP. Esta disminución de los donantes fluoróforo vida fue constantemente observada independiente de la fusión sitio de PPC o YFP a la o COOH NH2-terminal de SPP, respectivamente (Cuadro 1].

Una línea celular HEK tanto coexpressing COOH-terminal V5 etiquetados SPP (SPP CT V5) y una terminal NH2-FLAG etiquetados SPP (SPP NT FLAG) se había generado y se usa para aislar a un in vitro de dímero SPP [30]. En estos experimentos, una línea de células que expresan sólo SPP CT V5, que fue etiquetada con Alexa 488 como donante fluoróforo, se utilizó como control negativo. Alexa vida fue 488 ~ 2500 psec. (Cuadro 2]. En el SPP NT BANDERA / SPP CT co-V5 línea de células que expresan una disminución significativa de los donantes fluoróforo vida se observó en relación con el control negativo (~ 2200 psec vida) (Cuadro 2], indicando de nuevo la proximidad entre dos moléculas diferentes SPP. Aunque SPP está presente en la mayor parte de la célula, la mayoría de los dímeros SPP forma en o cerca de la membrana plasmática, como la disminución más pronunciada en los donantes fluoróforo vida se detecta en esta región (rojo píxeles) (Figura 2B].

Discusión

Bajo condiciones de lisis suave, SDS-PAGE y Western Blot SPP es detectado principalmente como un ~ 95 kDa homodimer [30]. La SDS-estable homodimer es disociable de un monómero de calefacción en presencia de SDS y reductant [30]. Además, hemos demostrado que un NH2-terminal BANDERA epítopo etiquetados SPP co-purifica con un COOH-terminal V5 su epítopo etiquetados SPP construir [30]. Estos estudios bioquímicos sugieren que la ASPAN es probable que exista como un dímero en vivo. Sin embargo, los estudios in vitro demuestran que el detergente solubilized monomérico SPP es capaz de cleaving exógenos péptido sintético sustratos [39]. Para determinar si el SPP dímero está presente en las células intactas, una Flim ensayo se estableció para medir la proximidad entre dos moléculas diferentes SPP en vivo y fija las células. Flim ha sido descrito como una nueva técnica para el análisis de proteínas de proximidad [40, 41] y se utiliza para demostrar que PS1 interactúa con la proteína precursora amiloide y de baja densidad de receptores relacionados con la proteína en el mismo compartimento de la fabricación de una un inhibidor competitivo de la otra [ 42]. Asociación de dos construcciones SPP fue demostrado por el hecho de que el donante fluoróforo vida de un PPC o etiquetados Alexa 488 SPP construir disminuye considerablemente una vez que fluoróforo aceptor de un YFP Cy3 o etiquetados SPP construir está presente en la célula, lo que indica la proximidad de dos diferentes SPP moléculas. SPP dímero formación fue visto entre dos diferencialmente etiquetados NH2-terminales y dos diferencialmente etiquetados COOH-termini con PPC-y-YFP fusión construye en células vivas. Dímero formación también se ve entre el NH2-terminal de una molécula SPP y el COOH-terminal de otro SPP molécula utilizando ambas proteínas de fusión y epítopo etiquetas (Cuadro 1 y 2]. Estos datos indican que el epítopo etiquetas de dos diferencialmente marcados SPP se construye menos de 10 nm de distancia.

Ambos confocal (Figura 2A] y la intensidad de las imágenes (Figura 2B] muestran que el etiquetado SPP construcciones se expresan en toda la célula, excluyendo el núcleo. Flim resultados proporcionan pruebas sólidas de una estrecha asociación de dos moléculas de SPP en o cerca de la membrana plasmática. Sobre la base de trabajos anteriores en general se acepta que la ASPAN es predominantemente localizados en el retículo endoplasmático (ER) [14, 23, 38, 43 - 46]. Como se sabe sustratos de SPP también se encuentran en la sala de emergencia, es la hipótesis de que proteolytically SPP funciones dentro de la sala de emergencia [8, 43, 47, 48]. SPP contiene un putativo COOH-terminal kkxx ER retención señal de que no parece mantener siempre SPP en la sala de emergencia y tampoco es necesario para la actividad [22, 30, 44]. De hecho, epítopo etiquetas colocadas después de la retención kkxx ER señal de no proceder a efectuar la dimerización o actividad [22, 30, 44]. No todos los de origen natural SPP construcciones se limitan a la sala de emergencia [45]. Recientemente, un empalme de la variante SPP (SPP β) se demostró que se encuentra principalmente en la membrana plasmática [45]. Nuestros datos bioquímicos que sugieren que la mayoría de SPP existe en una forma dimeric y la Flim datos proporcionan pruebas de un homodimer estrechamente asociadas en o cerca de la membrana plasmática, pero no en la sala de emergencia. Si esto representa una diferencia en el SPP asociación en diversos lugares subcelular o una limitación de estas técnicas no es clara en el momento actual.

Todas las construcciones se utilizan en estos experimentos se activa en la celda basada SPP reportero ensayos (Figura 1]. No vemos la diferencia entre COOH-terminal, NH2-terminal, o untagged SPP con respecto a su capacidad para cleave una célula basada en el sustrato o la formación de un dímero (Figura 1] [22, 30]. A pesar de que nuestra bioquímica estudios sugieren que la SPP existe principalmente como un dímero, la Flim datos apoyan esta conclusión aseada o en la membrana plasmática. Ninguno de estos estudios proporcionan una idea de si SPP funciona como un dímero o monómero o cuando la actividad se localiza. Creemos que esta cuestión será necesario algún tiempo para resolver. De hecho, tomó algún tiempo para resolver la paradoja de la actividad espacial con presenilinas observó que la mayoría de presenilin está localizado en la sala de emergencia, mientras que γ-secretase actividad reside en gran medida en otros compartimientos celulares (finales de trans-Golgi, la membrana plasmática, endosomes) [49 ]. Por ello, es posible que una parte relativamente pequeña piscina SPP contribuye a la mayoría de la actividad observada.

SPP multipaso es una proteína de membrana que contiene siete dominios transmembrana con el NH2-terminal en el lumen (extracelular) y el COOH-terminal en el citosol [15, 23]. Interpretamos la FRET experimento para demostrar la interacción entre dos moléculas estrechamente asociada a pesar de que el fluoróforos se encuentran en extremos opuestos de cada molécula. Si bien la detección de FRET a través de una membrana no siempre es posible debido a las distancias, se puede lograr si hay alineaciones favorable [50].

Aunque los datos detallados estructurales para PS, SPP y otros I-clips aún no existen, es evidente que parte de celular SPP y PS están presentes como dímeros [32, 33, 35, 36]. SPP es aparentemente sencilla aspartil I-clip que γ-secretase en que: SPP puede expresarse en formas activas adicionales sin co-factores en sistemas heterólogos, y, a diferencia del PS, SPP no parece someterse o exigir endoproteolysis de actividad [51 ]. Por lo tanto, SPP, cabe esperar que se caracteriza más fácilmente a un nivel molecular y estructural a nivel de γ-secretase. Información estructural y estudios, inevitablemente, nos proporcionan un mayor conocimiento en esta importante familia biológica de las proteínas y ayuda en el desarrollo de compuestos para orientar sus actividades.

Materiales y métodos
Construcciones de ADN y de cultivo celular

Epítopo etiquetados SPP construcciones utilizadas en los estudios Flim se describieron anteriormente [30]. Cian proteína fluorescente de color amarillo fluorescente y proteína de fusión SPP construcciones se generaron por PCR basada en técnicas de clonación con cuatro vectores. pCFP-N1 y pYFP-N1 fusibles la proteína fluorescente a la COOH-terminal y pCFP-C1 y C1-pYFP fusibles de la proteína fluorescente a la NH2-terminal de SPP. Todos los clones fueron verificadas por la secuencia. SPP reportero ensayo clones se describieron anteriormente [22]. De embriones humanos Riñón (HEK) 293T células estable overexpressing COOH-terminal V5 etiquetados SPP (SPP CT V5) y NH2-terminal BANDERA etiquetados SPP (SPP NT FLAG) construye [27] fueron cultivados en Opti-MEM © medios de comunicación (Gibco), que contiene 10 % De SFB en una incubadora a 37 ° C suplementado con 5% de CO 2.

SPP reportero de ensayo

El reportero luciferase ensayos se realizaron según lo descrito anteriormente [22]. En resumen, HEK 293T células fueron cultivadas a 70% y confluentcy transfectadas transitoriamente utilizando 100 μ l de suero libre Opti ® MEM (Gibco), 8 μ l de fugene, 0,01 μ g de PRL-SV40 Renilla expresión plásmido (Promega), 0,25 μ g de pGL3 5xATF6 plásmido reportero, 0,25 μ g de pAG3 SPP sub plásmido y 0,5 μ g de la SPP construir un plásmido de expresión o el control total de plásmido a 1 μ g de ADN en cada uno de los pocillos de una placa y 12. Las células fueron incubadas con el reactivo de transfección de 6-12 horas, tras lo cual el suero deficientes medios de comunicación fue sustituido por Dulbecco modificada de Eagle suplementado con 8% de suero de ternera normal (Cambrex), el 2% de suero fetal bovino (Hyclone) e incubadas por un período adicional de 8 -24 Horas. Firefly y Renilla luciferase actividades se midieron utilizando el Dual-Luciferase ® kit (Promega) y una microplaca Veritas luminómetro (Turner Biosystems) con Veritas 2.0.40 paquete de software. Transfections se realizaron por triplicado. Los resultados se normalizaron a las Renilla luciferase actividad de control.

Transitoria transfections

De ovario de hámster chino (CHO), las células se dividieron en 35 mm platos y co-transfectadas con PPC-y-YFP SPP fusión construye utilizando Superfect Transfección reactivo (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 24 horas después de la transfección los medios de comunicación se intercambió con Hank's Balanced Salt Solution (Gibco), inmediatamente antes de vivir de células Flim de imágenes.

La inmunocitoquímica

HEK células estable overexpressing SPP CT V5 y SPP NT FLAGconstructs se dividieron en cuatro diapositivas y la cámara de 24 horas antes de la inmunocitoquímica y que se les permita crecer a confluentcy. Una vez confluentes, las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% para 10 minutos y permeabilized en 0,1% Tritón X-100 en el 1,5% de NDS durante una hora. Primaria anticuerpos de cabra anti-V5 (1:300) (Abcam, Cambridge, MA) y el ratón anti-FLAG (1:600) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) se aplicaron durante una hora a temperatura ambiente, seguida por tres lavados de 1 × TBS. Los anticuerpos primarios fueron marcadas con anticuerpos secundaria, ya sea conjugado con Alexa 488 (Invitrogen, Gaithersburg, MD) o Cy3 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) durante una hora a temperatura ambiente, seguido de tres lavados en 1 × TBS. Antes de Flim análisis, las diapositivas se coverslipped GBA usando solución de montaje (Zymed, South San Francisco, CA).

Flim ensayo

Flim ha sido descrita como una novela basada en FRET técnica que permite el análisis de proximidad entre los epítopos de una o dos moléculas diferentes [40, 42, 52 - 54]. La técnica se basa en la observación de que la vida de fluorescencia de un donante fluoróforo (Alexa 488 o PPC) reduce en presencia de un fluoróforo aceptor (Cy3 o YFP), en estrecha proximidad (<10 nm). La disminución en la vida es proporcional a la distancia entre los fluoróforos en R 6.

En estos experimentos, controles negativos consisten en células transfectadas o immunostained con el donante sólo fluoróforo. Considerando que en los controles positivos (en las células immunostained solamente), las células se tiñen con el donante fluoróforo, que luego se etiquetan con un segundo fluoróforo contra las especies en las que el donante fluoróforo se plantea [40]. En las condiciones experimentales, los dos epítopos de interés han sido etiquetados con los donantes y fluoróforo aceptor, respectivamente.

Un microscopio Radiance 2000 (Bio-Rad, Hercules, CA) usando un modo de femtosegundos sin salida al mar de pulsos Ti: Sapphire láser (Mai Tai; Sprecta-Física, Mountain View, CA) a 800 nm se utilizó para multiphoton fluorescencia de excitación. Fluorescencia de tiempos se registraron empleando una línea de alta velocidad tubo fotomultiplicador (MCP R3809; Hamamatsu, la ciudad de Hamamatsu, Japón) y un rápido tiempo de correlación de un solo fotón contar bordo de adquisición (SPC 830; Becker & Hickl, Berlín, Alemania).

Para determinar la fracción de fluoróforos dentro de cada píxel que interactúa con un aceptor, los donantes fluoróforo vida fueron determinadas por la instalación de datos a Flim único (control negativo) o bi (control positivo, las condiciones experimentales) exponencial curvas de caída, respectivamente. La pantalla de vidas en una escala pseudocolor fue posible mediante la creación de un 128 × 128 píxeles matriz para los dos un solo y bi-exponencial de la curva de ajuste de datos para cada pixel (SPCImage Becker & Hickl, Berlín, Alemania).

El análisis de los datos

Los datos fueron analizados mediante el Sigma Stat 3,1 de Systat Software Inc para la comparación de los múltiples valores experimentales relativos a los controles un ANOVA se realizó con un Dunnet's post hoc t-test. Diferencia se reporta como el error estándar de la media para el SPP reportero de ensayo y como la desviación estándar para el ensayo Flim.

Abreviaturas

Flim, fluorescencia de imágenes de microscopía de vida; SPP, péptido señal peptidase; CTF, COOH-terminal del fragmento; FRET, fluorescencia de resonancia la transferencia de energía; YFP, proteína fluorescente amarillo; PPC, cian proteína fluorescente; I-clip, Intra-membrana cleaving la proteasa; PS , Presenilin; SPP CT V5, COOH-terminal V5 etiquetados SPP; SPP NT bandera, NH2-terminal BANDERA etiquetados SPP; HEK, de embriones humanos Riñón; CHO, ovario de hámster chino.

Autores de las contribuciones

ACN, LH, OB, BTH y TEG contribuido a la concepción, diseño, análisis e interpretación de los datos y son responsables para la preparación de manuscritos. ACN, LH, KJ, TBL, OB, y la AVT lleva a cabo los experimentos en este manuscrito. ACN, LH, OB, BTH, y TEG contribuido a la interpretación y análisis de datos. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias a los miembros de la Golde y Hyman Labs para su análisis crítico y reflexivo contribuciones. Esta labor fue apoyada por la Fundación Mayo y un NIH / NINDS conceder a NS39072 TEG y una subvención del NIH PO1 AG15379-08 BTH y una beca de investigación de la Deutsche Forschungsgemeinschaft TH 1129/1-1 AVT