Wildtype del factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR) no es necesaria para cotidiana del aparato locomotor o enmascarar el comportamiento en ratones

El factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR) vía desempeña una función clave en el desarrollo y mantenimiento de muchos tejidos y sistemas orgánicos [1]. Los informes recientes han sugerido que el EGFR vía media dos aspectos de comportamiento, diurna actividad locomotora y la represión de la locomoción en respuesta a la luz (enmascaramiento). Los niveles de EGFR ligando la transformación del factor de crecimiento alfa (TGFA) fluctúa con un ritmo circadiano en el núcleo suprachiasmatic (SCN) [2, 3], que está situado en el hipotálamo y es considerado el principal anatómica reloj circadiano, y están asociadas con circadiano dependientes del tiempo los cambios en la expresión de genes [4], al igual que ligandos EGFR se expresa en las células de la retina, que modula el comportamiento de ocultación [3]. Ambas de estas estructuras parecen de entrada en la zona subparaventricular (SPZ), una región hipotalámica que se requiere para los ritmos circadianos [5] y que expresa los altos niveles de EGFR [3]. Esta red anatómica ha sido manipulado experimentalmente, con la infusión de TGFA en el hipotálamo de hámster reversible reprimir actividad locomotora [3, 6]. Sin embargo, la administración exógena de ligandos del receptor puede conducir a la falta de respuestas fisiológicas, lo que indica una proteína puede hacer, no necesariamente de sus funciones biológicas normales [7].

Tal vez la más pruebas que implican a la vía EGFR en actividad locomotora y de ocultación se encuentran en el comportamiento de ratones homocigotos para el EGFR ^wa alelo ^2, que produce un hypomorphic receptor con la reducción de actividad quinasa [8, 9]. El EGFR ^wa alelo ² es un reactivo genético valioso para disecar las funciones biológicas de EGFR desde homozygosity para EGFR alelos nulos resultados en letalidad [1, 10], mientras que EGFR ^{wa 2} homocigotos los animales pueden sobrevivir hasta la edad adulta. Ambos anormalmente alta actividad diurna y fuerte enmascarar los defectos se informó en cuatro de los cinco B6EiC3H-a/A- EGFR ^{wa 2 / wa} Wnt3a ^{vt 2 / vt} ratones a prueba [3]. En conflicto con estas observaciones, un estudio más amplio mediante un mayor número de ratones de la misma fuente (El Laboratorio Jackson) y una gama de intensidades de iluminación no detectar cualquier enmascarar defectos [11].

Previo análisis de la investigación de alteraciones del aparato locomotor y en los comportamientos de ocultación utilizados ratones portadores del EGFR ^wa alelo ² en una mezcla de antecedentes genéticos. Con el fin de resolver las discrepancias que implican un papel fundamental para EGFR en el aparato locomotor y conductas de ocultación, así como para examinar los posibles efectos genéticos de antecedentes sobre estos defectos, hemos probado EGFR ^{wa 2} homocigosis en uniforme congenic o híbridos de antecedentes actividad locomotora y la capacidad de enmascaramiento. Los resultados actuales demuestran concluyentemente que el EGFR no es un mediador esencial del aparato locomotor o enmascarar los comportamientos y sugiere que otros incontrolada genéticos o los parámetros ambientales confundido experimentos anteriores.

B6EiC3H-a/A- EGFR ^{wa 2 / wa} Wnt3a ^{vt 2 / vt} ratones se obtuvieron del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME). La derivación del EGFR ^{wa 2} congenic líneas involucradas retrocruzas el EGFR ^wa alelo ² para más de diez generaciones C57BL/6J y 129S1/SvImJ las bases genéticas. La eliminación de los vinculados Wnt3a ^vt hypomorphic alelo, mantenerse en cis con EGFR ^{wa 2} en el arranque inicial de la población, se verificó por PCR a base de genotipo. Los ratones recibieron al menos una semana para aclimatarse a su nuevo entorno antes de la prueba. Los ratones fueron siempre PicoLab Mouse Dieta 20 (LabDiet) ad libitum y autoclave agua.

Los animales fueron alojados individualmente y habituado varios días en jaulas equipadas con ruedas para mediciones de actividad, dentro de una luz caja hermética que contiene un fresco en blanco tubo fluorescente proporcionar 200 a 300 lux o 400 a 500 lux de luz a nivel de jaula en un 12 h: 12 h luz-oscuridad ciclo. Diurnas actividad se calculó como el porcentaje de la actividad total que ocurren en la luz fase del ciclo. Para enmascarar el análisis de la respuesta, ya sea uno o tres horas pulsos de luz fueron entregados en el tercer día a partir de Zeitgeber Tiempo (ZT) 14 (ZT0 = luz; ZT12 = luces apagadas). Cada animal se puso a prueba para enmascarar a dos o tres pulsos de luz con al menos dos días entre los pulsos. Actividad durante el pulso se calcula como un porcentaje de la actividad, al mismo tiempo, el día anterior. Actividad locomotora se registran y analizan con ClockLab software (Actimetrics, Evanston, IL).

Ratones con luz normal mediada por actividad locomotora en general, tienen de uno a dos por ciento durante el día la actividad, y de ocultación de mayor o superior al 95%. Una primera ronda de pruebas utilizado comúnmente administrados condiciones, de una hora de luz en impulsos 400-500 lux, para determinar la respuesta de ocultación. De los seis animales sometidos a pruebas, ninguno mostró un defecto de ocultación, y un solo animal, un EGFR ^{wa 2 / wa} Wnt3a ^{vt 2 / vt} ratón en una mezcla de antecedentes genéticos similares a las utilizadas anteriormente [3], ha demostrado superior a la normal actividad diurna (datos no presentados).

Un gran grupo de ratones fue probado con tres horas de luz en impulsos 200-300 lux, las condiciones idénticas a las del anterior estudio de informes EGFR ^{wa 2-alteración} asociada [3]. Sorprendentemente, la gran mayoría de EGFR ^{wa 2} ratones expuestos homocigotos normales durante el día la actividad de enmascaramiento y negativos, al igual que todos los de tipo salvaje littermates y un C57BL/6J- Wnt3a ^{vt / vt} ratón (Tabla 1]. De hecho, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas cuando los datos se agruparon por la condición de EGFR (ANOVA de un factor: la actividad diurna%, p = 0,32; ocultación%, p = 0,27; actividad total (rev), p = 0,49). Dos EGFR ^{wa 2 / wa 2} ratones, un macho C57BL/6J- EGFR ^{wa 2 / wa 2} y una mujer B6.129 F1-EGFR ^{wa 2 / wa 2,} exhibió tanto anormal durante el día la actividad de enmascaramiento y negativos defectos similares, pero no como extrema, como los anteriormente descritos [3]. A diferencia de lo que sucedió en el anterior estudio, la mayoría de las anormalmente altas durante el día la actividad visto en los dos ratones afectados no fue esporádica, sino que se produjo en un período discreto de tiempo anticipando el oscuro ciclo y, por tanto, resulta en un cambio de fase (Fig. 1A ). Al igual que en el anterior estudio, la negativa de ocultación en ratones se retrasó, con supresión de la normal actividad en la primera hora de las tres horas de duración del pulso de luz (Fig. 1B]. De este modo, los resultados actuales sobre las bases genéticas controlados muestran sustancialmente menor penetrancia y expresividad de lo originalmente informado (18% versus 80% penetrancia) [3].

La discrepancia entre los resultados anteriores utilizando el B6EiC3H mixta de antecedentes genéticos y nuestros resultados actuales con ratones congenic es particularmente sorprendente dado que la mayoría de los fenotipos anormales aumento en la severidad con la endogamia, que es particularmente chocante en fenotipos asociados a EGFR [1, 12]. Sin embargo, el uso de la B6EiC3H-a/A- EGFR ^{wa 2} Wnt3a ^vt, para estudiar los efectos de EGFR ^{wa 2} alelo es problemático ya que inmediatamente EGFR ^{wa 2} homocigosis también son homocigotos para los vinculados Wnt3a ^vt mutación, un alelo de hypomorphic conocido Wnt3a para la producción de la cola vestigial fenotipo [13]. Desde Wnt3a ratones con deficiencia de exposición defectos en el hipocampo y el sistema nervioso central [14], la Wnt3a ^vt alelo es posiblemente responsable de la actividad defectos. Además, la falta de puras B6EiC3H fondo, mantienen a través de una muestra representativa outcross sistema de apareamiento, que alberga el EGFR ^{wa 2} y Wnt3a ^vt alelos en cis segrega conocidos y desconocidos mutaciones de la C57BL/6JEi y C3H/HeSnJ cepas [15]. En consecuencia, al igual que los defectos se informó anteriormente de actividad locomotora no puede atribuirse a EGFR, ya que un adecuado control no existe para el fondo mixto B6EiC3H.

Wildtype puras ratones de la C57BL/6JEi y C3H/HeSnJ cepas tienen diferentes umbrales de enmascaramiento y varían en diurna actividad locomotora de una manera que es probable multigenic [16, 17]. Un fuerte candidato a tal modificador mutación es la degeneración retiniana (Pdeb ^{º 1),} que está a cargo de la cepa C3H/HeSnJ pero no C57BL/6EiJ, y las causas y progresiva degeneración selectiva de células visuales [18, 19]; el Pdeb ^{ª 1} mutación por sí sola tiene un efecto muy significativo sobre la conducta de ocultación [16]. La melatonina es la producción también muy diferente entre las dos cepas contribuir a la B6EiC3H fondo mixto, con ratones C3H que presentan una alta, los niveles de melatonina rítmica, y C57BL / 6 ratones que presentan baja a niveles indetectables la melatonina provocada por la mutación de al menos un gen (N-acetiltransferasa 2) relacionados con la producción de melatonina [20, 21]. El anterior EGFR ^{wa 2} homocigotos cohorte que había una alta penetrancia de la actividad puede tener defectos fortuitamente contiene una alta frecuencia de estos u otros modificadores genéticos dado el pequeño número de individuos a prueba.

Estudios anteriores utilizando la infusión directa de ligando a hyperactivate EGFR en el cerebro han demostrado que a niveles anormalmente elevados de señalización EGFR es capaz de perturbar la luz asociada a la actividad de control del aparato locomotor [3, 6]. Sin embargo, este enfoque puede no producir respuestas fisiológicas que son artifactual o neomorphic en la naturaleza en lugar de ser representante de la biología normal [7]. Por lo tanto, la sugerencia de que la actividad locomotriz depende en gran medida de los niveles normales de señalización EGFR no es compatible, sobre todo teniendo en cuenta las pruebas extensas de B6EiC3H-a / A EGFR ^{wa 2 / wa} Wnt3a ^{vt 2 / vt} ratones a través de una amplia gama de condiciones de iluminación no detectar las diferencias en la respuesta de ocultación [11]. Utilizando adecuadamente controladas genéticos condiciones, nuestros resultados demuestran concluyentemente que EGFR actividad no está obligado a producir y no es un importante mediador de la actividad anormal de fenotipos, y que otros problemas ambientales, genéticos, o los efectos estocásticos están obligados a revelar fenotipos anormales. Un reciente informe revela importantes intrastrain y intraindividual fluctuaciones de los niveles de EGFR ligando en el SCN puras de ratones [2]. Por lo tanto no podemos eliminar la posibilidad de que homozygosity para EGFR ^{wa 2,} pueden provocar a las personas que sensibilizar a expresar fenotípicamente anormal de las actividades del aparato locomotor. Por ejemplo, EGFR ^{wa 2} homocigosis variable tienen defectos oculares [8] que podría combinar con otros factores que contribuyen a la luz asociada a la actividad anormal. De hecho uno de los EGFR ^{wa 2 / wa 2} personas en nuestro estudio apoya la presencia de variabilidad intraindividual, que exhiben una respuesta anormal de enmascaramiento en un juicio seguido por cerca de una respuesta de lo normal en un juicio posterior (datos no presentados).

Los ratones utilizados originalmente para implicar EGFR como un importante mediador de la actividad locomotriz llevado muchas otras mutaciones y variantes alélica que puedan contribuir a los resultados observados. Dado que los animales no son debidamente controlados por antecedentes genéticos, muchas otras interpretaciones (como la desigual distribución de antecedentes genéticos en el control y la prueba de ratones) muy probablemente contribuyó a la resultados erróneos. Nuestros datos utilizando genéticamente uniforme congenic líneas indican que el EGFR no es un mediador necesario de la ocultación del aparato locomotor o comportamientos, aunque puede modular la actividad de otras vías implicadas en el control de la actividad locomotora. Más investigación es necesaria para dilucidar adecuadamente la vías moleculares y los factores de mediación actividad locomotriz.

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

RBW participado en todos los experimentos, en el análisis y discusión de los resultados, y en la redacción del manuscrito. CLT participado en todos los experimentos, en el análisis y discusión de los resultados, y en la redacción del manuscrito. DL participado en todos los experimentos y en el análisis y discusión de los resultados. RWM participado en todos los experimentos y en el análisis y discusión de los resultados. AS participó en la conceptualización de los experimentos y en el análisis y discusión de los resultados. DWT participado en la conceptualización de los experimentos, en el análisis y discusión de los resultados, y en la redacción del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.