Journal of Burns and Wounds, 2006; 5: (más artículos en esta revista)

Efecto de un simple frente a una compleja matriz en la polaridad de cardiomiocitos en Cultura

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Rachel A. Davis, Barry W. Van Winkle, L. Maximiliano Buja, Brian J. Poindexter, Roger J. Bick

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Resumen

Objetivo: El objetivo de este estudio fue observar los efectos del cultivo de células en la polaridad celular en cardiomiocitos por influencia de proteínas de citoesqueleto. Métodos: de cardiomiocitos adultos y neonatal ratas fueron aisladas y cultivadas en 2 diferentes matrices extracelulares-laminina y un complejo, fibroblastos derivados de la matriz extracelular, cardiogel. La ubicación de una serie de proteínas se visualizan por medio de microscopía de fluorescencia deconvolución, utilizando sondas fluorescentes específicas para α-adrenérgicos, β-adrenérgicos, el sarcolema L-tipo de canales de calcio, sodio y el potasio adenosina + triphosphatase bomba de proteína. La migración intracelular de estas proteínas durante los primeros 4 días de la cultura fue seguido y apilados imágenes microscópicas fueron reconstruidos. A isothicyanate fluoresceína marcado con sonda de actina se utilizó para garantizar que los cardiomiocitos se están examinando, sobre la base de patrones de proteínas. Resultados: Se analizaron 2 tipos de miocitos: neonatos recién aisladas y cultivadas cardiomiocitos adultos que se someten a dedifferentiation. Inicial, aglutinación perinuclear (retículo endoplasmático / Golgi asociada) de las sondas con la consiguiente propagación de la periferia y el citoplasma, acompañada de una mejor organización y más rápida respuesta a estímulos bioquímicos, fue visto en la compleja matriz. Conclusiones: La compleja matriz polaridad celular supera a un ritmo más rápido que miocitos cultivadas en una matriz simple, aunque ambas matrices de cultura fueron capaces de apoyar el crecimiento celular y la diferenciación, y una sola capa las culturas son un buen método por el cual estructurales y bioquímicas de datos pueden obtenerse. El uso de un nativo, compleja matriz es preferible emplear una simple, única proteína, aunque los aspectos temporales de crecimiento celular se debe considerar en relación con el aspecto particular de la estructura celular de desarrollo y las vías bioquímicas que el investigador se centra en la intención.

A pesar de los importantes avances en el tratamiento, las enfermedades cardiovasculares sigue siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en los Estados Unidos. La inmensa repercusión de las enfermedades cardiovasculares en la población ha impulsado importantes de investigación en relación con la función cardiovascular, de los cuales un aspecto importante es el uso de cultivos de cardiomiocitos. Los avances en la investigación cardiaca por medio de cultivo celular está determinada por el hecho de si este método se asemeja bastante a los cardiomiocitos su estado fisiológico natural, sin dejar de ser un instrumento importante para las investigaciones iniciales en cuanto a si cardiomiocitos implantación en las zonas de isquemia cardíaca y la fibrosis es un realista y viable método de curación para el futuro y las terapias de reemplazo en el tratamiento de las enfermedades del corazón.

El interés en las células de reemplazo y reparación de terapias para enfermedades cardíacas llegó a la vanguardia en el decenio de 1990. Un estudio inicial en un modelo de rata 1 sugiere que la implantación de cardiomiocitos neonatal en las áreas de infarto cardiaco ha sido sin duda una válida potencial clínico de terapia procedimiento a seguir. Otros estudios luego arrojar alguna duda sobre la inversión isquémica 2 implantado por miocitos, y nos trajo a la era de las células madre en la formación de tejido y regeneración. 3, 4 Dentro de todas estas nuevas propuestas, parece haber sido una pérdida de reconocer que la comunicación entre una célula y su entorno dictados procesos biológicos como el desarrollo, la inflamación y la respuesta inmune y que el adhesivo características de las células de su entorno y la matriz extracelular (ECM) son también muy importantes en la regulación de la función de la célula y tejido de desarrollo 5, y que estudios sobre las células cultivadas, y la cosecha de cultivos celulares para su implantación, debe considerarse a la luz de los receptores de ECM.

Cell apego a las ECM es predominantemente llevados a cabo por integrinas, una familia altamente expresado transmembrana de la superficie celular de receptores de adhesión. Además de la conexión de las células individuales, integrinas transduce señales que gestionar el crecimiento celular, la migración y diferenciación. Integrinas grupo focal para formar adherencias de estos sitios específicos de vinculación no sólo ofrecer vínculos estructurales existentes entre el interior del citoesqueleto de actina y la ECM, sino también actuando como un lugar central de la transducción de señales que dirige la actividad celular. 6 Dado que el medio ambiente con el que interactúan las células desempeña un papel fundamental en la organización y función de la célula, las técnicas de cultivo son fundamentales en relación con las propiedades de las células en desarrollo 7 y su potencial uso terapéutico. En el contexto de las enfermedades del corazón, se informó de que la molécula de ECM tenascin-C no sólo es muy importante en la remodelación del tejido del corazón, pero es un indicador de la actividad de la enfermedad miocárdica, 8 de nuevo que indica la importancia de la composición de ECM.

Actualmente, monocapa cultura es el método común de las células cada vez mayor, con la participación de la adhesión de células a un sustrato especial, como una placa de Petri o componente de ECM. Primaria de la cultura de cardiomiocitos implica el uso de una variedad de componentes de ECM, en tanto simples como complejas mezclas como simple matrices como laminina, colágeno y fibronectina. Aunque a menudo se utilizan en cultivos celulares, estas sencillas proteínas no se parecen en vivo cardíaca suficientemente componentes de ECM. 9 una matriz más compleja, uno que se aproxime a la ECM de un tejido de origen, es preferible. Un ejemplo de ello es cardiogel, un derivado de fibroblastos ECM 10.

En su entorno, cardiomiocitos existir en un 3 dimensiones del sistema, incorporados y en unidos entre sí por un complejo de ECM. 11 Cuando cardiomiocitos son cultivadas en un componente de ECM, los miocitos se extienda y se someten a transformaciones morfológicas en una más de 2 dimensiones, 12, pero bajo condiciones fisiológicas normales que cabe esperar para encontrar las proteínas del receptor y los canales de iones que rodea a la célula, al igual que el ECM rodea completamente la celda. Sin embargo, dado que estos receptores y el canal son proteínas normalmente en contacto con el ECM que la hipótesis de que demostraría una migración de proteínas hacia la monocapa empleadas en la cultura, dando lugar a la polaridad celular. Si esto ocurre polaridad, la comprensión de los cambios en funcionales y metabólicas respuestas podrían ser útiles en el fomento de la investigación cardiovascular, y algo de importancia a considerar cuando el cultivo de células para los experimentos de implantación.

MÉTODOS
Modelo experimental

Neonatal miocitos cardíacos se aislaron como se informó anteriormente. 5 En resumen, 2 - a 3 días de edad se sacrificaron las ratas, los corazones y eliminado ventrículos cosechada. El tejido es digerido con colagenasa / pancreatina, separados por un gradiente de Percoll (Pharmacia, Piscataway, NJ) y cultivadas en laminina-o cardiogel revestido con cubreobjetos en Dulbecco's modificó Eagles Medium (DMEM; Gibco, Grand Island, NY), que contiene 5% HyClone de suero de ternera (Logan, UT) y 5000 U / L cada una de la penicilina y la estreptomicina. Las culturas se mantuvieron en una atmósfera de oxígeno 90:10 / CO 2 a 37 ° C.

Adultos han sido recolectados miocitos de ratas adultas como se describe anteriormente. 13 anestesiados ratas (200 g de peso medio) recibieron 3000 UI de heparina por inyección intravenosa a través de la vena cava inferior. El corazón fue sometido a digestión enzimática en un pa tus Langendorf, y miocitos fueron cosechadas por centrifugación.

Para la diferenciación de los miocitos, 1 a 2 gotas de la suspensión fue obtenido por encima de capas en estéril o laminina-cardiogel revestido con cubreobjetos, y se incubarán durante 30 minutos a 37 ° C a 5:95 de CO 2 / aire. Plating medio que contiene 10% de suero de ternera fetal, 1:360 Ara-C, 1:1000 insulina, y 5000 U / L de la penicilina y la estreptomicina se añade suavemente el cubreobjetos y se incubaron como se indica más arriba y alimentados con placas medio fresco cada dos días.

Aislamiento de cardiogel compleja matriz

Los fibroblastos de origen matriz fue aislado, tal como se describe, 14 utilizando la mezcla de suspensión celular para la preparación miocitos. La banda a la densidad de 1,05 a 1,062 en el gradiente de Percoll se utiliza para la depuración de fibroblastos. Las células están chapados en plástico, 90:10 incubadas en el aire y el CO 2, y la confluencia crecido a más de 3 a 4 días. Las placas son tratados con 0,5 mM EDTA solución (0,05% trypsin/0.5 mM Na 2 EDTA) para separar las células, y el resto cardiogel matriz se lava en DMEM y utilizado para el cultivo directo de cardiomiocitos, ya sea en las placas de Petri o el 10 - mm cubreobjetos de vidrio recubierto con cardiogel.

Microscopía de fluorescencia deconvolución

Las sondas y anticuerpos fueron utilizados para reconstruir la imagen y las células para mostrar adrenoreceptors y diversas proteínas en cardiomiocitos culturas. Se utilizó DAPI de los núcleos, Texas Red y FITC anticuerpos secundarios marcados para actina, prazosina etiquetados para los receptores α-, CGP-12177 para los receptores β-, y Bodipy Verde y Texas Red marcado secundaria de anticuerpos para el sodio + potasio adenosina triphosphatase ( Na + K-ATPasa) y L-tipo de canales de calcio (Molecular Probes, Eugene, Oregón). Las células se reaccionó con la sonda durante 15 minutos a temperatura ambiente, bajo 1 gota de antifade (Elvanol, Dupont, Wilmington, DE), y visualizado en una Olympus IX70 microscopio invertido y escaneada con una precisión Aplicada DeltaVision escaneo deconvolución microscopio de fluorescencia (Issaquah , WA). Apilados de imagen se realizaron reconstrucciones y análisis de imágenes se realizó en una estación de trabajo Silicon Graphics SoftWoRx utilizando software (Applied Precision).

En tiempo real espectrofotometría

Se utilizó la medición de calcio intramyocytic para demostrar los parámetros bioquímicos en paralelo con el desarrollo de las células y la migración de determinados receptores y proteínas. Miocitos, tanto cultivadas neonatal y adultos, fueron tratados con isoproterenol (10 μ m) o ouabaína (5 μ m), y el Ca i niveles se midieron con FLUO-3 intensidades de fluorescencia utilizando un Perkin-Elmer System Concord (Gaithersburg, MD), incorporando SprectaMaster multiwavelength un controlador y con control de temperatura etapa, equipada con un arco iris de múltiples longitudes de onda rueda de filtros (Olympus America, Melville, NY). Las imágenes fueron adquiridas con un Olympix Astrocam CCD 4100 Fast Scan (12-bit, 768 × 576) cámara a una velocidad de 1000 cuadros por segundo y 9 μ m de resolución en imágenes en bruto. Contráctil de onda se informó de rápida memoria caché de 100 adquisiciones intensidades de fluorescencia.

RESULTADOS

Se utilizó una serie de receptores y canales de proteínas para delinear el desarrollo neonatal de cardiomiocitos y seguir el dedifferentiation de miocitos aislados de adultos, comparando la influencia de un complejo frente a una simple matriz de polaridad en la célula.

La figura 1 muestra las imágenes obtenidas a partir de deconvolución microscópicas scans de una sonda específica de α-1 receptores. Cada panel muestra la distribución el día 1 (imágenes superiores), frente a el día 4 (imágenes inferiores) en la cultura.

Los 2 primeros pares son cultivadas con dediferenciado cardiomiocitos adultos, mientras que el segundo 2 pares están las imágenes obtenidas a partir de células neonatales. El primer grupo de cada pareja es con una simple matriz de laminina, la segunda mesa redonda de cada par es con el complejo, derivado de fibroblastos cardiogel. Como se puede ver, los primeros (día 1) la distribución de los receptores a través ya lo largo de la célula es mayor en los miocitos neonatales (a la derecha 2 paneles), aunque poca o ninguna diferencia se observa en el patrón de distribución de laminina-cuando las células se apoya en comparación a miocitos crecido en cardiogel en el día 4, donde hay una rápida migración de los receptores en la dediferenciado cardiomiocitos, y la propagación de la sonda es mucho mayor en la cardiogel apoyados por las células del músculo cardíaco. Aumento es constante a × 600 bares y unidad son 30 μ m.

La figura 2 muestra una secuencia similar de imágenes, aunque esta vez se han centrado en la Na + K-ATPasa la bomba de proteínas. Una vez más, un patrón similar se observa, con la neonatal células que exhiben un anterior patrón difuso que no cambia mucho durante 4 días en la cultura, mientras que el dediferenciado células muestran una localización central de la sonda el día 1, tendido de los días 4, y una mayor propagación en la compleja matriz.

La Figura 3 muestra los 3 tipos de cardiomiocitos empleadas en este estudio con (de izquierda a derecha) recién aisladas de adultos, dediferenciado cultivadas adultos, neonatal y cultivadas cardiomiocitos. El verde es de actina, visualizan con un FITC-etiquetados, cardíacos específicos de secundaria de anticuerpos; el azul son zonas núcleos, teñidos con DAPI (Molecular Probes, Eugene, Oregón).

Figura 4 se incluye de una de nuestras publicaciones anteriores 10 y que demuestra la compleja matriz no dar lugar a grandes células y la aparición de un mayor número de orgánulos subcelulares en una etapa temprana. Este par de imágenes muestra neonatal cardiomiocitos que han sido cultivadas en laminina (grupo 1) y cardiogel (grupo 2) durante 4 días y luego probaron con MitoTracker (sondas moleculares) para revelar el contenido mitocondrial.

Figura 5 es una compilación de transeúntes adquiridos por tiempo real espectrofotometría de fluorescencia, detallando isoproterenol-estimulado los cambios de calcio a través de la β-receptor / Adenilato ciclasa vía. Comparando neonatal células cultivadas en un complejo (A) y una simple matriz (C), es evidente que los efectos de la estimulación isoproterenol son muy diferentes. El trazado es una recopilación más de 5 minutos período de registro, y demostrar que en cardiogel hubo algo esporádicos golpes, que estaba regulada y una mayor administración de isoproterenol, un patrón que sigue siendo regular aunque pico de calcio se redujo ligeramente. Sin embargo, en las células cultivadas en laminina, el patrón regular inicial de los transeúntes fue bloqueada después de una larga exposición de los miocitos a isoproterenol, y el nivel de calcio intracelular se mantuvo alta, comprobado por el incremento de la distancia de la base de los transeúntes desde la línea de base . Al día 4, las culturas de ambas matrices respondieron a la estimulación isoproterenol, aunque los miocitos estimulado por cardiogel tendió a ser ligeramente más rápido y una tasa más rápida de ciclismo correspondiente de calcio, como lo demuestra el más pequeño pico de altura.

Figura 6 es un 4-Presentación de la comparación de los transitorios de culto cardiomiocitos adultos después del tratamiento con 10 μ M ouabaína (Sigma Chemical, St Louis, MO). Los miocitos cultivados en cardiogel puesto de manifiesto una vez más esporádicos golpes en el día 1, y, por tanto, se espera un efecto insignificante siguientes ouabaína adición. Al día 4, sin embargo, eran transitorios y mucho más grande, con ouabaína producir una reducción en el tamaño de pico y una tasa más rápida, como cabría esperar. Estos resultados contrastan fuertemente con los transitorios adquirido de cardiomiocitos cultivadas en laminina. Las grandes, irregulares transitorios se obtuvieron el día 1, y el tratamiento con ouabaína causado una reducción del 80% en altura y transitorio aumento de los niveles de calcio intracelular comprobado por un nivel basal planteadas. Al día 4, aunque el aumento de los niveles de calcio intracelular al final de cada transitoria fue todavía evidente, la reducción de picos de altura es mínima.

DISCUSIÓN

Miocardio dedifferentiation ha sido reconocido como parte del grupo de reparación y los mecanismos compensatorios que se inician en la enfermedad cardíaca. 14 - 16 Muchos investigadores utilizan actualmente los adultos miocitos cultura para examinar los modelos de estos cambios y miocitos volver a un natal o perinatal. 17, 18 Por lo tanto, nos corresponde determinar si las células cultivadas en efecto, reflejar en vivo y ambientes que vías de señalización y mediciones de flujo de calcio en estos modelos son útiles para la comprensión de la función de la célula cardíaca y las enfermedades del corazón, sobre todo cuando la recolección de células cultivadas se está convirtiendo cada vez más común para la regeneración de los tejidos y de órganos de reparación.

Se utilizó una serie de marcadores para delimitar el desarrollo de cardiomiocitos neonatales e investigar la dedifferentiation de miocitos aislados de adultos. También se examinaron los efectos de una simple y una compleja matriz de la cultura en el crecimiento celular, nuestra hipótesis inicial de que la polaridad de los cultivos de células podrían conducir a que los datos adquiridos no es totalmente reflexivo de los mecanismos in vivo. También midieron las actividades de 2-membrana exterior de intercambio iónico mecanismos, la β-adrenérgicos a través de isoproterenol estimulada intracelular de calcio aumenta, y la Na + K-ATPasa, a través de la inhibición de la ouabaína compensatoria cambios intracelulares de calcio, para determinar en qué momento, en todo caso, el particular cardiomiocitos influido en la cultura matriz de resultados de tales experimentos.

La tendencia general en los miocitos es para el complejo, sintetizadas en fibroblastos cardiogel matriz para mejorar la distribución de las proteínas en toda la celda y en la superficie de la célula a un ritmo más rápido que se encuentran en miocitos cultivados en la sencilla, laminina superficie. Sin embargo, esta tendencia no es la misma para todos probaron las proteínas, sobre todo en lo encontró con ouabaína de inhibirse transitorios (Fig. 6]. Nuestra teoría con respecto a estas proteínas es que las distribuciones neonatal miocitos son realmente en el proceso de formación de las proteínas en el núcleo de Golgi, retículo endoplasmático complejo, con los productos luego ser distribuidas a lo largo de la célula, a menudo revelando una centralizado, clumped pauta en el desarrollo temprano. Sin embargo, como puede verse, este modelo centralizado fue aún más pronunciada a principios de las culturas de miocitos adultos, probablemente debido a una nueva formación de proteínas ya presentes y, a continuación, una respuesta rápida, compleja matriz de apoyo, para la distribución intracelular lugares adecuados, un empresa que por lo general se completa por día 4 a las culturas de adultos, pero más lento en miocitos neonatales. Por lo tanto, la polaridad de la célula que sí existe es superar más rápidamente el cultivo en una compleja matriz.

Nuestras conclusiones son, por tanto, que el cultivo de cardiomiocitos en una compleja matriz aumenta un rápido desarrollo de las células en todos los aspectos, es decir, tamaño, desarrollo de orgánulos subcelulares, proteínas, etc, y también da lugar a una rápida pérdida de polaridad celular, posiblemente en beneficio de los investigadores en términos de interpretación de sus resultados. Cultura y matrices de cultura veces por lo tanto, requieren una consideración muy cuidadosa, y que bien podría ser un punto importante a considerar en la recolección de células para su implantación.

Trabajo previo en nuestro laboratorio ha investigado dedifferentiation miocitos y las posibles consecuencias de este fenómeno en la disfunción del corazón, 13 se centra en los trastornos en la generación de señales y los flujos de calcio. Este trabajo actual demuestra que, como ocurre dedifferentiation, hay una migración de proteínas hacia una ubicación central, a continuación, redistribución, indicando en un intento de los cardiomiocitos para formar una fase temprana de la célula, posiblemente orientadas a la formación de nuevas células. Esta teoría recibe algún apoyo del hecho de que muchos binucleate miocitos se encuentran aislados en las culturas de adultos. Estos hallazgos son importantes en la investigación dirigida a miocitos sustitución estrategias para superar la fibrosis cardíaca y necrosis in situ, en la que podría ser importante a la cultura fetal y neonatal células hasta un punto que sean plenamente funcionales y de tal manera que se supera la polaridad las células y los donantes están dispuestos a interactuar inmediatamente con el ECM de los receptores de órganos o tejidos.

Promesa en el trasplante de células cardiacas para mejorar la función cardiaca se ha demostrado con una serie de tipos de células, incluidas las del músculo liso (19) y esquelético myoblasts (20). No obstante, un reciente informe (21) detalladas pobres viabilidad de las células trasplantadas, con la muerte de las células de donantes que se rápida. Estos autores también observaron que la respuesta inflamatoria represión también es deseable y que las células son previamente. Tal vez, lo que permite a las células para desarrollar una etapa posterior que es considerado por lo general, y el cultivo de estas células de manera tal de permitir la polaridad que hay que superar, podría ser beneficiosa en ambos inmediata activación de células y viabilidad.