La alimentación y el ayuno controles hígado expresión de un ente regulador de la proteína G de señalización (Rgs16) en hepatocitos periportal

Homeostasis del peso corporal se mantiene por medio de complejas comunicaciones entre el cerebro y los órganos periféricos [1 - 8]. La disminución de peso corporal durante el ayuno promueve el aumento de la ingesta de alimentos y disminuyó el gasto energético. Por el contrario, el aumento de peso después de varios grandes comidas es compensado por una disminución de la ingesta de alimentos y el aumento del gasto energético. Muchos de los orexigenic y anorexigenic proporcionar señales de control dinámico de la energía y la homeostasis del peso corporal se transmite por la proteína G unida receptores (GPCRs) en el cerebro y la periferia [5, 9, 10]. En este sentido, investigar un nuevo enfoque para entender cómo la proteína G de señalización en el hígado regula la actividad metabólica para mantener el peso corporal y balance energético.

El ciclo de actividad de las proteínas G heterotrimeric gira en torno a los receptores de nucleótidos guanina catalizó el intercambio y la hidrólisis de GTP en la subunidad α G. En el estado inactivo, G α ^PIB forma un complejo con heterotrimeric G βγ. Hormona vinculante para GPCRs activa señalización intracelular de catalizar el intercambio de nucleótidos guanina en la subunidad α G [11]. Active G α ^GTP y subunidades βγ G disociar para regular las proteínas efectoras y la posterior producción de segundos mensajeros que provocan respuestas celulares a estímulos fisiológicos. Hidrólisis de GTP a G α restablece el complejo inactivo heterotrimeric de G α βγ ^PIB. Reguladores de señalización de proteínas G (RGS) las proteínas son la activación de proteínas GTPase (BPA) de Gi y Gq clase subunidades α [12 - 15], y están alejadas a rgRGS proteínas que aceleran la hidrólisis de GTP G12 clase subunidades α [16, 17] . RGS proteínas regular las características, intensidad y duración de Gi y Gq señalización [18]. RGS proteínas de la familia R4, como Rgs16, son inhibidores de retroalimentación que puede poner fin a la disociación de señalización de la hormona del efector vinculante de la proteína de activación [19 - 21].

Una característica útil de la expresión génica RGS es que puede ser inducida por los agonistas GPCR y segundos mensajeros [22, 23]. Un paradigma para la retroalimentación regulación de la proteína G de señalización de proteínas RGS se estableció mediante el análisis de la levadura de apareamiento respuesta [24]. El apareamiento GPCR feromonas son ligandos que estimulen la detención del ciclo celular en células haploides. La proteína G subunidad alfa (GPA-1) las emisiones G βγ para estimular una MAP quinasa en cascada resultado de la activación transcripcional de la respuesta de apareamiento vía [25 - 27]. Curiosamente, la transcripción de los genes de levadura RGS TSM-2 también es inducida por el apareamiento de feromonas [28]. TSM-2 es el BPA para GPA-1 y es el más importante producto génico de feromona de desensibilización y el reingreso en el ciclo celular [28, 29]. Hemos aplicado este paradigma de GPCR-inducida por ligando RGS expresión de genes para identificar y caracterizar la proteína G de señalización en el hígado durante el ayuno y refeeding porque nos ha hecho varias observaciones que indican que GQ y las proteínas RGS influido y respondió a los cambios en el metabolismo del hígado.

Se encontró que los ratones knockout deficientes en cualquiera de los dos G q α o su estrecha paralog, G α11 [30], exhiben anomalías en la regeneración hepática tras hepatectomía parcial (Yu y Wilkie, observación no publicados). RGS Dado que las proteínas son esenciales reguladores de Ca ⁺² señalización evocados por Gq/11-coupled agonistas [19, 21, 31], motivado RGS que un gen podría ser inducida en respuesta a la activación de Gq/11 de señalización durante la regeneración hepática. Hemos encontrado Rgs16 fue rápidamente hasta reguladas tras hepatectomía parcial, lo que sugiere un papel en la respuesta metabólica a la pérdida repentina de 70% del hígado. Por lo tanto, exhibió la ayunas hígados de ratones y refed para la regulación diferencial de genes RGS. Es interesante señalar que de los 20 genes clonados RGS, sólo Rgs16 ARNm se indujo en el hígado durante el ayuno. Nuestros estudios se describe en esta sección Rgs16 demostrar que es un gen regulado diurnally periportal en hepatocitos del hígado, su expresión está regulada por la alimentación y la dieta, por su parte, y Rgs16 puede ser usado como un biomarcador para investigar G-proteína en el hígado vías de regulación de la homeostasis energética.

La diurna expresión de Rgs16 se caracterizó en el hígado de C57BL / 6 ratones hembra (par jaula) con el libre acceso a los alimentos y el agua en condiciones de 12 horas luz / oscuridad, y se sacrificaron cada 4 horas de tiempo en nueve puntos a lo largo de 36 horas (Fig. 1A]. Curiosamente, Rgs16 mRNA acumulado hacia el final de la fase de luz, justo antes de empezar cuando la alimentación de animales. Rgs16 mRNA regresaron a niveles basales durante la fase oscura, presumiblemente después de la alimentación, y se mantuvo en niveles basales hasta mediados de la próxima fase de luz. Rgs16 los niveles de mRNA fueron siempre regulado por ocho horas en la fase de luz (Zeitgeber tiempo de 8 h; ZT8), pero alguna variación en la expresión se observó a ZT12 (Fig 1A, compare ZT12 vs Día 1 Día 2). Alrededor de la mitad de la ad libitum que los ratones alimentados ensayadas a ZT12 expresó un alto nivel (similar al ZT8) Rgs16 de ARNm en hígado (n> 40), mientras que los ratones con una menor expresión probablemente se inició la alimentación antes de luces hacia fuera (véase más adelante). El ritmo diurno en Rgs16 expresión se observó en machos y hembras de ratones y ratas que van a la edad de cuatro semanas a más de un año. Oscilación diurna en expresión mRNA en el hígado no se observó a ninguna de las otras 19 RGS genes expresados en ratones [32].

Rgs16 es uno de un pequeño subconjunto de los genes que se diurnally regulado en el hígado y tanto el hipotálamo suprachiasmatic núcleos (SCN), sitio de la central marcapasos circadiano [33, 34]. Nos mostró por hibridación in situ Rgs16 mRNA que se expresa en el SCN de C57BL / 6 ratones hembra en nuestra colonia en el mismo patrón temporal como se informó anteriormente (Fig. 1B; [35]]. Por otra parte, este patrón temporal de expresión Rgs16 en el SCN se mantiene en alimentadas ad libitum ratones alojados en constante oscuridad (CD) para dos días antes de su sacrificio en el tercer día; expresión es elevada a las 6 Horas en la fase de presunción de luz (CD6) y se niega a los niveles basales de 2 horas en el presunto fase oscura (CD14; Fig. 1C]. Por lo tanto, Rgs16 expresión en el SNC parece ser arrastrado al igual que otros genes regulados circadiano [35, 36].

Para determinar si Rgs16 expresión mRNA en el hígado se upregulated en previsión de una comida, pero regresó a niveles basales después de la alimentación, hemos examinado el efecto de la retención de alimentos en los niveles de mRNA Rgs16 refeeding y en diferentes momentos en el ciclo de luz. El ayuno ratones para distintos intervalos provocado un aumento de Rgs16 expresión mRNA a través de los principios de media-hora de la primera fase oscura (Fig. 2A, carriles de 1,4). La inducción de la expresión mRNA Rgs16 en una fase temprana del período de ayuno fue constantemente observada en grupos separados de ratones hembra de ZT4 ayunas, pero los niveles de expresión comenzó a variar como los ratones fueron ayunas a través de la oscura etapa de ZT12 hasta el día siguiente (Fig. 2A, carriles 6-7; Fig. 2B; línea sólida). Por el contrario, phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) expresión nunca disminuyó en cualquier momento a cualquiera de los ratones en ayunas (Fig. 2B; línea discontinua). En todos los casos, Rgs16 (y PEPCK) mRNA expresión regresó a los niveles basales de cuatro horas antes de proporcionar chow ad libitum (Figura 2A, las condiciones 3,5,8) o dentro de los 90 minutos después de sonda de una completa dieta líquida (Fig. 2C] . Con sonda de agua no afectará a Rgs16 expresión, lo que sugiere que la dilatación del estómago o la motilidad gastrointestinal no son factores que regulan el hígado Rgs16 expresión durante el ayuno y refeeding.

Las funciones metabólicas del hígado se distribuyen entre las zonas de hepatocitos organizados en acinos 37]. Lypolysis gluconeogénesis y ocurren preferentemente en periportal hepatocitos, mientras que glycolysis lipogénesis y se producen preferentemente en hepatocitos en torno a la vena central 37]. Los tipos de células hepáticas que expresó Rgs16 ARNm se identificaron mediante hibridación in situ. Curiosamente, Rgs16 expresión en ratones en ayunas fue localizado a periportal hepatocitos que rodean la tríada portal, consistente en una vena porta, arteria hepática, y una vía biliar (Fig. 3A, B; mismas condiciones en que se Fig 2 condición 4). Rgs16 expresión sigue siendo fuertemente restringido a periportal hepatocitos, incluso después de las 24 Horas rápido. Por el contrario, PEPCK ARNm se expresa en hepatocitos en todo el hígado de ratones en ayunas, aunque es más abundante en periportal hepatocitos (Fig. 3D]. Periportal expresión de Rgs16 y PEPCK fue confirmado por examen histológico. De acuerdo con los análisis anteriores del Norte, Rgs16 mRNA expresión no fue detectada por hibridación in situ en el hígado de ratones alimentados (Fig 3C; mismas condiciones que la figura 2, carril 2). En experimentos adicionales de control, sentido de sondas Rgs16 y PEPCK no hibridizar adyacentes a las secciones (datos no presentados). El patrón restringido de expresión a Rgs16 periportal hepatocitos sugiere que Rgs16 podrá regular la lipólisis y / o gluconeogensis en el hígado.

Reglamento de Rgs16 de ayuno y sugirió que refeeding alimentación restringida (RF), durante 4 horas de la luz fase (ZT5-ZT9), podría cambiar Rgs16 expresión en el hígado, junto con factores de transcripción que controlan el reloj circadiano en los tejidos periféricos [35]. Nos caracteriza Rgs16 expresión mRNA en C57BL / 6 ratones hembra durante los primeros 4 días de RF (Fig. 4]. Como era de esperar, Rgs16 se expresó en el hígado de ratones en ayunas y se redujo a niveles basales de la final del 4 hr período de alimentación (ZT5-ZT9). La alimentación restringida avances y se intensifica Rgs16 expresión en el hígado por el segundo o tercer día de RF (Fig. 4], coincidiendo con el aumento de la actividad locomoter como ratones aprenden a anticiparse a la alimentación durante la fase de luz [38].

El primer día de RF, Rgs16 expresión mRNA en el hígado no es mayor a ZT5 que en alimentadas ad libitum ratones (ver Fig. 1, carril 1, 2), a pesar de que la RF fueron ratones en ayunas a través de la oscura etapa y ha perdido 2,5 gm a partir de su peso (Fig. 4, panel central). Esto puede reflejar una subyacente circadiano regulación de la expresión génica del hígado como reloj genes muestran una respuesta similar en el primer día de RF [35, 36, 38]. Durante las primeras 4 horas de alimentación período (día 1), las mujeres ratones comían alrededor de 1,5 g de chow y recuperó alrededor de 1 g de peso corporal (Fig. 4, panel inferior). Sin embargo, que comían alrededor de la mitad como mucho el día 1 como en los días posteriores, presumiblemente porque aún no habían aprendido a anticipar el ayuno durante la fase oscura y la alimentación durante la fase de luz. Al día 2 de RF, antes de alimentar a ZT5, los ratones perdieron unos 3,5 g de su peso original, pero se les alerta y activa, y se comió a voraciously refeeding, con un consumo de aproximadamente 0,7 gm chow dentro de los primeros 30 min, 2,5 g durante 4 horas . Este comportamiento se repitió días 3 y 4 de RF, y cada día los ratones recuperó el peso corporal dentro de alrededor de 1 gm a partir de su peso.

Oscilaciones en Rgs16 expresión mRNA son ligeramente retrasado en el hígado en relación con el SCN en alimentadas ad libitum ratones se mantienen en un 12 hr luz-oscuridad ciclo [35, 36, 38]. Por el contrario, alimentación restringida durante la fase de luz y se intensifica los avances Rgs16 expresión en el hígado, pero no altera la expresión en SCN (Fig. 4, panel superior), presumiblemente por separado que refleja los aportes de nutrientes y la regulación de luz Rgs16 expresión en el hígado y el SNC.

Transcripción de la Rgs16 gen es inducida durante el ayuno y se inhibe después de la alimentación. De peso corporal y el consumo de alimentos de los hombres C57BL / 6 ratones (jaula individual) bajo condiciones de RF se muestra (Fig. 5B]. El día 3 de RF, en ayunas hombres fueron sacrificados en ZT5, o permitir que la alimentación de los 20, 40, o 60 min antes del sacrificio. Nuclear run-en ensayos mostraron que la transcripción de genes Rgs16 disminuyó aproximadamente 5 veces más rápido de los niveles dentro de los 20 minutos, y no era detectable por encima de fondo de 60 min (Fig. 5A]. Por el contrario, la transcripción de GAPDH, Rgs8, cyclophilin, y G α11 se mantuvo esencialmente constante en el hígado de alimentados y en ayunas ratones (Fig. 5A, y los datos no presentados). Rgs16 los niveles de mRNA disminuido alrededor de 4 veces en los primeros 20 minutos después de refeeding, en consonancia con la disminución de la transcripción durante el mismo intervalo.

Rgs16 mRNA y expresión proteica en el hígado después de un corto rápido fue algo mayor en los ratones normales a mantenerse chow en comparación con una dieta con alto contenido en grasa (Fig. 6]. La alimentación está regulado tanto por Rgs16 ARNm y proteínas a niveles basales dentro de las cuatro horas (Figs. 2A, 6A, y datos no presentados). Para comparar la disminución de Rgs16 mRNA y los niveles de proteína después de la alimentación, las mujeres fueron ratones en ayunas de ZT4 a ZT12 y, a continuación, siempre chow ad libitum a ZT12, y sacrificado a recoger el hígado en el momento indicado (Fig. 6A]. Rgs16 mRNA y los niveles de proteína se redujo simultáneamente dentro de los 20 minutos después de la alimentación, la caída casi a niveles basales dentro de los 60 min. Una rápida disminución de la expresión mRNA Rgs16 también se observó cuando los ratones hembra se refed por sonda (1 ml) de una completa dieta líquida a ZT12 (Fig. 1]. En resumen, una completa refeeding chow o dieta líquida por Rgs16 regula en masculino y femenino ratones (n> 100) y ratas (n = 6).

Rgs16 es uno de los pocos genes cuya expresión oscila en un patrón circadiano en tanto el hígado y el SNC (Figs. 1, 2, 3, 4] [35]. Rgs16 oscilatoria y otros genes en el hígado se sincronizan por la alimentación de tiempo, mientras que el SCN, presumiblemente, las neuronas responden a la luz estimula la liberación de neurotransmisores sinápticos en los cruces con las neuronas de la retina-hipotálamo del tracto. Muchos de los genes que oscilan tanto en el hígado y el SNC son factores de transcripción integral a los reloj circadiano [35, 36, 38, 39], mientras que Rgs16 es un BPA para alfa proteínas G de la Gi y Gq clase [31, 40, 41 ]. Rgs16 y estrechamente relacionados con las proteínas RGS en la familia R4 regular negativamente la señalización de proteínas G [18], y puede inhibir comentarios Gi / Gq señalización de la hormona de disociación vinculante de la activación de proteínas efectoras en una gran variedad de tipos de células primarias [19, 21, 31]. El patrón de expresión y la actividad enzimática de Rgs16 lo identifica como un candidato regulador de Gi / Gq señalización durante las transiciones de ayuno a la alimentación en el hígado y entre luz y oscuridad en las fases SCN.

G-proteína unida ligandos estimular la expresión de genes en RGS eucariotas de la levadura a los mamíferos [18, 22 - 24]. Por ejemplo, la levadura de apareamiento feromonas son GPCR-ligandos que inducen tanto la detención del ciclo celular y la transcripción y traducción de la proteína de levadura RGS TSM-2, lo cual es necesario para una rápida desensibilización del apareamiento de feromonas y de reingreso a la del ciclo celular [28 ]. Debido a que la primera fase de la regeneración hepática se altera en ratones mutantes deficientes en Gq de señalización (datos no presentados), se aplicó la levadura como paradigma nuestra razón de ser la expresión de cribado de todos los genes RGS en el hígado de alimentados y en ayunas ratones para identificar y Gi / Gq o vías de señalización que regulan el metabolismo del hígado.

Se encontró que Rgs16 es el único gen RGS (total de 20 [17]] que es diurnally expresado en el hígado ad libitum de los ratones alimentados (Fig. 1]. Los ratones son nocturnos, siempre y cuando ad libitum acceso a los alimentos y el agua, comen casi el 80% de su alimentación diaria durante la fase oscura en un 12 hr luz: oscuridad (12hL: D) ciclo. Rgs16 ARNm se acumula en el hígado en previsión de una comida, ya sea al final de la fase de luz en ratones llevan de 12 hr L: D ciclo (Figs. 1, 2], o antes de alimentar a ZT5 el día 2 y los días siguientes de alimentación restringida (RF; Fig. 4]. Por otra parte, la amplitud de las oscilaciones diarias en Rgs16 ARNm y proteínas de expresión son modulados por la deficiencia de energía, ya sea aumentado en ayunas ratones cuyo peso corporal está muy por debajo del punto de ajuste (Fig. 4] o disminuido en más de peso en ratones mantiene una dieta con alto contenido en grasa ( Fig. 6A]. Es importante destacar que la tasa de Rgs16 transcripción de genes es inducida por el ayuno y la disminución de los niveles basales poco después de la alimentación (Fig. 5]. Coincidiendo con estos cambios en la transcripción, Rgs16 mRNA y los niveles de proteína disminución dentro de los 20 minutos después de la alimentación comienza, y soltar a los niveles basales dentro de los 120 minutos (Fig. 6]. Curiosamente, si los ratones no se les permite seguir comiendo, pero se limitan a la cantidad que puede consumir a los 30 minutos de refeeding, Rgs16 expresión mRNA vuelve dentro de los 120 minutos (datos no presentados). El apretado localización de expresión para la zona 1 periportal hepatocitos (Fig. 3] Rgs16 lugares en una ubicación ideal para ser reguladas por orexigenic y las señales de saciedad, el intestino, los periféricos y / o del sistema nervioso central. La dinámica y expresión localizada de Rgs16 podría ser regulada por las hormonas y / o metabolitos controlar el metabolismo del hígado.

El hígado ayuda a mantener la energía todo el cuerpo homeostasis en parte por el metabolismo de la glucosa y ácidos grasos. Catabólicos y anabólicos del metabolismo en el hígado se regula en respuesta a las repeticiones al día de ayuno y alimentación, y la disponibilidad de energía almacena en el hígado, adiposo y el músculo. El glucagón y la insulina es la hormona del clásico de los reguladores en ayunas y Estados Fed 42, 43]. Durante el ayuno, al mismo tiempo glucagón estimula la gluconeogénesis, mientras que la inhibición de la síntesis de ácidos grasos en el hígado [44]. El glucagón señalización en hepatocitos es transduced de G α s, que estimula adenylyl ciclasa para producir el segundo mensajero cAMP, con lo que la activación del campamento responda factor de transcripción CREB [45, 46]. Sin embargo, Rgs16 no es un GS-GAP y no se refiere directamente a regular la actividad Gs [18], sino Rgs16 puede ayudar a integrar Gi-y / o Gq-señalización con glucagón o señalización de la insulina en el hígado.

Guiada por el paradigma de la levadura de apareamiento vía, que postula que el Rgs16 expresión es inducida en el hígado durante el ayuno por la activación de la Gi / Gq vía (s) Rgs16 proteína que regula negativamente. Proponemos que un agonista preprandial activa un hipotético GPCR vía que induce la transcripción de genes Rgs16 y, posiblemente, promueve la estabilidad Rgs16 mRNA. Curiosamente, Rgs16 proteína no es abundantemente expresado en el hígado de ratones en ayunas. Tomamos nota de que Rgs16 RGS y otras proteínas de la subfamilia R4 normalmente son débilmente expresadas en muchos tipos de células y tejidos, a pesar de abundantes mRNA expresión [47]. Una posible explicación de este patrón es Rgs16 ARNm se acumula durante el ayuno y se prepara para la traducción, depende de otros factores dietéticos.

Rgs16 está específicamente expresado en hepatocitos periportal, el oxígeno rico en zona del hígado y la lipólisis, donde predomina la gluconeogénesis, sugiere Rgs16 podrá regular Gi / Gq vía (s) que estimulan la oxidación de ácidos grasos y / o la producción de glucosa en el hígado. Porque refeeding rápidamente Rgs16 termina la transcripción de genes y permite Rgs16 mRNA y la degradación de proteínas, podrían inhibir Rgs16 Gi / Gq de señalización durante la transición de la ayunas a Estados Fed. En este modelo, Rgs16 funciona como un interruptor, apagando preprandial señalización en el hígado una vez que ha comenzado la alimentación. Dado que la expresión hepática de Rgs16 y genes reloj circadiano rápida y coordinadamente ajustarse a los cambios en los horarios de alimentación, Rgs16 podría regular la alimentación de señales que reiniciar el oscilador circadiano en el hígado.

Rgs16 es el único gen RGS (de 20 total) que se diurnally expresado en el hígado ad libitum de los ratones alimentados. La restricción de la alimentación arrastrado Rgs16 transcripción y expresión mRNA en el hígado, pero no afectará a la regulación circadiana de Rgs16 expresión en el SCN. Por lo tanto, regular por separado los insumos Rgs16 expresión en el hígado y el SNC. Rgs16 de genes de transcripción, mRNA y los niveles de proteína son rápidamente abajo regulado por la alimentación. El patrón de expresión y la actividad enzimática de Rgs16 lo identifica como un candidato regulador de Gi / Gq señalización durante las transiciones de ayuno a la alimentación en el hígado y entre luz y oscuridad en las fases SCN.

^[32 P]-dCTP fue adquirido de Amersham Bioscience (Piscataway, NJ). TRIZOL fue adquirido de Invitrogen (Carlsbad, California) y GeneScreen membranas de nylon se obtuvieron a partir de Nueva Inglaterra Nuclear (Shelton, CT). Todos los demás suministros de laboratorio fueron adquiridos de Sigma (St Louis, MO) o Fisher (Hampton, NH).

Los ratones fueron mantenidos a 20 ° C en virtud de una norma de 12 horas luz: oscuridad ciclo (12h L: D, a las luces a las 5 am). C57BL / 6 animales fueron comprados a Laboratorios Jackson (Bar Harbor, Maine). Mujeres C57BL / 6 ratones en estudios de alimentación fueron par-jaula salvo que se indique; ratones machos fueron enjaulados individualmente durante estudios de alimentación restringida. Los ratones fueron alimentados ad libitum ratón estándar Chow (Chow normal) con el 6% total de energía en forma de grasa (Teklad 7002, Harlan Teklad Laboratories, Indianapolis, IN), excepto cuando se indique lo contrario. El contenido alto de grasa contiene 41% de calorías como grasa-40% de hidratos de carbono-19% de proteína (Teklad # 96001). Los ratones fueron seis a ocho semanas de edad antes de que se está cambiando de un chow normal a dieta con alto contenido en grasa. Investigación experimental en animales seguido directrices reconocidas internacionalmente y ha UT Southwestern IACUC aprobación (APN # 0602-05-01-2).

los niveles de mRNA expresión se determinaron utilizando cuantitativa en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa. Cyclophilin fue utilizado como la normalización de los genes. QPCR primers fueron diseñados utilizando el Primer Express Software v 2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) de mRNA publicado secuencias. Rgs16 (NM_011267) QPCR primers: Adelante - 5'cctggtacttgctactcgctttt3 '; inversa - 5'agcacgtcgtggagaggat3'; Cyclophilin (M60456) QPCR primers: Adelante - 5'tggagagcaccaagacagaca3 '; inversa - 5'tgccggagtcgacaatgat3 ». Total RNA fue extraído a partir de 50 mg de hígado como se describe a continuación en el norte de hibridación Blot. A raíz de DNasa tratamiento, cDNA fue sintetizado a partir de ARN total (2 μ g) a 100 μ l reacciones Superíndice II usando la transcriptasa inversa kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) y almacenados a -20 ° C hasta su uso. Reacción de polimerasa en cadena amplificaciones se realizaron en 96-óptico y placas de reacción (ABI) en el ABI Prism 7000 Sequence sistema de detección utilizando el SYBR-Green (ABI) condiciones de reacción (1 ciclo a 50 ° C durante 2 min, 1 ciclo a 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 min), el umbral de referencia y se establecieron a determinado experimentalmente los valores y los datos fueron analizados mediante el comparativo C _T método ( 2 -- Δ Δ C T MathType MTEF @ @ @ 5 + 5 = @ feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacH8akY = wiFfYdH8Gipec8Eeeu0xXdbba9frFj0 = OqFfea0dXdd9vqai = hGuQ8kuc9pgc9s8qqaq = dirpe0xb9q8qiLsFr0 = vr0 = vr0dc8meaabaqaciaacaGaaeqabaqabeGadaaakeaacqaIYaGmdaahaaWcbeqaaiabgkHiTiabfs5aejabfs5aejabboeadnaaBaaameaacqqGubavaeqaaaaaaaa @ @ 33ED ) Como se describe [32]. Relativo Rgs16 mRNA veces inducción se calculó en comparación con combinaron ARN de los ratones alimentados (como en la Fig. 2A, condición 2).

Al momento de la recogida, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y los hígados fueron disecados, congelados en nitrógeno líquido inmediatamente, y se almacenan a -80 ° C para futuros análisis. La extracción de RNA se realizó mediante TRIZOL de acuerdo con el protocolo de fabricación y el hígado de ARN (20 μ g por carril) se utilizó para el análisis del Norte. En pocas palabras, ARN del tamaño de las muestras fueron separados por electroforesis en un 1,0% de desnaturalización de gel de agarosa, transferidos a una membrana de nylon noche a la mañana, y probaron con Rgs16 cDNA en el 50% formamida. Radionucleotide sondas de hibridación o bien al azar priming (cDNA Rgs16; completo marco de lectura abierta) o al final de la etiqueta (18s rRNA oligonucleótido [GCCGTGCGTACTTAGACATGCATG]), tal como se describe [48]. Del Norte mancha hibridación filtros se prehybridized a 42 ° C durante seis horas, hibridizada la noche a la mañana a 42 º C y, a continuación, la membrana se lavó dos veces en 2X SSC a 25 ° C, una vez en 2X SSC / 2% SDS a 55 ° C, y una vez en 0.1X SSC a 25 ° C; filtros se secaron y expuestos a Fuji RA película durante un mínimo de 16 horas. Doble cambio (Δ) en Rgs16 los niveles de mRNA en relación con la expresión basal en D12 (ensayados de densitometría).

Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y los hígados fueron congelados rápidamente en hielo seco y almacenados a -80 ° C. Fresco congelado secciones se redujeron en un criostato y descongelar montados en SuperFrost Plus portaobjetos de vidrio (Fisher Científico, Pittsburgh, PA). Las secciones fueron previamente tratados como se describe, incluida la fijación, anhídrido acético y defatting pasos [49]. Diapositivas con cobertura antideslizante fueron incubadas durante 18 horas a 60 ° C en una cámara de humidificado con una solución tampón que contiene esperma de salmón desnaturalizado el ADN (0,033 mg / mL), tRNA de levadura (0,15 mg / mL), dithiothreitol (40 μ M), y en un cRNA 1 × 10 ⁷ cpm / mL, otras condiciones, tal como se describe [49]. Riboprobes se generaron utilizando una transcripción in vitro kit (Ambion, Austin, TX) mediante el uso de T3 o T7 RNA polimerasa en presencia de ³² P-UTP, y purificado utilizando ARN quickspin columnas. Las secciones fueron tratados con RNasa A (20 mg / mL, 30 min a 45 ° C) y lavado descendente en las concentraciones de citrato de sodio de amortiguación a un rigor de 0.1X SSC a 60 ° C, y secado al aire. Muestras de tejido fueron expuestos a Biomax MR película (Kodak, Rochester, NY), seguido por inmersión en autorradiografía emulsión (NTB2, Kodak), expuestos de una duración adecuada, desarrollado, fijo, counterstained con cresil violeta acetato, una cubierta antideslizante aplicado montaje con DPX los medios de comunicación y visualizarse en virtud de brillantes y microscopía de campo oscuro (Olympus, Melville, NY). Adyacente secciones de fresco congelado hígados fueron utilizados como controles para los efectos de la perfusión en ARNm integridad y la hibridación a sondas sentido.

Los hígados fueron extirpadas con rapidez e inmediatamente congelados en nitrógeno líquido. Hígado (50 mg) fue resuspendido en 1% SDS que contiene un cóctel de inhibidores de la proteasa, incluyendo leupeptina (10 μ g / ml), inhibidor de la tripsina de soja (10 μ g / ml), MG132 (16 μ g / ml), phenylmethylsulfonyl fluoruro (16 μ g / ml), Tosilo lisina choromethyl cetona (16 μ g / ml), fenilalanina y Tosilo choromethyl cetona (16 μ g / ml). Las muestras fueron sonicated (Virtis, Gardiner, NY) y de inmediato se hierve durante tres minutos. Un ensayo de proteínas Lowry fue empleado para cuantifican la proteína y garantizar la igualdad de carga. Las muestras fueron separadas por SDS-PAGE y transferidos a papel de nitrocelulosa. Las proteínas fueron detectados utilizando Rgs16 antisuero (un regalo de Carol Beadling, la Universidad de Cornell). Rgs16 antisuero no atraviesa reaccionar con el ratón recombinante Rgs4 o Rgs8 proteína. Aumento de quimioluminiscencia (Amersham-Pharmacia) se utilizó para detectar el conejo HA-etiquetado anticuerpo secundario. La membrana se vio expuesto a ML película (Kodak Biomax) por 2-15 minutos. Autoradiographs fueron escaneados con un BioRad Fluor-S MultiImager para determinar la intensidad de señal.

Los núcleos de hígado del ratón se aislaron como se describe [50], resuspender en buffer de almacenamiento de glicerol (50 mM Tris-HCl pH 8,3, 5 mM MgCl _2, 0,1 mM EDTA pH 8,0 y el 40% de glicerol) y flash congelado en nitrógeno líquido. Los núcleos fueron almacenadas a -80 ° C y utilizarse dentro de las 4 semanas. Mouse Rgs16, Rgs8 ratón, rata GAPDH cDNA o vectores del plásmido vacío (5 μ g) fueron borrados por ranura en la membrana de nylon GeneScreen (NEF 983, NEN Life Science Products, Inc) según el protocolo del fabricante. El ARN nuclear alargamiento de reacción, el aislamiento de nueva síntesis ³² P-RNA, y la hibridación a cDNA plásmidos se realizó tal como se describe 51]. El importe de hibridadas ³² P-RNA fue su cuantificación densitométricas escaneo (utilizando una Fujifilm FLA-5100 lector de imagen) de phosphorimager pantallas expuestas durante 24 h. Los datos procedentes de diferentes refeeding ayuno y se normalizaron las condiciones para la transcripción del gen GAPDH.

Los experimentos se realizaron en grupos de dos o tres ratones por condición y repetido por lo menos dos veces. Los datos cuantitativos para cada dolencia o punto de tiempo se representan como valores medios ± SEM. GraphPad Prism software (GraphPad, San Diego, CA) se utilizó para realizar todos los análisis estadísticos. Las dos colas, unpaired Student's t-test fue utilizado para determinar diferencias estadísticamente significativas (P <0,05) entre los valores medios.

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

JH contribuido a la QPCR hizo el análisis y la transferencia Western-Blots de ayuno y refeeding experimentos, y el formato final de todas las cifras. VP nucleares llevadas a cabo en vísperas de la alimentación y de restricción de los experimentos. DMK hizo experimentos con alimentación restringida. KY hizo el del Norte-Blots y coordinado hibridación in situ. SJG hizo SCN hibridación in situ. TMW concebido del estudio, participaron en su diseño, ejecución y coordinación. Todos los autores contribuyeron cifras, ayudó a redactar partes del manuscrito, y leído y aprobado el manuscrito final.