LRRK2 en la enfermedad de Parkinson y la demencia con cuerpos de Lewy

La enfermedad de Parkinson (PD) es el más común de los trastornos neurodegenerativos del sistema extrapiramidales, que afecta hasta el 3% de las personas mayores de 65 años y más edad y más de 1 millón de personas en América del Norte [1, 2]. La enfermedad se caracteriza clínicamente por temblor en reposo, rigidez, bradykinesia, y la inestabilidad postural y farmacológicamente de respuesta a l-dopa tratamiento. Neuropathologically, se asocia con la pérdida selectiva de neuronas dopaminérgicas y la presencia de inclusiones intracitoplasmáticas proteínico, conocidos como cuerpos de Lewy (LBS), en la substantia nigra [1]. La etiología y patogénesis de la DP sigue siendo enigmática, pero cada vez más pruebas ha sugerido una base genética para la DP. Mutaciones en genes que codifican Parkin, PTEN-quinasa inducida putativo 1, y DJ-1 son segregados con autosómica recesiva, a principios de aparición familiar PD, mientras que en los genes que codifican α-sinucleína y ricos en leucina repetir quinasa 2 (LRRK2) están vinculados a PD autosómica dominante [3 - 5]. De estos cinco genes, mutaciones LRRK2 sólo han demostrado ser tanto una causa común y un factor de riesgo para los familiares y esporádicos PD PD, respectivamente. Mutaciones LRRK2 representaron hasta un máximo de 6-40% de casos familiares PD dependiendo de los grupos étnicos estudiados, y hasta el 2% de la comunidad base de casos esporádicos PD [6 - 11].

Las clínicas y patológicas características asociadas con las mutaciones LRRK2 se encuentran en la mayoría de los casos compatibles con los de aparición tardía PD, pero puede variar dependiendo del tipo de mutaciones patógenas. Se ha informado de que pacientes portadores de las más comunes mutación G2019S presentar un fenotipo de la enfermedad que es indistinguible de la EP idiopática, que se caracteriza por la clásica Lewy cuerpo patología [12 - 14]. En lugar de ello, los pacientes portadores de menos común R1441C y Y1699C mutaciones pueden tener una enfermedad más variable presentación que puede incluir la DP y otros clínicos parkinsonismo, como la demencia con cuerpos de Lewy (DLB) y parálisis supranuclear progresiva [4]. Estas patologías aparentemente pleomórfico puede reflejar el efecto de patógenos específicos sustituciones en la estructura y función de LRRK2.

El sello neuropatológico de PD es la presencia de libras esférico en tronco cerebral afectada. LB inclusiones son también un rasgo patológico de DLB, pero son de naturaleza más difusa y se encuentran en regiones corticales [15]. Entre las proteínas genéticamente relacionados con PD, α-sinucleína y parkin han sido previamente demostrado ser componentes de libras en los dos PD y DLB [16 - 18]. Ambos α-sinucleína y parkin se sabe que phosphoproteins [19 - 21] y, por tanto, pueden ser reguladas por LRRK2 que actúa como una kinasa funcionales [22, 23]. Por lo tanto, es de especial interés para determinar si LRRK2 también localiza a lbs. Teniendo en cuenta que LRRK2 es una parte tan importante de proteínas con 2527 aminoácidos y proteínas múltiples dominios, hemos realizado un análisis detallado de LRRK2 localización mediante el uso de una batería de anticuerpos contra diferentes regiones que abarcan la totalidad de proteínas para hacer frente a esta importante cuestión. En este sentido, proporcionar pruebas sólidas de que LRRK2 es localizado, tanto in situ y después de forma aislada, a dos libras en PD y DLB.

LRRK2 se predice para ser una gran proteína de 2527 aminoácidos con una compleja composición de los cuales cinco consecutivos dominios; ricos en leucina repite (LRRs), o como R f c omplex proteína (ROC), C-terminal o f R OC (COR) , Mitogen-activated proteína quinasa quinasa quinasa (MAPKKK), y repite WD40 [24]. Para determinar la expresión y localización de LRRK2 en el cerebro, cuatro afinidad de los anticuerpos purificados contra LRRK2 se utilizaron para Western Blot e inmunocitoquímica. Estos anticuerpos se han planteado en contra de diferentes regiones del LRRK2 que abarcan la totalidad de las proteínas (ver Materiales y Métodos para más detalles). El epítopos para AB1 y Ab4 situados en la N-terminal y C-terminal (y, por tanto, fuera de) el núcleo de dominios de la proteína LRRK2, respectivamente, mientras que los de AB2 y PR3 se encuentran dentro de los dominios de LRRs y CDR / MAPKKK, respectivamente. Para caracterizar la inmunoreactividad de estos anticuerpos para LRRK2, expresó humanos LRRK2 en HEK293T y M17 células de transfección transitoria con un vector de expresión de mamíferos pCMV6-XL4/LRRK2. El Western-Blots, los cuatro anticuerpos (AB1, AB2, PR3 y Ab4) fácilmente detectado un prominente banda LRRK2 emigrado a alrededor de 280 kDa, el tamaño esperado para el de larga duración LRRK2, en lisados de células transfectadas, pero no en no-células transfectadas (Figura 1A]. De este modo, los cuatro anticuerpos son altamente específicos para LRRK2 overexpressed en células cultivadas. Ambos no neuronales (HEK293T) y neuronales (M17), las líneas celulares producidas altos niveles de LRRK2 siguientes transfección transitoria con la construcción de su cDNA. El LRRK2 endógeno en no transfectadas las células no se detectaron en el nivel total de proteínas cargadas (10 μ g de lisados). Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que bajo condiciones de desnaturalización de SDS-PAGE, los epítopos de LRRK2 en diferentes sitios son totalmente expuesta y puede ser fácilmente reconocida por los anticuerpos correspondientes a Western-Blots.

Hemos tratado de utilizar estos anti-LRRK2 anticuerpos para detectar LRRK2 cerebro en sujetos sin enfermedades neurológicas y los esporádicos con PD. Los resultados de anti-LRRK2 Ab4 se presentó aquí, pero similares se obtuvieron datos con otros anticuerpos. Como un adicional control de la especificidad de la lucha contra el LRRK2 Ab4, hemos realizado la absorción de antígenos experimento en el que el anticuerpo se incubó con su correspondiente péptido antígeno antes de Western Blot. Como se muestra en la Figura 1B, la inmunoreactividad para LRRK2 de anti-LRRK2 Ab4 fue completamente bloqueadas a raíz de la absorción con su antígeno, lo que confirma que el anticuerpo es sumamente específica para LRRK2. Brain LRRK2 se expresó en niveles muy bajos, pero es detectable mediante el uso de anti-LRRK2 Ab4 cuando 100 μ g de proteína total homogeneizado de cerebro se utilizaron. El LRRK2 las bandas de muestras de cerebro mismo había gel de migración a 280 kDa como que a partir de células transfectadas, con pocos indicios de degradación o autólisis. LRRK2 endógenos en el cerebro homogeneizado a partir de dos temas de control y dos pacientes con EP fue específicamente reconocido por anti-LRRK2Ab4 (Figura 1B]. En general la intensidad del LRRK2 banda fue más fuerte en estas muestras PD en comparación con los controles. En resumen, LRRK2 de cultivos celulares y el tejido cerebral puede ser específicamente identificados en Western blots de diferentes anticuerpos contra una amplia gama de epítopos a lo largo de la proteína.

Los cuatro anticuerpos fueron utilizados para immunostain tronco cerebral secciones de seis casos de PD y emparejados por edad controles. Lo más notable fue la conclusión de que en todos los casos de PD examinados, LBS en el tronco cerebral fueron intensamente etiquetados con AB1 y Ab4 reconociendo LRRK2 _900-1000, que inmediatamente se N-terminal a la primera LRRs dominio y LRRK2 _2500-2527 en el extremo C - terminal, respectivamente (Figura 2A y 2D]. Ambos borde y núcleo de tronco cerebral lbs sido etiquetados de AB1 y Ab4, con un patrón similar a la observada con un anticuerpo para α-sinucleína, una sólida componente de cuerpos de Lewy [16, 17]. De hecho, LBS teñidos para LRRK2 y α-sinucleína en las secciones adyacentes de manifiesto una coincidencia significativa (datos no presentados). Por el contrario, AB2 y PR3 reconociendo el interior LRRK2 _1246-1265 y LRRK2 _1838-2133, respectivamente, no reconoce libras en cualquiera de los casos estudiados PD (Figura 2B y 2C], como también se encontraron para AB2 en un informe anterior [ 25]. Por lo tanto, a diferencia de que en Western blots, sólo los anticuerpos para el LRRK2 regiones fuera, pero no en el interior, los cinco principales dominios de proteínas son capaces de immunostain LRRK2 localizados en libras en secciones de tejido. Nuestros resultados sugieren que los epítopos en el plegado de proteínas dominios son inaccesibles en las condiciones de rutina utilizados para inmunohistoquímica.

LRRK2 también se encontró a ser prominente en la vasculatura en todo el tronco cerebral y las regiones corticales. Este patrón se encuentra también en la no-tejidos enfermos. Curiosamente, los anticuerpos frente a LRRK2 _1838-2133 (PR3, Figura 2G], así como LRRK2 _900-1000 (AB1, Figura 2E) y LRRK2 _2500-2527 (Ab4, Figura 2H] etiquetados la vasculatura, mientras que los anticuerpos a LRRK2 _{1246 -- 1265} (AB2, Figura 2F] sigue siendo negativo para la tinción de los vasos. Además, los órganos de células neuronales y los axones se vieron fuertemente marcados Ab4 (Figura 2H] en todos los casos de PD, pero mucho menos intenso en los casos de control (Figura 2L]. El mismo patrón también se encontró en ambas edades comprendidas entre PD y el control de los casos con AB1 (Figura 2E y 2I]. Sin embargo, no neuronal mancha fue vista con cualquiera de las dos AB2 o PR3 (Figura 2j y 2k). En contraste, los pequeños neuritic procesos positivo con anti-sinucleína, rara vez se etiquetados por cualquiera de los anti-anticuerpos LRRK2 (no se muestra). Se confirmó que el inmunoticción de libras y otras estructuras positivo para LRRK2 es muy específico como lo era en su mayor parte abolido tras la absorción de los anticuerpos primarios con los antígenos correspondientes péptido de LRRK2 (Figura 3]. Tomados en conjunto, se concluye que en el LRRK2 los vasos sanguíneos y las estructuras neuronales (células neuronales y órganos creados en virtud de axones) muestra diferencias regionales de la exposición antigénica sitios como lo demuestra su distinta accesibilidad a los distintos anticuerpos.

En las secciones de tejido de seis casos de DLB, cortical lbs También se etiquetados por la Ab4 y AB1 anticuerpos frente a C-y N-terminal LRRK2 _2500-2527 y _900-1000 regiones LRRK2, respectivamente (Figura 4A y 4B], pero no por AB2 y PR3 a las regiones del interior LRRK2 _1246-1265 y LRRK2 _1838-2133. Estos hallazgos son muy coherentes con el de tronco cerebral libras de PD, lo que confirma la idea de que la LBS de PD y DLB similares pueden tener diferentes composiciones, a pesar de la morfología y localización. Si bien la α-sinucleína anticuerpos teñidos cortical lbs exclusivamente, la lucha contra la LRRK2 Ab4 reconoce no sólo cortical libras, sino también el citoplasma neuronal (Figura 4C] más intensamente que los emparejados por edad los controles (Figura 4D], y paredes de los vasos (Figura 4H]. AB1 también firmemente la etiqueta citoplasma neuronal en estos casos, sino que muestra una pauta más granular (la Figura 4C]. Purificada cortical libras, bioquímicamente DLB aisladas de cerebros [15], fueron positivos para la tinción de ambos anti-α-sinucleína (Figura 4F] y anti-LRRK2 Ab4 (Figura 4E], mientras que omitiendo el principal anticuerpo no reveló el etiquetado de la cortical purificada LBS (Figura 4G]. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican claramente que LRRK2 se localiza a LBS tanto in situ y después de forma aislada, y es un marcador bioquímico para PD y DLB.

Hasta la fecha, varios genes con mutaciones ligadas a formas familiares de PD se han identificado, como la α-sinucleína, Parkin, PTEN-quinasa inducida putativo 1, DJ-1, proteína tau, y LRRK2. Las mutaciones en todos, excepto por encima de LRRK2 se han asociado con el principio de su aparición o patológicamente las formas atípicas de PD. Patogenicidad en las mutaciones LRRK2 se han identificado recientemente en ambos autosómica dominante familiar y esporádico PD PD [6 - 11, 26], y son hasta el momento el más importante factor genético para predecir la aparición tardía familiar y esporádico PD [3, 27, 28] . Aparte de la mayor prevalencia entre los asociados PD genes, mutaciones LRRK2 conducir a un predominio de aparición tardía fenotipo clínico que se asemeja PD idiopática [12 - 14]. LRRK2 se ha convertido en, tal vez, el jugador más relevante en la patogénesis de la DP.

Si bien hay un creciente interés en el papel de LRRK2 en la etiología de la PD, la mayoría de los estudios se han centrado en la predominancia genética utilizando el análisis del ADN de donantes vivos. La escasez de informes sobre los normales y patológicas de distribución de la proteína LRRK2 es probablemente debido en parte a la disponibilidad de anticuerpos específicos y la presencia de epítopos expuestos de LRRK2 en secciones de tejido. Por el contrario, un enfoque alternativo mediante hibridación in situ se ha utilizado para el mapa de expresión de mRNA LRRK2 en roedores y humanos cerebros. Se ha informado que el ARNm de LRRK2 se expresa en dopamina-receptivo (cuerpo estriado), en lugar de síntesis de la dopamina (tronco cerebral), regiones en ratones, ratas y seres humanos [29, 30]. Sin embargo, no se encontraron diferencias entre los sujetos control y PD casos [30]. Es probable que los niveles de mRNA expresión puede no reflejar con precisión la acumulación de proteína LRRK2 en cerebros patológicos.

Hasta ahora, el papel de la proteína LRRK2 en PD patología mediante la detección inmunohistoquímica de libras con un solo anticuerpo ha demostrado hasta ahora difícil de alcanzar. Estudios anteriores han mostrado que un antisuero contra la región central de LRRK2 no reconocen libras [25] mientras que los anticuerpos dirigidos a la N-terminal [31] y C-terminal [31, 32] de la proteína específicamente etiqueta lbs. Las posibles razones de esta discrepancia puede deberse a la diferencia de las condiciones experimentales, como el procesamiento de tejidos y especificidad de anticuerpos. Análisis de proteínas de localización LBS, compuesto por filamentos perfectamente embalados, puede ser difícil, en particular problemas con epítopo de ocultación en las secciones de tejido. En nuestro estudio, una batería de anticuerpos específicos dirigidos contra diferentes regiones del LRRK2 se ha utilizado para el análisis detallado de serie de cortes de tejido de PD y DLB casos. Esta estrategia nos proporciona una oportunidad para superar los obstáculos asociados con la exposición diferencial de los sitios antigénicos de LRRK2. De los cuatro diferentes anticuerpos probados, los dos anticuerpos (AB1 y Ab4), que firmemente etiqueta LBS están dirigidos contra epítopes situadas fuera de los cinco dominios de plegado LRRK2. El anticuerpo contra LRRK2 _1246-1265, AB2, con un epítopo en el LRRs dominio fue negativo para la tinción LB, como se ha publicado [25], así como negativos para las células y órganos creados en virtud de los buques. De hecho, siguen siendo lbs unstained también utilizando un anticuerpo contra otros dominios plegado (LRRK2 _1838-2133), PR3, sin embargo, este anticuerpo reconoce todavía LRRK2 proteína presente en la vasculatura. Postulamos que LRRK2 fuera de las secuencias de plegado dominios (como LRRK2 _900-1000 y LRRK2 _2500-2527) están muy expuestos en libras y la mayoría de las otras estructuras cerebrales. Sin embargo, algunas secuencias en las regiones de plegado LRRK2 (como LRRK2 _1838-2133) están enmascarados en libras, pero no en las estructuras vasculares cerebrales, mientras que otras secuencias (como LRRK2 _1246-1265) están enmascarados en libras, así como otros componentes del cerebro . Cabe señalar que todos los anticuerpos de la prueba es positiva para inmunoreactividad en LRRK2 Occidental Blots. Sin embargo, como se ha demostrado en el presente estudio, su utilidad en el reconocimiento de las respectivas LRRK2 epítopos en secciones de tejidos difiere ampliamente. Nuestro estudio pone de relieve la importancia de la vigorosa investigación en inmuno análisis utilizando varios anticuerpos contra diferentes regiones estructurales para eludir epítopo de ocultación, sobre todo para una gran proteína con una composición compleja como LRRK2.

A la luz de la reciente observación in vitro que LRRK2 sobreexpresión conduce a la agregación de proteínas en las células cultivadas [33], es particularmente intrigante para encontrar una aparente acumulación de LRRK2 en PD cerebros examinados en comparación con el control de los casos. La acumulación de LRRK2 se localiza a LBS, el proteínico inclusiones, en regiones del cerebro más afectadas por PD (tronco cerebral) y DLB (cortical). Nuestros resultados son consistentes con un potencial de ganancia de función para LRRK2 en la patogénesis de enfermedades, y están en consonancia con los estudios genéticos [3, 27, 28] que han encontrado mutaciones LRRK2 hasta el momento la causa más frecuente de PD autosómica dominante y esporádicos PD.

LRRK2 se prevé que contienen varios funcionalmente importantes con múltiples dominios andamiaje de proteínas de señalización y módulos de las actividades, incluidas las relacionadas con Ras GTPase y MAPKKK (mitogen-activated proteína quinasa quinasa quinasa) situado en la parte superior niveles de cascadas de transducción de señales que regulan diversos arreglos de celulares procesos [24, 34]. Por lo tanto, LRRK2 es probable que contribuyan al mecanismo regulador que ayuda a mantener la homeostasis de las funciones neuronales a través de su intrínseca reacciones enzimáticas como GTP vinculante y la hidrólisis, y la fosforilación de proteínas. Los informes recientes han confirmado que LRRK2 de hecho funciona como una quinasa mutaciones patógenas y aumentar su actividad en los modelos de cultivo celular [22, 23]. Curiosamente, otras dos proteínas asociadas con PD, α-sinucleína y Parkin, están localizados a phosphoproteins lbs. Es bien sabido que la α-sinucleína es un componente importante de libras [16 - 18], y una amplia y selectiva de fosforilación de α-sinucleína se ha observado tanto en PD y DLB [19, 20], e in vitro la fosforilación de α - sinucleína se ha demostrado que promover su agregación [35]. Parkin es una ubiquitina ligase, también localizado en libras de PD y DLB [18]. Fosforilación de parkin Se ha demostrado que regulan su actividad ligase ubiquitina [21]. Es importante destacar que, una estrecha interacción entre LRRK2 y parkin se ha informado recientemente [33]. Nuestro presente estudio ha identificado LRRK2 como la primera proteína de señalización que es genéticamente relacionados con PD y uno de los elementos constitutivos de su sello patología. La co-localización de la proteína quinasa LRRK2 en libras puede proporcionar un mecanismo molecular subyacente divergentes causas asociadas con parkinsonismo, incluyendo la fosforilación de proteínas aberrantes y la posterior agregación de proteínas mediada por α-sinucleína y parkin. A medida que el PD y DLB que investigó los casos son esporádicos y pacientes portadoras de mutaciones LRRK2 comunes parecen compartir una típica de aparición tardía presentación de la enfermedad [12 - 14], nuestros resultados sugieren un papel universal de LRRK2 en la etiología y la patogénesis de parkinsonismo. Tomados en conjunto, se concluye que LRRK2 es un componente esencial de libras en PD y DLB. Los patrones de expresión de LRRK2 en condiciones normales y patológicas cerebros que se describe aquí se ayudan a diseñar posibles modelos experimentales de PD, y que es más importante estrategias productivas hacia la terapéutica.

Hemos demostrado que LRRK2 se localiza a dos libras en tronco cerebral idiopática PD y cortical en DLB libras, lo que indica que LRRK2 es, en efecto, un componente esencial de la LBS en estas dos enfermedades neurodegenerativas. Nuestros resultados sugieren que LRRK2 pueden desempeñar un papel importante en la formación de Lewy cuerpo y patogénesis de la enfermedad y PD DLB.

Muestras de tejido se obtuvieron del Centro Médico de Caso y el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (NICHD) Cerebro y Banco de Tejidos para trastornos del desarrollo. Especímenes de tejido cerebral postmortem fueron obtenidos de pacientes con histopatología PD (n = 6; rango de edad 53-76 años), DLB (n = 6; rango de edad 68-85 años), y control de pacientes sin enfermedad neurológica (n = 4 ; Rango de edad 42-79 años para el tronco cerebral y n = 5; rango de edad de 31-74 muestras neocórtex). Las secciones del cerebro medio que contenga substantia nigra pars compacta se examinaron los casos de PD, hipocampo y con el tejido cortical adyacente fue examinada en los casos de DLB. Correspondientes áreas de control de los casos fueron también examinados.

Affinity-purificado conejo anticuerpos policlonales contra las diferentes regiones del LRRK2 secuencia se utilizaron para este estudio. Estos incluyen AB1 (Cat # NB300-267, Novus Productos Biológicos, Littleton, CO) planteó en contra de LRRK2 residuos entre 900 y 1000 (LRRK2 _900-1000); AB2 (Cat # AP7099b, Abgent, San Diego, CA) planteó en contra de residuos entre LRRK2 1246-1265 (LRRK2 _1246-1265); PR3 (Cat # ALX-210-928-C100, Alexis bioquímicos, San Diego, CA) planteó en contra de LRRK2 residuos entre 1838-2133 (LRRK2 _1838-2133), y Ab4 (Cat # NB300-268, Novus Productos Biológicos, Littleton, CO) planteó en contra de LRRK2 residuos 2500-2527 (LRRK2 _2500-2527).

Recombinante LRRK2 se overexpressed de embriones humanos en los riñones 293T línea celular humana o neuroblastoma M17 línea celular, a raíz de transfección transitoria con un vector de expresión de mamíferos que contiene cDNA humanos LRRK2 (pCMV6-XL4/LRRK2; Origene Techonologies, Rockville, MD). Transfección se ha realizado mediante el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), y lisados celulares se recogieron en tampón de lisis (1% Triton X-100 en-buffer fosfato salino con el completo inhibidores de la proteasa (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN) ) Después de 48 h. Brain homogeneizado congelados preparados a partir de muestras de tronco encefálico casos de la enfermedad de Parkinson y la edad controles pareados (10% w / v) se realizaron en una solución tampón que contiene 20 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% NP 40, 0,5% Na deoxycolate, y los inhibidores de la proteasa Completa (Roche). La concentración de proteínas fue determinada con un DC kit de ensayo proteínas (Bio-Rad, Hercules, CA). Un equivalente de 100 μ g (homogeneizado cerebro) o 10 μ g (lisados celulares) de las proteínas se utilizó para el análisis de Western blot. Cell lisados o el cerebro homogeneizado se hierve durante 10 minutos en dodecyl sulfato de sodio (SDS) muestra de amortiguación (3% SDS, 2 mM EDTA, 10% de glicerol, 50 mM Tris-HCl, pH 6.8). Las proteínas fueron separadas por SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE, geles de 6%) y se transferirán a polivinilideno difluoride membranas. Las membranas fueron bloqueadas con un 10% de leche sin grasa preparado en Tris-buffer salina que contiene 0,1% de Tween 20 (TBST) y, a continuación, se incubaron durante 16 horas a 4 ° C con LRRK2 anti-anticuerpos en diluciones apropiadas (AB1, 1:3000; AB2, 1:500; PR3, 1:5000, y Ab4, 1:6000). Como la absorción de control, un anticuerpo se incubó con su péptido antígeno a razón de 1:10 (w / w) por 1 h a temperatura ambiente antes de la disolución final. Tras la incubación con un conjugado con peroxidasa de rábano anti-anticuerpo secundario de conejo (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), LRRK2 fue visualizado por un aumento de quimioluminiscencia (ECL plus kit, Amersham Biosciences), con arreglo a las instrucciones del fabricante.

Tejido cerebral se fijó en formalina y posteriormente fue clasificado deshidratados a través de etanol y xileno soluciones y embebidos en parafina. Seis micras de espesor micrótomo secciones fueron preparados y puestos en silano revestido con diapositivas. Después de la hidratación, las secciones se immunostained de la peroxidasa antiperoxidasa procedimiento utilizando LRRK2 anti-anticuerpos en una dilución final de 1:100 a 1:200. Secciones adyacentes también se immunostained con un anticuerpo para α-sinucleína (Chemicon, Temecula, CA) para localizar los cuerpos de Lewy. Purificada cortical cuerpos de Lewy fueron elaborados a partir de tejido cerebral afectado por DLB tal y como se describe [15], y posteriormente fueron secados en silano de vidrio revestida con diapositivas para inmunoticción de α-sinucleína y LRRK2. Para verificar la especificidad de immunolabeling de LRRK2, primaria de anticuerpos como se omitió un control negativo. Además, la adsorción de control se realizaron experimentos de incubación péptidos (Novus Productos Biológicos) correspondiente a LRRK2 _900-1000 y LRRK2 _2500-2527 con sus correspondientes anticuerpos en algunos casos. La diluido anticuerpos primarios fueron incubados durante 16 horas a 4 ° C con los péptidos (0,2 mg / ml) y se utiliza para inmunocitoquímica.

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

SGC y XZ diseñado estudio global, y ha contribuido a la interpretación de datos y la preparación del manuscrito. AB SLS y se comprometió inmunoticción de cortes de tejido y contribuyó a la preparación de manuscritos. QY prestado asistencia técnica para los ensayos de Western blot. GI TI y siempre purificado cuerpos de Lewy corticales y contribuyó a la preparación de manuscritos. MAS y GP contribuido a la interpretación de datos y la preparación del manuscrito.