BMC Cell Biology, 2006; 7: 39-39 (más artículos en esta revista)

La inhibición inducible de la sintetasa del óxido nítrico por un gas mostaza analógica en macrófagos murinos

BioMed Central
Min Qui (qui@etsu.edu) [1], Victor M Paromov (paromov@etsu.edu) [1], Hongsong Yang (yangh@etsu.edu) [1], Milton Smith (mgsmithmd@isp01.net) [ 2], William L Stone (stone@etsu.edu) [1]
[1] Departamento de Pediatría, East Tennessee State University, Johnson City, TN, EE.UU.
[2] Amox Ltd, Lawton, MI 49605, EE.UU.

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Resumen
Fondo

2-Chloroethyl sulfuro de etilo (CEES) es un agente vesicating de azufre y un análogo de los agentes de guerra química 2,2 '-dichlorodiethyl sulfuro, azufre o el gas mostaza (HD). Ambos CEES y HD son agentes alquilantes que influyen en thiols celular y son altamente tóxicos. En una publicación anterior, informó de que lipopolisacárido (LPS) aumenta la citotoxicidad de CEES murino RAW264.7 en macrófagos. En la presente investigación, se estudió la influencia del CEES sobre el óxido nítrico (NO) en la producción de LPS estimula las células RAW264.7 de señalización, ya que no afecta a la inflamación, muerte celular, y la cicatrización de heridas. Murino macrófagos estimulados con LPS no producen casi exclusivamente a través de inducible óxido nítrico sintasa (iNOS). Sugerimos que la influencia del CEES HD o en el celular la producción de NO puede desempeñar un papel importante en la respuesta fisiopatológica de los tejidos a estas sustancias tóxicas. En particular, se sabe que los macrófagos no ha generado ningún sintetizado por iNOS juega un papel fundamental en la cicatrización de heridas.

Resultados

Inicialmente se confirmó que el LPS en macrófagos estimulados RAW264.7 NO es generado exclusivamente por la iNOS forma de óxido nítrico sintasa. CEES tratamiento inhibe la síntesis de NO (después de 24 horas) en viable LPS-estimulado RAW264.7 macrófagos, medido por tanto la secreción de nitrito en el medio de cultivo o la conversión intracelular de 4,5-diacetato diaminofluorescein (DAF-2DA) o dichlorofluorescin diacetato (DCFH-DA). Western-Blots CEES mostró que transitoriamente se redujo la expresión de iNOS proteína, sin embargo, el tratamiento activo de iNOS con CEES in vitro no inhibe su actividad enzimática

Conclusión

CEES inhibe la producción de LPS en macrófagos estimulados por la disminución de la proteína iNOS expresión. Disminución de expresión iNOS es probablemente el resultado de CEES alteración inducida por el factor nuclear kappa B (NF-κ B) la vía de señalización. Puesto que no puede actuar como un antioxidante, inducida por el CEES baja regulación de iNOS en LPS-estimulado macrófagos podría elevar el estrés oxidativo. Dado que no ha generado ningún macrófagos se conoce a desempeñar un papel clave en la cicatrización de heridas cutáneas, es posible que este trabajo ha fisiológicas pertinencia con respecto a la cicatrización de la piel inducida por HD ampollas.

Fondo

HD es un arma química que puede producir bajas en las situaciones militares y se ha utilizado con resultados devastadores contra la población civil [1]. Amplia y lenta curación lesiones tras la exposición a HD puede suponer una pesada carga sobre los servicios médicos militares y de las organizaciones de salud pública. El diseño de medidas eficaces para HD depende de una comprensión detallada de los mecanismos moleculares por su toxicidad. Mecanismos importantes de la piel inducida por HD lesiones son alquilación de ADN y otras macromoléculas, acompañado por un aumento de especies reactivas del oxígeno (ROS) y la generación de agotamiento intracelular de glutation (GSH) [2 - 5]. El agotamiento de GSH de HD y sus metabolitos se sabe que el cambio redox intracelulares hacia un entorno más oxidados estado con una pérdida posterior de la protección contra los radicales libres de oxidación y una activación de respuestas inflamatorias [6, 7].

Se ha demostrado que induce un HD gran "espectro" de citoquinas inflamatorias en libertad de queratinocitos [8, 9]. Es probable que CEES causar cambios similares en los macrófagos y los leucocitos. Hemos determinado anteriormente que LPS, así como citoquinas inflamatorias, como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y una interleucina-beta (IL-1 β), ampliar considerablemente la toxicidad de CEES RAW264.7 en macrófagos [10]. En los macrófagos, estímulo de LPS, así como de citocinas pro-inflamatorias principalmente, lleva a la activación y translocación nuclear de NF-κ B [11]. Una de las principales consecuencias de esa activación en los macrófagos es una inducción de la expresión iNOS, con la consiguiente elevación intracelular de NO [12]. El efecto del CEES sobre la generación y NO a la NF-κ B vía es potencialmente significativo, ya que no señalización desempeña un papel importante en la inflamación, los mecanismos de muerte celular NF-κ B [13, 14], y la cicatrización de la herida [15, 16]. El presente trabajo describe la inhibición de la producción y expresión iNOS en macrófagos estimulados LPS tratados con CEES.

Resultados
CEES transitoriamente suprime la producción de iNOS y expresión en LPS estimula las células

En la Figura 1a, se analizó la secreción de nitrito en el medio de cultivo celular de RAW 264,7 murino macrófagos después de 24 horas de tratamiento con CEES y diversos niveles de LPS. Nitrito en el nivel medio de cultivo celular, medida por el reactivo de Griess, es un indicador fiable de la secreción de óxido nítrico. Estos datos muestran que CEES (100-500 μ M) inhibe la secreción de NO en la célula por medio LPS estimula los macrófagos en una dosis-dependiente. Los bajos niveles de CEES (≤ 100 μ m) sólo inhibe parcialmente la producción de NO, mientras que niveles superiores a 300 μ M inhibió por completo la producción de NO. Aunque CEES hace disminuir la viabilidad de LPS estimula los macrófagos [10], disminución de la generación de NO no puede ser tomada en cuenta, simplemente por la pérdida de células viables. Figura 1b muestra que en el caso de los niveles de nitrito en el medio de cultivo (según la medición de DO a 532 nm) se normalizan a la cantidad de células viables (DO a 580 nm, MTT ensayo, medida por separado) hay todavía un importante CEES inhibición dosis-dependiente formación de NO.

Con el fin de determinar si CEES influido en los niveles celulares de iNOS, hemos realizado análisis de Western blot (Figura 1c] de la célula usando lisados muy selectiva anti-iNOS anticuerpos con la misma cantidad de proteína total se aplica a cada carril. Control RAW 264,7 macrófagos no detectables iNOS proteína, CEES tratamiento por sí solo no induce ningún iNOS proteínas, pero LPS (10 ng / ml durante 24 horas) produjo una marcada inducción de la iNOS proteína. Al mismo tiempo tratada con LPS (10 ng / ml) y la CEES (300 μ M) hubo una marcada reducción en el LPS de inducción de iNOS proteína.

A continuación, examinó la influencia de 300 μ M CEES en el curso temporal de la producción de NO en los macrófagos estimulados con 10 ng / ml LPS. Figura 2a muestra que CEES retrasos, pero no impide, la producción de NO (medido por la formación de nitritos) en LPS-macrófagos estimulados. De hecho, después de 12 horas, la tasa de producción de NO es aproximadamente la misma en las células tratadas con LPS solos en comparación con las células tratadas con LPS y CEES. Western blot de datos (figura 2b] de las células utilizadas en la Figura 2 muestran un patrón similar: LPS induce por sí sola robusto iNOS expresión proteica que es completamente inhibidas por CEES durante un máximo de 6 horas. Después de 12 horas, sin embargo, las células incubadas con LPS CEES y muestran un repunte en la expresión de iNOS y después de 24 horas, la iNOS proteína en las células tratadas con LPS CEES y es muy similar a la observada en las células tratadas con LPS solos . Estos datos muestran que la influencia del CEES en tanto la síntesis de óxido nítrico y expresión iNOS es transitoria.

CEES no inhibe la actividad enzimática iNOS in vitro

Con el fin de evaluar el posible efecto inhibidor directo del CEES sobre iNOS actividad in vitro, hemos medido las tasas intracelular de 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) o dichlorofluorescin (DCFH) la oxidación en los macrófagos intacta. Dichlorofluorescin diacetato (DCFH-DA) es permeable a la membrana plasmática celular y las esterasas intracelulares convertirlo en una membrana impermeable (DCFH) que se forma puede ser oxidado a diclorofluoresceno altamente fluorescentes (DCF) de los radicales libres. En los macrófagos, la oxidación de DCFH ha demostrado ser sensible y relativamente selectivo de la sonda para el control intracelular de NO por iNOS formación [17].

El uso de DCFH-DA y DAF-2DA, hemos sido capaces de vigilar continuamente la formación de NO en los macrófagos intacto dentro de un conjunto de condiciones. Anteriormente, nosotros [18] y otros [19] han demostrado que exclusivamente LPS induce la iNOS forma de la sintetasa del óxido nítrico en macrófagos murinos. Figura 3a muestra DCFH oxidación en las células RAW 264,7 estimulado con diferentes niveles de LPS durante 24 horas. En ausencia de LPS, la tasa de oxidación de DCFH es extremadamente bajo, pero aumentó con el aumento de la exposición a LPS, sin embargo, este efecto fue casi saturados LPS a niveles superiores a 15 ng / ml.

A continuación, medir las tasas de DAF-2 de oxidación en RAW 264,7 macrófagos estimulados con 20 ng / ml LPS en la presencia o ausencia de 500 μ M CEES durante 24 horas incubaciones (Figura 3b]. En ausencia de LPS o CEES, mínimo DAF-2 se observó la oxidación. Como era de esperar, LPS inducido por sí sola un marcado aumento en DAF-2 oxidación. A continuación, los macrófagos con LPS incubadas durante 24 horas fueron expuestos (post-tratamiento) a 500 μ M CEES y la tasa de DAF-2 oxidación medido inmediatamente. Como se muestra en la Figura 3b, no se produjeron cambios en la tasa de DAF-2 de oxidación en comparación con las células tratadas con LPS solos. Estos datos apoyan firmemente la idea de que el CEES no iNOS inhiben directamente la actividad enzimática. Se obtuvieron resultados similares con DCFH-DA tinción (datos no presentados). Como era de esperar, los macrófagos tratados simultáneamente con ambos LPS y CEES durante 24 horas muestran una marcada disminución en cualquiera de los dos DAF-2 o DCFH oxidación.

A fin de confirmar que DCFH oxidación es abrumadora, debido a iNOS, incubados LPS-macrófagos estimulados con ebselen (vea la Figura 3c]. Ebselen es un selenoorganic compuesto que puede inhibir la actividad de iNOS [20] y su inducción por LPS [21]. Ebselen (25 μ M) inhibió casi por completo la oxidación de DCFH RAW 264,7 células tratadas con 10 ng / ml o 20 ng / ml LPS. Ebselen no citotóxicos en los niveles utilizados en la Figura 3 (datos no presentados).

Discusión

En general, los experimentos se detallan en el presente trabajo muestran que el tratamiento a CEES LPS-estimulado RAW264.7 murino macrófagos transitoriamente inhibe la generación intracelular de NO por iNOS interferir con expresión más que por la inhibición directa de iNOS actividad enzimática. CEES (así como de HD) someterse a una rápida hidrólisis en soluciones acuosas y esto puede explicar, en parte, por la naturaleza transitoria de su efecto inhibidor sobre la inducción de iNOS [22]. LPS es un componente importante de la pared celular de bacterias gram-negativas y se conoce a desencadenar una serie de reacciones inflamatorias en los macrófagos y otras células que expresan receptores CD14 [23, 24]. LPS es ubicua y está presente en el suero, el agua del grifo, y el polvo. Personal militar y civil que, de hecho, siempre tienen algún grado de exposición al medio ambiente LPS.

LPS estimulación de macrófagos se conoce la participación de la activación de la fosforilación de las proteínas quinasas, así como la activación de factores de transcripción nuclear como el NF-κ B [25 - 28]. Una consecuencia importante de NF-κ B de activación en los macrófagos es la inducción de la expresión iNOS seguido con muy elevada producción de NO [12]. El óxido nítrico ha demostrado que tienen un importante papel en la promoción de la muerte celular, sin embargo, la naturaleza exacta de esta función varía con el tipo de células y la dosis. Los bajos niveles de óxido nítrico proteger RAW 264,7 macrófagos de peróxido de hidrógeno inducido por apoptosis [29], sin embargo, el óxido nítrico también ha sido reportado para inducir apoptosis en los macrófagos J774 [14]. El óxido nítrico puede inducir la muerte celular a través de agotamiento de energía inducida por oxidantes y necrosis inducida por apoptosis.

En la actualidad estamos explorando el potencial mecanismo molecular (s) por el cual interfiere con CEES expresión iNOS en macrófagos estimulados LPS. Es posible que GSH agotamiento causado por CEES determina iNOS expresión. Hay fuertes evidencias que sugieren que el agotamiento y tiol expresión iNOS están relacionados entre sí [30 - 32]. Por ejemplo, LPS estimula macrófagos agotado de GSH muestran una disminución del nivel de proteína iNOS y nitrito de producción [32]. Del mismo modo, tanto in vitro [30] e in vivo [31] los estudios muestran que hepatocitos agotado de tener un GSH disminuyó la producción de óxido nítrico que se debe principalmente a un menor nivel de iNOS mRNA. Vos et al. [31] también han presentado pruebas que demuestren que la modulación de GSH iNOS expresión en hepatocitos se correlaciona con NF-kB de activación, es decir, el agotamiento de GSH se asocia con una falta de NF-kB activación. La influencia de GSH agotamiento no es, sin embargo, coherente en todos los tipos de células. La glucosa inducida por la reducción de GSH en las células intestinales se asocia con NF-kB y la activación de iNOS upregulation la expresión de genes [33].

También es posible que CEES iNOS disminuye la expresión de interferir con el LPS-inducida por la activación del factor de transcripción NF-κ B y / o transductor de señales y activador de transcripción-1 α (STAT-1 α). Es interesante, por lo tanto, que Gray [34] ha encontrado que tanto CEES y HD inhibe in vitro la unión del factor de transcripción activando la proteína-2 (AP-2) alquilantes a través de la autopista AP-2 ADN vinculante secuencia consenso más que por los daños directos a la autopista AP-2, proteína. Por otra parte, es significativo que ni CESS ni sus productos de hidrólisis se encontraron daños a la autopista AP-2 factoring transcripción de una manera que impidió su ADN vinculante [35]. Similares experimentos aún no se han hecho con NF-κ B. Chen et al. [36] también han encontrado que el nitrógeno de mostaza (bis (2-chloroethul) methylamine) también inhibe la unión de la AP-2 a su secuencia consenso. La mostaza de nitrógeno también se mostró a inhibir la unión de NF-κ B de la GC-rica secuencia de consenso debido a las interacciones con el ADN [37]. Es posible, por lo tanto, que también CEES alkylates el NF-κ B secuencia consenso impidiendo así la unión de la NF-κ B de la iNOS promotor. LPS y / o citoquinas-inducible NF-κ B vinculante elementos de la iNOS murino promotor han sido identificadas [38], y son ricas de guanina, que es el principal sitio de alquilación para HD o CEES. El posible efecto del CEES sobre iNOS promotor reglamento se está estudiando.

Aunque la activación de NF-κ B, debido a la mostaza o CEES exposición se han mostrado en diversas líneas celulares [7, 37, 39], el mecanismo detallado de este caso todavía no está claro. Reciente informe [39] mostró que NF-κ B-impulsada por la expresión de genes tiene el máximo a las 9 horas en HD tratados queratinocitos. Por el contrario, en un conejillo de modelo, Chatterjee et al. [40] han demostrado que NF-κ B de activación en los tejidos del pulmón se produce poco después de CEES expondría (1 hora), luego desaparece en menos de 2 horas por completo. Sin embargo, en nuestros experimentos que hicimos no se observó a corto plazo efecto estimulante de CEES NO a la producción o la expresión iNOS (datos no presentados). En particular, la movilidad electroforética ensayos de cambio utilizado por Chatterjee et al. para medir el NF-κ B activación mostrar sólo el estado de NF-κ B, proteínas complejas y proporcionar ninguna información con respecto a su unión a las secuencias de ADN consenso.

La importancia fisiológica de potencialmente disminuido expresión iNOS por la exposición a CEES HD o no se conoce. Considerables pruebas, sin embargo, apoya la opinión de que la producción de óxido nítrico a través de iNOS juega un papel clave en la cicatrización de la herida [41 - 43]. Los estudios en animales [16] han demostrado que los ratones knockout iNOS han mermado la cicatrización de la herida que se invierte por iNOS la transferencia de genes. Soneja et al. [44] han sugerido que la cicatrización de la herida podría acelerarse bajo circunstancias donde el estrés oxidativo y se reduzca al mínimo la producción de óxido nítrico mejora. Hemos iniciado los trabajos para explorar el papel de los antioxidantes en la prevención de la patología inducida por HD en la piel.

Conclusión

Nuestros resultados muestran que CEES transitoriamente inhibe la producción de LPS en macrófagos estimulados mediante la inhibición de la expresión de la proteína iNOS y no por la modulación de la actividad enzimática de la iNOS. La disminución de expresión iNOS inducida por el CEES sugiere que este agente alquilante inhibe el LPS estimula la activación de NF-κ B y / o STAT-1 α factores de transcripción, y esta posibilidad se está investigando. No podemos abordar directamente la importancia fisiológica de nuestros resultados in vitro, sin embargo, disminuyeron tanto la expresión de iNOS y la disminución de la producción de óxido nítrico se asocia con una alteración de la cicatrización de la herida [16, 41, 43, 44]. Es probable que el CEES o HD toxicidad es modulada por un complejo equilibrio entre la producción de óxido nítrico, tiol agotamiento y estrés oxidativo.

Métodos
Materiales

RPMI-1640 medio sin rojo fenol y suero fetal bovino con un bajo nivel de endotoxina se compraron Tecnologías de la Vida (Gaithersburg, MD). Conejo anti-ratón iNOS de anticuerpos se obtuvo de Transducción de laboratorio (Lexington, KY). Peroxidasa de rábano conjugada anti-anticuerpos policlonales de conejo, lipopolisacárido de Escherichia coli serotipo 0111: B4, 3 - (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro (MTT), y 2-chloroethyl sulfuro de etilo se obtuvieron de Sigma Chemical Empresa (St. Louis, MO).

Cultivo de células y tratamientos

RAW264.7 murino como los macrófagos-células (American Type Culture Collection, Rockville, MD) se cultivaron a 37 ° C en un incubador humidificado con un 5% de CO 2 en RPMI-1640 mediano con un 10% de suero fetal bovino, 50 U / ml penicilina y 50 mg / ml estreptomicina (GiBcoBRL Grand Island, NY). CEES fue utilizada como una nueva (2 semanas de edad o menos) 50 mM en la solución stock de etanol secos. LPS fue preparado como un 1 mg / ml de solución stock en PBS y se almacena a -20 ° C hasta un máximo de 3 meses.

MTT ensayo

El MTT (3 - (4,5-dimethylthiazool-2yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro) ensayo fue realizado por una ligera modificación del método descrito por Wasserman et al. [45, 46]. En resumen, al final de cada experimento, las células cultivadas en placas y 96 (con 200 μ l de medio por pocillo) fueron incubadas con MTT (20 μ l de 5 μ g / ml por pocillo) a 37 ° C durante 4 horas. El formazan producto fue solubilized por adición de 100 μ l de dimetil sulfóxido (DMSO) y 100 μ l de SDS 10% en 0,01 M HCl y mide la densidad óptica a 575 nm (Molecular Devices SPECTRAmax Plus Lector de microplacas).

Western blot

Proteína lisados celulares se prepararon como se describe en el protocolo de Transducción de laboratorio (Lexington, KY). En pocas palabras, acerca de 10 6 células adherentes se enjuagarse una vez con PBS frío y solublized de ebullición en 0,1 ml de SDS-PAGE muestra de amortiguación durante 5 min. Concentración de proteínas fue determinada por el ensayo de proteína BCA (Pierce Chemical Co, Rockford, IL). Un 30 μ g de proteína alícuota se separó a través de un 8% SDS-PAGE y electrotransferred en una membrana de nitrocelulosa. Western Blot se realizó con un antisuero policlonal de conejo contra el C-terminal (961 a 1144 aminoácidos) de la secuencia del ratón iNOS (Transducción Lab, Lexington, KY). La proteína se detectó un mayor uso de quimioluminiscencia kit de Amersham Life Science (Arlington Heights, IL). INOS murino (Calbiochem, CA) fue utilizado como control positivo.

Determinación de la producción de NO

La producción de NO, NO celular que refleja la actividad de la sintetasa, se estimó a partir de la acumulación de nitrito (NO 2 -), un producto estable de NO, en el medio. Nitrito se midió usando el reactivo de Griess de acuerdo con el método de Green et al. [47]. En pocas palabras, una parte alícuota de un medio de cultivo celular fue mezclado con un volumen igual de Greiss reactivo que reacciona con el nitrito para formar un azo-producto. Absorbancia de la reacción del producto se determinó a 532 nm utilizando un lector de microplacas (Molecular Devices lector de microplacas). Nitrito de sodio se utiliza como estándar para calcular las concentraciones de nitritos.

Intracelular de NO medición

Los ensayos se realizaron con 96-y placas de cultivo de tejidos, tal como se describe por Imrich y Kobzik [17]. La densidad celular se ajustó a 2 × 10 5 / ml, y un 100 μ l alícuota de la suspensión celular en los medios de comunicación se colocó en cada puesto. CEES LPS y soluciones para lograr la deseada concentración se añadieron la placa y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C en el 5% de CO 2. Tras la retirada de los medios de comunicación, el suero libre 1640 RPMI suplementado con 10 mM HEPES que contiene 20 μ M DCFH-DA o 10 μ M DAF-2DA (concentración final) se añadió, y las placas se incubaron durante 2 h a 37 ° C. La intensidad de fluorescencia (fluorescencia relativa unidad, RFU) fue de control permanente utilizando 485 nm de excitación y de emisión de 520 nm en un lector de microplacas florescence (FluoStar lector de microplacas, BMG).

Los análisis estadísticos

Los datos fueron analizados por seguir con la prueba de Scheffe importancia para una p <0,05. Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar. En todas las cifras, los valores medios no comparten una carta común son significativamente diferentes (p <0,05). La media de los valores comunes que comparten una letra no son significativamente diferentes. Los valores promedios y las desviaciones estándar de al menos tres experimentos independientes se presentan en todas las cifras.

Abreviaturas

HD, gas mostaza de azufre

CEES, 2-chloroethyl sulfuro de etilo

LPS, lipopolisacárido

NO, óxido nítrico

iNOS, inducible óxido nítrico sintasa

NF-κ B, factor nuclear kappa B

STAT-1 α, señal de transductor y activador de transcripción-1 α

DCF, diclorofluoresceno

DCFH, dichlorofluorescin

DCFH-DA, dichlorofluorescin diacetato

TNF-α, factor de necrosis tumoral-alfa

IL-1 β, interleuquina-1 beta

AP2, la activación de la proteína 2

MTT, 3 - (4,5-dimethylthiazool-2yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro

DMSO, dimetil sulfóxido

DEM, diethylmaleate

BSO, buthionine sulfoximine

DAF-2DA, 4,5-diacetato diaminofluorescein

Autores de las contribuciones

WLS supervisó la realización global de la investigación, que se realizó en su laboratorio. MQ y HY llevado a cabo todos los trabajos experimentales en este estudio y se lleva a cabo los análisis estadísticos. WLS VP y analizados los datos y redactó el manuscrito. MS (junto con WLS) concebido del estudio, participó en el diseño del estudio, y proporcionó una evaluación continua de los datos experimentales. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por dos Ejército de los Estados Unidos Comando de Investigación Médica de Becas: "La Influencia de la Antioxidante liposomas en macrófagos tratados con gas mostaza Análogos", USAMRMC Grant N º 98164001, y "la aplicación tópica de antioxidantes liposómica para la protección contra la piel inducida CEES Daños ", N º USAMRMC Grant W81XWH-05-2-0034.