Acta Histochemica et Cytochemica, 2006; 39(4): 113-123 (más artículos en esta revista)

Localización de miosina y actina en los Pelage y Whisker de los folículos pilosos Rat

Sociedad Japonesa de Histoquímica y Citoquímica
Kiyokazu Morioka [1], Toshiyuki MATSUZAKI [2], Kuniaki Takata [2]
[1] Laboratorio de EM, El Instituto Metropolitano de Tokio de Ciencias Médicas, Bunkyo-ku, Tokio 113-8613, Japón
[2] Departamento de Anatomía y Biología Celular, Universidad de Gunma Graduate School of Medicine, Maebashi, Gunma 371-8511, Japón

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Resumen

Los efectos combinados de miosina II y actina de músculo y permitir nonmuscle células para generar las fuerzas necesarias para la contracción muscular, la división celular, migración celular, celulares cambios morfológicos, el mantenimiento de la tensión celular y polaridad, y así sucesivamente. Sin embargo, salvo el caso de la contracción muscular, los detalles son poco conocidos. Nos centramos en nonmuscle actina y miosina en la formación y mantenimiento del cabello y la piel, que incluyen muy activa en los procesos de la vida de mamíferos con respecto a la proliferación celular, diferenciación, y el movimiento. La localización de nonmuscle miosina II y actina a neonatal rat dorsal piel, mystacial almohadilla, folículos pilosos, y vibrissal folículos se estudió por técnicas de inmunohistoquímica para sentar las bases para el esclarecimiento de las funciones de estas proteínas. Especificidades de los anticuerpos fueron verificadas por el uso de muestras de los tejidos y someterlos a prueba de inmunotransferencia antes de los análisis morfológicos. La actina y la miosina eran abundantes y colocalized en las apófisis espinosas y capas granulares, pero escasos en la capa basal de la dorsal y mystacial epidermis. En el pelo y folículos vibrissal, nonmuscle actina y miosina se colocalized en el exterior y la vaina de raíz de cabello matriz de celdas adyacentes papilas dérmicas. En contraste, la mayoría de las zonas interiores de la vaina de raíz y matriz de cabello al parecer integrada por cantidades muy pequeñas de actina y miosina. Cabello eje puede comprender miosina significativo en el curso de su queratinización. Estos resultados sugieren que la actina-miosina sistema desempeña un papel en el movimiento celular, la diferenciación, la protección y otras funciones clave de la piel y células ciliadas.

I. Introducción

La piel de la mayoría de los mamíferos tiene el cabello que crece a una longitud de varios milímetros y, a veces, a más de 1 cm en el transcurso de un mes. Esto significa que hay miles de células ciliadas, cuyo diámetro y la altura puede ser <10 μ m, que debe ser generada en un bulbo del cabello cada día. El cabello recién producido células epidérmicas y el formulario de diferenciar al menos tres interior raíz vaina capas, así como la cutícula del cabello, pelo corteza y médula en el folículo [18, 20]. Esta ocupado, activo proceso requiere la rápida sustitución de células basales por el siguiente grupo de dividir las células a fin de mantener un ritmo constante de crecimiento del vello, así como la voraz asimilación no sólo de los nutrientes necesarios, sino también de la hormona-como sustancias reguladoras. En la piel epidermis, la capa de apófisis espinosas se compone de células amorfas con protrusiva estructuras de membrana [7, 16]. Como la piel y células ciliadas que están en la diferenciación son insertado entre una gran masa de proliferación de células queratinizadas y un duro muro, que necesitan un medio de resistencia a la compresión resultante. Esta situación sugiere que una fuerza generadora de mecanismo, como la proporcionada por la combinación de nonmuscle actina y miosina [15] para lograr células movimiento, facilitar los cambios en forma de células, y reforzar el citoesqueleto, puede ser en el trabajo en la piel y el cabello folículos.

Los recientes avances en el estudio de la miosina superfamilia han demostrado que se compone de por lo menos 18 clases; uno de ellos, la clase II convencional miosina grupo en los seres humanos, contiene los productos de 16 genes, entre ellos 6 del músculo esquelético, músculo cardíaco 2, 1 músculo liso, y 3 nonmuscle pesadas cadenas de miosina [3, 9]. Aquí, nos centramos en la nonmuscle convencionales myosins, que se han sugerido que se activa en la citocinesis [8, 14], el movimiento de células [1, 22], quimiotaxis [2, 6], postmitotic la propagación de células [4], célula forma [6, 15, 24], la estabilización del citoesqueleto de actina [29], la incorporación de esperma [23] y enucleación de Células Eritroides [26]. Jazwinska et al. Estudió la distribución de la piel y folicular, ya que los antígenos de reacción cruzada con anticuerpos contra las músculo esquelético pesadas cadenas de miosina [10]. En nuestra investigación, hemos utilizado anticuerpos contra el músculo y la miosina nonmuscle cadenas pesadas de estudiar la localización de los músculos y nonmuscle myosins en la piel y los folículos pilosos basado en el auténtico antígeno-anticuerpo reacciones.

II. Materiales y Métodos
Preparación de muestras

Sprague-Dawley, las ratas se obtuvieron a partir de Nippon SLC Inc (Hamamatsu, Japón). Los animales de 5 a 7 días de edad fueron utilizados para todos los experimentos. La piel del tejido utilizado para immunoblotting fue cortado en pequeños fragmentos en la presencia de 100 veces diluye los inhibidores de la proteasa (sin diluir la mezcla es un producto de Wako Pure Chemical Industries Ltd, Osaka, Japón; código 160-19501) disueltos en buffer fosfato - salina, congelados rápidamente en nitrógeno líquido, y se almacenan a -80 ° C hasta su uso. Los tejidos para la tinción inmunohistoquímica fueron fijadas en formol al 10% neutral solución tampón (Wako) de 24 Horas a 4 ° C, deshidratado, y embebidos en parafina Shandon Histoplast (Thermo Electron Corp, Pittsburgh, PA). Los bloques se seccionaron a 4 μ m de espesor con un micrótomo RM2135 Leica (Leica Microsystems AG, Wetzler, Alemania).

Anticuerpos primarios

Mouse anti-actina de pollo molleja anticuerpo monoclonal (clon C4) se adquirió de MP bioquímicos Inc, Aurora, OH. Mouse anti-humano músculo esquelético miosina pesada cadena de anticuerpo monoclonal (clon A4) fue adquirido de Upstate Corp, Charlottesville, VA. Conejo anti-humano miosina plaquetaria anticuerpo policlonal (BT-561) fue la compra de Biomedical Technologies Inc, Stoughton, MA. C4 y A4, ambos consisten en ascitis de ratón y aditivos, se diluye 1:100 a 1:200 o el 0,1% de BSA en PBS, mientras que BT-561 (un paquete de solución IgG purificada) se diluye a 1:20 de la misma de amortiguación para estudio histoquímico. Por immunoblotting, C4, A4, y se BT561 diluido a 1:500, 1:500 y 1:100, respectivamente.

Immunoblotting

Almacenarse congelados muestras fueron golpeados con una barra de acero inoxidable (SK200, Inc Tokken, Chiba, Japón) y se trituran hasta polvo piezas. La temperatura se mantuvo bajo cero durante esta operación. El polvoroso piezas se calienta a 95 ° C durante 2 minutos en 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4,3% de sulfato de sodio dodecyl, 10% 2-mercaptoetanol, el 30% de glicerol, y el 0,01% Azul de bromofenol solución. Gradiente de geles de poliacrilamida (4 a 20%) para la electroforesis fueron adquiridos de los productos químicos Daiichi Pure Co, Ltd (Tokio, Japón). Immunoblotting ABC-POD kits para ratones y conejos fueron la compra de Wako; los experimentos se realizaron según el manual del fabricante con Wako suministros con excepción de los borrones de amortiguación (EzBlot), que fue obtenido a partir de Atto Corp (Tokio, Japón). EzBlot se compone de tres diferentes buffers de ánodo, membrana de gel, y cátodo, respectivamente, para facilitar la transferencia. Hemos transferido a las proteínas polyvinylidenefluoride (PVDF) membrana a 2 mA / cm 2 durante 60 min. Marker proteínas se obtuvieron a partir de Daiichi Pure Chemicals.

Inmunohistoquímica

Por inmunohistoquímica experimentos, hemos utilizado Histofine simple-Stain Rat MAX-PO (MULTI), como el anticuerpo secundario, un producto de Nichirei Co, Tokio, Japón. El experimento se llevó a cabo según el procedimiento descrito por el fabricante. MAX-PO se compone de un polímero conjugado con anticuerpos Fab secundaria y peroxidasa. Localizaciones de los complejos se visualizaron en un 3-3'-Diaminobencidina (DAB). Incubación de las secciones con anticuerpos primarios preparado tal y como se describe antes se llevó a cabo durante 24 horas a 4 ° C y luego con el MAX-PO durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones de color de DAB se poststained brevemente con methylgreen-pyronine [17]. Además de la tinción de inmunoperoxidasa, algunas secciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina para exámenes histológicos. Un Olympus BX-51 microscopio equipado con un Camedia C-3040 cámara digital se utilizó el sistema para tomar fotografías.

Inmunofluorescencia tinción se llevó a cabo utilizando fluoresceína-4-isotiocianato (FITC) y conjugado con burro anti-ratón de anticuerpos IgG y rodamina Red-X-burro conjugado anti-conejo de anticuerpos IgG, que se obtuvieron a partir de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc West Grove, PA . El primero fue sometido a 200 - y el segundo a 500 veces la dilución. Por counterstaining nuclear, que luego se mezcla con 2 μ g / ml de 4 ',6-diamidino-2-phenylindole dihidrocloruro (DAPI). La incubación con los anticuerpos secundarios se realizó durante 30 minutos a temperatura ambiente.

III. Resultados
Immunoblotting

Tanto los anti-músculo esquelético miosina II pesada cadena de anticuerpos (Fig. 1 A: carril 1, 2) y anti-miosina II nonmuscle pesada cadena de anticuerpos (Fig. 1 A: carril 3, 4) se mostraron a reaccionar con las proteínas correspondientes a el peso molecular de la miosina de cadena pesada. Anti-actina de anticuerpos reaccionaron con la proteína correspondiente a actina (Fig. 1 B). Las muestras en la Figura 1 A1, A3 y B1 se obtuvieron a partir de la piel dorsal y los que están en la Figura 1 A2, A4 y B2 se mystacial de la almohadilla. Las reacciones se han demostrado ser en gran medida concreta, aunque menor bandas alrededor del 70 kDa fueron detectados en las reacciones de los anticuerpos contra el anti-músculo esquelético miosina de cadena pesada (Fig. 1 A1 y A2). Diferencias significativas en los patrones de la piel dorsal mystacial almohadilla frente a las muestras no se observaron.

Localización de miosina método de peroxidasa

Hematoxilina-eosina y tinción inmunohistoquímica visualización de la miosina se llevaron a cabo para obtener las secciones dorsal de la piel y los tejidos mystacial. Aunque la epidermis de las estructuras ordinarias folículo piloso y la de la vibrissal folículo son esencialmente los mismos, los tejidos que rodean cutánea ambos tipos de folículos son muy diferentes [5]. El vibrissal folículo está rodeado por un alto nivel de desarrollo del seno y la cápsula en la zona de altura intermedia (Fig. 2 C). Estos tejidos dérmicos se reducen a la altura de la zona superior del folículo (Fig. 2 D). En la parte superior, el eje del cabello teñido no es de hematoxilina-eosina (Fig. 2 D).

Generalmente, la piel de ratas se compone de epidermis, del tejido conectivo dérmico, cutánea y muscular, organizado desde el exterior hacia el interior, tal y como se muestra en la Figura 2 A y E. Esta orden se vea perturbado en el mystacial almohadilla, donde el músculo cutánea invade el tejido conectivo dérmico zona hasta justo debajo de la epidermis, como los detectados por anticuerpos contra la miosina del músculo esquelético (Fig. 2 F y G), además de la vista histológico (Fig. 2 B). El vibrissal folículo está rodeado por un músculo esquelético (no arrector pili), que está reservado para el movimiento voluntario de los bigotes (Fig. 2 H). Aunque las células de la vaina exterior raíz en la Figura 2 H son ligeramente manchado, no hemos determinado si o no esto se debe a la reactividad cruzada de los anticuerpos. En general vibrissal folículo otras células no se tiñen de miosina esquelético (Fig. 2 H e I). En la inserta Figura 2 J en la Figura 2 I, así como la Figura 3 A, B representa el control de experimentos sin la adición de anticuerpos primarios. No específicos de tinción no se observa que excepto en el extremo inferior de la capa epidérmica cornificación (Fig. 3 A).

Figura 3 C muestra que la nonmuscle miosina II está situado en las apófisis espinosas (flecha b) y granular (flecha c) capas de la epidermis, mientras que parece ser escaso en la capa basal proliferativa (flecha a). Estos resultados sugieren que la miosina II podrán participar en la formación de una estructura estratificada de la epidermis como un componente de la membrana celular corteza y / o citoesqueleto, que probablemente dispone el sellado y la fuerza a la piel. La señal de miosina II parece ser eliminada cuando las células entran en la fase de queratinización (Fig. 3 C y D).

En comparación con el folículo piloso células, tanto por vía cutánea interfollicular células y células epidérmicas dar una señal fuerte de miosina II (Fig. 3 D). Sin embargo, algunas células en el folículo piloso se colorearon. Un grupo de estas células teñidas se observó en el bulbo del cabello, según lo indicado por la espesa flechas en la Fig. 3 EX y la flecha del cursor en la Fig. 3 G. Estas células son generalmente adyacentes a las papilas dérmicas. El otro grupo de células se encuentra en torno a la media altura de la vaina exterior raíz (Fig. 3 F, flecha gruesa; 3 G, delgada flecha, y 3 H, delgada flecha SRO). Además de estos grupos, la zona periférica (correspondiente a la cutícula del cabello) del cabello puede ser eje teñidas específicamente (Fig. 3 H, SA de flecha). Esto es aún más investigados por la tinción de inmunofluorescencia, y el resultado fue confirmado como se muestra en la Figura 7; los detalles se mencionan en una última parte de este documento. El compañero de capa no es necesariamente manchado como se muestra por la flecha Cp en la Figura 3 H. Nonmuscle miosina II se distribuyó ampliamente en tanto epidérmica y dérmica tejidos, incluido el músculo esquelético [15, 21, 27] (Fig. 3]. Es interesante observar que la mayor parte de la capa basal de la piel epidermis, el pelo matriz, las papilas dérmicas, secador de corteza, centro y raíz de vaina exhibió un nivel muy bajo nivel de señal para nonmuscle miosina II.

Localización de actina método de inmunoperoxidasa

La localización de actina en la piel, folículos pilosos, por vía cutánea y los tejidos se consideró esencialmente la misma que la de nonmuscle miosina II (Fig. 4]. En concreto, las siguientes áreas se colorearon: apófisis espinosas y capas granulares de la epidermis (Fig. 4 AyC), algunos indeterminado de células de la matriz del cabello (Fig. 4 D y E, flechas gruesas), exterior raíz de la vaina folículo piloso (Fig. 4 B, delgado, largo flecha sales de rehidratación oral; 4C, delgado, largo flechas sales de rehidratación oral, y 4D, flechas delgadas), las células interfollicular cutánea, cutánea y muscular (por ejemplo, Fig. 4 C y F). Como se muestra en la Figura 4 F, la distribución de actina no es uniforme en cápsula de células. Las células expuestas ultraperiféricas densas manchas, aunque su importancia no se conoce. La coloración de la capa basal de la epidermis (Fig. 4 A, flecha a) es apenas perceptible, mientras que las apófisis espinosas y capas granulares se colorearon claramente, como en la reacción con el anti-anticuerpo nonmuscle miosina (Fig. 3 C). Pequeños flechas y puntas de flecha en la Fig. 4 B designar a la coloración del cabello eje.

La zona infundibular del folículo piloso está rodeado por una vaina conectado a la capa basal de la epidermis. Esta vaina monocapa (o ampliar capa basal, Fig. 5 A, asterisco) se distingue claramente de la vaina exterior raíz, porque el primero es muy sensible a la tinción de hematoxilina. La tinción de peroxidasa de esta zona de tanto anti-miosina y anti-actina de anticuerpos fue indistinto, en comparación con la del exterior raíz vaina (Fig. 5 B y C, compare las áreas de * y sales de rehidratación oral) y fue rodeado por un espacio intercelular correspondiente a la membrana basal (Fig. 5 A y B, BM). Para ambos anticuerpos, el cabello y el eje interior raíz vaina no fueron manchados (Fig. 5 B, y C), aunque fueron ligeramente reactiva en zonas bajas (Fig. 5 H e I). En las zonas bajas, las células endoteliales, los senos, y envolver la cápsula folículo (Fig. 5 y D G) y la ampliación de la capa basal se convierte en indistinguibles en la sección más baja (Fig. 5 G). La cápsula parece ser manchados significativamente (Fig. 5 E y F).

Colocalización de actina y miosina por el método de inmunofluorescencia

Las células en la matriz de cabello teñido con anti-miosina nonmuscle de anticuerpos (rojo), se mostró a ser idénticos a los teñidos con anti-actina de anticuerpos (verde) como se muestra en la Figura 6. Las flechas en C y G denotar la especial rica en células tanto nonmuscle actina y miosina (amarilla) por la superposición de la figura 6 A, B, y Figura 6 E, F, respectivamente. En la actualidad, la función de estas células es desconocida. La mayoría de las otras células en la matriz del cabello no son claramente manchado por cualquiera de anticuerpos. Nomarski de observación, la vaina exterior raíz en el bulbo del cabello se distingue de la matriz de células (Fig. 6 D y H).

Figuras 7A y D muestran manchas de la cutícula del cabello (Ce) de anti-miosina de anticuerpos. Es interesante que este tejido no está manchado con anti-actina de anticuerpos (Fig. 7 B y E). Doble etiquetado de actina y miosina puso de manifiesto que la cutícula del cabello es rico en la miosina, pero escasos en actina (Fig. 7 C). Esta observación permite un marcado contraste con el exterior raíz vaina dérmica y músculo (Fig. 7 C), donde ambos actina y la miosina eran abundantes. La tinción de actina en la corteza del cabello es débil (Fig. 7 A). Esto puede sugerir la posible participación de la miosina en la queratinización del cabello árbol sin la ayuda de actina. Microscopía Nomarski podría distinguir entre la corteza del cabello, cutícula del cabello, centro de la vaina de raíz (tres capas) y exterior raíz vaina (Fig. 7 F).

IV. Discusión

El anagen folículo piloso es un minuto órgano que contiene muchos que proliferan y la diferenciación de las células. Folículos pilosos de las ratas comienzan a crecer desde varios días antes del nacimiento, y básicamente todos ellos se encuentran en la fase anagen en posparto días 5 a 7. El anagen folículo piloso es, pues, un excelente modelo para la observación de los procesos morfológicos de diferenciación celular ya que la mayoría de las células se acumulan en forma ordenada de acuerdo a su particular etapa de maduración [7, 18]. Las células queratinizadas de la cabello eje interior y la vaina de raíz son aparentemente elevados de forma pasiva por la presión de la división celular de debajo. Por otro lado, las células del bulbo del cabello, vaina exterior raíz, y las papilas dérmicas se cree que pasar por su propia iniciativa. Nuestro objetivo principal era estudiar la distribución de nonmuscle miosina y su socio, actina, en el folículo piloso. Por estudio comparativo, la piel epidermis y folículos vibrissal se investigaron de forma paralela. La distribución de músculo esquelético miosina También se estudió como una referencia.

Nonmuscle miosina II se sabe que se distribuye ampliamente en las especies y los tejidos [3, 9, 11, 13] y que parece funcionar en varios tipos de células [2 - 4, 6 - 8, 22, 24, 25, 28]; sin embargo , Información útil acerca de actina y miosina en la piel y el cabello no está disponible. Reacciones cruzadas entre los anti-músculo esquelético miosina anticuerpos y proteínas folicular se informó de Jazwinska et al., Con distintos resultados dependiendo de los anticuerpos utilizados [10]. Desde su estrategia experimental no sería apropiada para obtener resultados definitivos, es difícil hacer una comparación directa entre sus resultados y el nuestro.

Explicamos nuestros resultados experimentales de la siguiente manera: 1) La colocalización de actina y miosina en las apófisis espinosas capa, tal como se ha constatado en el presente estudio, es coherente con los resultados del informe sugieren que la protrusión y retracción de lamellipodia / filopodios se correlacionan con el dinamismo de la actina y miosina moléculas [24, 25]. Actina y miosina en la capa granular pueden ser los residuos que se iban a desaparecer en la parte interior de la capa de cornificación. 2) En contraste con las células del interior de la vaina de raíz el árbol y el cabello, los del exterior se someten a la vaina de raíz la división celular en una variedad de alturas. Cuando el folículo crece hacia abajo, las células de la vaina exterior raíz debe avanzar hacia la zona subcutánea. La raíz vaina exterior también ha sido sugerido para ser el camino de células madre que se sabe que moverse hacia arriba y hacia abajo en el folículo piloso [19], mientras que el exterior raíz misma vaina crece en tanto ascendentes como descendentes direcciones en función de su altura [12 ]. Desde el exterior raíz vaina de células no sean objeto de terminal de queratinización, se espera que mover voluntariamente. Por lo tanto, es natural que la actina y la miosina, que parecen ser necesarios para la migración celular [1, 22], se encuentran para ser localizados en el exterior raíz vaina. 3) Desde la miosina-actina y rico en células matriz del cabello son generalmente adyacentes a las papilas dérmicas, pueden desempeñar un papel en la entrada y salida de sustancias nutritivas y / o con hormonas como factores. También es posible que estén a punto de avanzar hacia un nicho más distal de la división celular. Otra posibilidad es que son melanocitos que han invadido el folículo. Más investigaciones son necesarias para verificar estos puntos de vista. 4) Es de interés señalar que la cutícula del cabello se tiñen de miosina pero no para la actina. Esto sugiere que la miosina podrán participar en la queratinización distintivo de la cutícula del cabello [18]. Por ejemplo, puede ser correlacionado con el ensamblaje de moléculas de queratina. 5) La papila dérmica células se sugieren para cumplir una función especial citoesqueleto cuando entran en el bulbo del cabello, debido a que se someten a drásticos cambios morfológicos en ese momento [18]. Pero una vez que han tenido éxito en la invaginación, que parecen estar relajado. Por lo tanto, especular que esto podría ser la razón por la cual la acumulación de actina y miosina no se observó en la mayoría de las células de las papilas dérmicas. 6) activamente dividir a las células en la capa basal de la piel epidermis, así como los de la matriz de pelo parecen tener escasa cantidad de actina y miosina. Aunque estas proteínas son los componentes del anillo contráctil, sus cantidades puede ser insignificante en comparación con los relacionados con el citoesqueleto cortical y estructuras óseas.

Damos las gracias al Dr T. MATSUZAKI (Universidad de Shimane), el doctor M. Morioka (Universidad de Tokio) y el doctor H. Takano-Ohmuro (Universidad de Musashino) para sus debates.