Acta Histochemica et Cytochemica, 2006; 39(4): 103-106 (más artículos en esta revista)

Multi-dimensional microscopia láser confocal en células vivas en Submicroliter volúmenes utilizando capilares de vidrio

Sociedad Japonesa de Histoquímica y Citoquímica
Emilie Flaberg [1], György Stuber [1], Laszlo Szekely [1]
[1] Microbiología y Biología Tumoral Center (MTC) y el Centro de Reconocimiento de integración en el Sistema Inmune (IRIS), Karolinska Institute, S-17177 Estocolmo, Suecia

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Resumen

De imágenes de células vivas mediante microscopía confocal láser requiere el uso de complejo y engorroso y no los sistemas de cámara de incubación con el fin de mantener el correcto condiciones fisiológicas. El volumen de estas cámaras está en el rango de unos cientos de microlitros. Aquí presentamos una forma fácil y conveniente alternativa en forma de capilares de vidrio que acomodar los volúmenes de 0.2-10 microlitros. Los capilares se pueden cargar con la suspensión y las células adheridas. La carga capilares son grabadas en portaobjetos de microscopio y sumergidos en el aceite de inmersión que cubre el objetivo. La temperatura correcta se mantiene mediante un termostato controlado por objetivo calentador. Demostramos que el uso de una mayor rotación de micro disco de Nipkow basado confocal iluminación, en combinación con el CCD de las cámaras de frío, resolución máxima multicolor lapso de tiempo imágenes de fluorescencia puede ser obtenido a partir de células vivas. Las imágenes obtenidas son libres de distorsiones ópticas inquietante. Imágenes en submicroliter volúmenes permite la visualización de fluorescencia muy raros tipos de células aisladas o utilizando el flujo de afinidad o de clasificación obtenido por biopsias con aguja fina.

Introducción de una mayor rotación de micro spinning disco de Nipkow confocal de iluminación en combinación con el CCD de la cámara fría de adquisición de imágenes basada, abrió nuevas perspectivas en la fluorescencia de células en vivo de imágenes [2]. Láser convencionales de microscopía confocal de barrido es a menudo demasiado lento e insensible para muchas células vivas las aplicaciones de imágenes. Asimismo, expone a las células peligrosamente altas dosis de fotones que pueden conducir a la luz inducida por Ca + señalización mediada por apoptosis [4]. La fototoxicidad reducido en gran medida mediante el hilado disco haz paralelo basado en los sistemas de iluminación permite tridimensional multicolor time-lapse de imágenes durante varias horas.

Mantener las células vivas durante largos períodos de tiempo requiere un cuidadoso control de temperatura, el pH y el suministro de nutrientes [3]. Hay varias maneras de crear las condiciones correctas de incubación. En vivo utilizando imágenes de células abiertas platos de cultivo de tejidos requiere la instalación de una gran sala de incubación que rodea la mitad del microscopio. También exige elaborar un mecanismo para proporcionar correcta temperatura y humedad, así como corregir parcial de CO 2 a presión. A más conveniente vivir de incubación de células dispositivo es un ejemplo de los llamados mini cámaras POC [1, 6]. Estas cámaras consisten en una placa de metal con base de calor de alta capacidad que acomodar de 30 mm de diámetro cubreobjetos que sentarse en una ronda de apertura. Dos cubreobjetos separadas por un anillo de silicona adjuntar las células vivas en el medio de cultivo de tejidos. El más pequeño posible volumen de líquido que se necesita para llenar la sala es de 400 μ l. El POC mini cámaras puede ser operado en mercados abiertos, cerrados o los modos de perfusión. Abrir el modo de operación requiere el uso de la mencionada gran cámara de incubación. Cuando el POC mini cámara se utiliza en recipientes cerrados o perfusión modos, la temperatura está controlada por un termostato de la calefacción regulada etapa que se monta en el objeto mesa. Para evitar la pérdida de calor amplia hacia el objetivo de esta mesa tiene que estar equipado con un termostato-calentador controlado anillo. Este estado de la técnica de montaje tiene todavía algunas deficiencias. El sistema es relativamente caro. No funciona con pequeños volúmenes. No puede utilizarse para las imágenes de múltiples muestras.

Con modernas técnicas de separación de células llegó la posibilidad de analizar los pequeños volúmenes con sólo unos pocos del número de células. Flujo de clasificación de bolas o magneticos vinculantes técnicas permiten el aislamiento de poblaciones homogéneas de células raras complejo de fuentes, tales como sangre, médula ósea, bazo o colagenasa disociarse de órganos sólidos. Ejemplos típicos son las células madre, raras células efectoras inmunológicas, la población menor de infiltrarse en las células tumorales o células infectadas por virus. Además, las células de muestras muy pequeñas, como las biopsias con aguja, embriones o muestras de tejidos de animales de experimentación pequeños también tienen que ser analizados en submicroliter volúmenes.

Por lo tanto, desarrolló una técnica de imágenes de células vivas en submicroliter volúmenes. Estamos motivados que, mediante el uso de aceite de inmersión con el mismo índice refractario como la pared de los vasos de incubación, la geometría del muro no necesariamente tiene que ser en un plano paralelo, siempre y cuando usamos la hilatura disco confocal de la tecnología con un millar de vigas paralelas para cada zona iluminada. Hemos probado dos tipos de vidrio capilar set-ups. En ambos casos hemos utilizado 10 μ l capilares de vidrio (Idaho Tecnología Parte # 1705) diseñado para capilar PCR.

En el primer set-up que cargan los capilares con 2-4 μ l suspensiones de células por inmersión un extremo del tubo de vidrio en el cultivo de células de líquido gota a PARAFILM sesión. Los capilares fueron cerrados en ambos extremos con quemadores de butano estándar. El sellado capilares se grabaron en la superficie de vidrio diapositivas. Para evitar la pérdida de calor hacia el vaso de diapositivas dos rebanadas de cuatro capas gruesas de plástico aislamiento eléctrico tira de cinta se cuneiforme entre los capilares y la diapositiva. Las diapositivas fueron colocados en un Zeiss invertido Axiovert microscopio de fluorescencia, donde el objetivo estaba equipado con un termostato de la calefacción regulada anillo. Suspensión de células que se reunieron en la parte inferior de los capilares fueron convenientemente imágenes utilizando 16 ×, 40 ×, 63 × 100 × o aceite de inmersión, objetivos utilizando láser confocal de iluminación con CSU10 o micro CSU21 mayor rotación de unidades de disco de Nipkow (ICL ultraView ultraView o RS - 5 de células vivas sistemas de imágenes, tanto de Perkin-Elmer). El argón y criptón (488, 568, 647 nm), de iones de argón (488, 514 nm) y Krypton (568 nm) láseres de gas, así como 405 y 640 nm láser de estado sólido se utilizaron como fuentes de iluminación. Las imágenes se registraron utilizando Hamamatsu Orca ER fría cámaras CCD. No preocupante distorsión óptica era detectable. Células que expresan recombinante EGFP, YFP PPC o proteínas de fusión fueron examinados rutinariamente durante varias horas más multicolor utilizando 4D (óptico seccionando con el tiempo transcurrido) de imágenes. El ADN celular se visualizan mediante el infrarrojos que emiten en directo de células permeables tinte DRAQ5 [5]. La ventaja de esta configuración es que, debido a que los capilares están firmemente cerrados no hay peligro de la evaporación del medio. Las células pueden mantenerse vivas en los capilares más de 24-48 horas. El sellado capilares son sólidos y pueden ser convenientemente esterilizados por inmersión en formol. Este método permite incluso imágenes en vivo de células de agentes infecciosos. Por otra parte, los sellados de manera uniforme capilares puede ser montado como un haz paralelo sobre el mismo portaobjetos de vidrio. Este arreglo permite paralelo de imágenes de varios sitios web si el microscopio está equipado con un ordenador controlado XY. Secuencial, lapso de tiempo de recurrencia de imágenes de múltiples sitios pueden ser convenientemente llevadas a cabo programable usando el software de control de microscopio, como ISEE (ISIS) o Openlab Automator (Improvisación).

A imagen de la monocapa de células capilares puede ser el primero cargado con trypsinized células. La carga sin cerrar capilares se incuban submersed plenamente en medio (en placas de Petri) para permitir la monocapa que se formaron en el interior de la pared capilar. Antes de sellar los capilares, el medio puede ser cambiado por expulsar el medio utilizado con la ayuda de una jeringa de 2 ml y de 2 mm de espesor de polipropileno tubo para cromatografía. Posteriormente un nuevo medio está cargado de acción capilar que contiene los tintes adecuados fluorescencia, biológicas moléculas efectoras y / o interactúan las células o microbios.

En el segundo set-up tenemos la intención de disminuir aún más el volumen de incubación. Hemos tirado capilares pelo fino de fusión a mediados de los 10 μ l capilar de vidrio con un quemador de butano. Los capilares de vidrio fueron suspendidos perpendicularmente en un tubo de ensayo titular etapa con un clip de metal bajo el peso de otro clip (18 gr). Lentamente la fusión sección central con el borde de la llama condujo a la formación de capilares muy finos con 50-150 μ m de diámetro interior y 25-50 μ m de espesor de pared. La sección delgada se rompió con la ayuda de tijeras, 3 cm después de la fusión del hombro. El pelo fino capilares fueron también cargados de acción capilar. Un microlitro de tamaño gota de suspensión celular fue colocado en PARAFILM y el delgado final del capilar se refirió a la caída. Cuando 0.2-0.5 μ l fue cargado, las delgadas final fue sellado por tocar brevemente una pequeña gota de PCR grado de aceite de parafina. El grosor final del capilar se selló con el agua saturada gummi arabicum. El sellado capilar fue grabado en un vaso de diapositivas de tal manera que el cabello fino se suspendió la sección de 1 mm por debajo y paralelamente a la diapositiva de vidrio. El pelo fino sección del capilar se submersed en la inmersión en aceite caliente sentados en la parte superior de la acalorada objetivo (Fig. 1]. Por este método unas pocas docenas de células son suficientes para llevar a cabo multidimensional en vivo de imágenes de células (Figs. 2 - 6). Nuestro método puede ser particularmente adecuado para estudiar las interacciones entre efector inmunológico y las células diana donde el número de celdas disponibles son limitados (Fig. 7]. Para organizar convenientemente el espacio, las interacciones el cabello fino capilar puede ser secuencial cargado en primer lugar con el objetivo y, a continuación, con la células efectoras. La frontera entre los dos volúmenes que constituye la superficie de alta probabilidad de interacciones. Este segundo set-up, sin embargo, es algo frágil. Debido a la falta permanente de vidrio sellado no se recomienda para el trabajo con alto riesgo de patógenos humanos. Por otra parte, pueden ser particularmente adecuado para estudiar muy raras células o células que son tratados con agentes biológicos que son muy caros o difíciles de obtener.

En vivo de imágenes de células capilares en vidrio pueden permitir estudios funcionales en las células primarias que se obtienen mediante biopsia con aguja fina de tumores o normal o diferentes órganos enfermos.

Queremos dar las gracias a Víctor Levitsky y Noemi Nagy para la prestación de células NK y las buenas prácticas agrarias-VEB Akata las células infectadas, así como la expresión de EGFP-SAOS-2 células, respectivamente.