Acta Histochemica et Cytochemica, 2006; 39(4): 107-112 (más artículos en esta revista)

Localización de CORO1A en los macrófagos que contienen Mycobacterium leprae

Sociedad Japonesa de Histoquímica y Citoquímica
Koichi Suzuki [1], Fumihiko Takeshita [1], Noboru Nakata [1], Norihisa Ishii [2], Masahiko Makino [1]
[1] Departamento de Microbiología, Centro de Investigación de Lepra del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ,4-2-1 Aoba-cho, Higashimurayama, Tokio 189-0002, Japón
[2] Departamento de Bioregulation, Lepra Centro de Investigación, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, 4-2-1 Aoba-cho, Higashimurayama, Tokio 189-0002, Japón
[3] Departamento de Investigación Molecular de biodefensa, Yokohama City University School of Medicine, 3-9 Fukuura, Kanazawa-ku, Yokohama 236-0004, Japón

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Resumen

Micobacterias han adquirido un estilo de vida intracelular dentro de los macrófagos, que es el mejor ejemplo de la ampliación de histiocitos visto infectados por la lepra, lepra. Para sobrevivir dentro de la célula, micobacterias deben escapar de los mecanismos intracelulares bactericida. En un estudio de Mycobacterium bovis bacilo de Calmette-Guérin (M. bovis BCG) la infección, se demostró que la proteína de acogida, CORO1A, también conocido como triptófano-aspartato capa que contiene proteína (TACO), se acumula en la membrana phagosomal, lo que resulta en la inhibición del fagosoma lisosoma-fusión, y, por tanto, aumentar la supervivencia intracelular. En este estudio, mostramos que CORO1A firmemente localiza en la membrana de phagosomes que contienen Mycobacterium leprae (M. leprae), donde Toll-like receptor 2 fue también visualizado por inmunoticción. Cuando fueron cultivadas macrófagos infectados con M. leprae, CORO1A contratación de la membrana plasmática a la membrana phagosomal se observó. Moderado a fuerte CORO1A retención se observó a finales de las lesiones que figuran espumoso histiocitos, en la que M. leprae son difíciles de detectar por ácido-tinción rápido. Estos resultados sugieren que la acumulación de componentes dentro del fagosoma en lugar de bacilos viables son responsables de la retención de CORO1A, y que también hay un mecanismo bactericida en los macrófagos que podrían contrarrestar los efectos de CORO1A.

I. Introducción

La adopción de un estilo de vida intracelular confiere varias ventajas sobre patógenos microbianos: son inaccesibles para humoral y mediada por complemento inmunitario ataque, que ya no necesitan un mecanismo de adhesión para mantener su sitio de la infección, y que tienen acceso a una gama de nutrientes. Sin embargo, con el fin de micobacterias para sobrevivir intracelularmente, también necesitan para escapar de los mecanismos intracelulares bactericida.

Mycobacterium leprae (M. leprae) es uno de los más exitosos patógenos intracelulares, que sobreviven en el fagosoma de los macrófagos de acogida. Tal intracelular parasitación es más fácil ver en el histiocítico lesiones de la lepra, lepra, que se caracterizan por una acumulación de histiocitos (denominado leproma células). Ellos han ampliado a phagosomes que M. leprae vidas y repeticiones. Debido a que estos phagosomes siendo unfused con lisosomas, la degradación de bacilos bactericida de las enzimas se ve impedido, por lo que su supervivencia [8].

Un estudio in vitro utilizando Mycobacterium bovis bacilo de Calmette-Guérin (M. bovis BCG), ha demostrado que una importante acogida proteína, denominada triptófano-aspartato capa que contiene proteína (TACO), desempeña un papel esencial en la inhibición del fagosoma lisosoma-fusión, así como como en la supervivencia de bacilos dentro de los macrófagos [7]. En el ratón macrófagos línea celular, J774.1, se demostró que TACO, que inicialmente se encontró en la membrana plasmática en asociación con la tubulina, se contrató a la membrana phagosomal después de la infección por M. bovis BCG [7]. TACO representa un componente del fagosoma escudo, y la retención de TACO impide phagosomes de la fusión de lisosomas con, contribuyendo así a la supervivencia a largo plazo de bacilos en el fagosoma. La localización de phagosomal TACO fue sólo transitoria sumida en macrófagos muertos micobacterias, mientras que la localización es bastante estable bacilos vivos cuando se utilizaron. Además, M. bovis BCG fue completamente digeridos por las células Kupffer del hígado, lo que falta TACO expresión [7]. Mouse TACO es una ortholog de CORO1A humano, también conocido como P57 [13], que codifica una 461-aminoácidos de proteínas, que comparte el 40% de aminoácidos con identidad coronin, actina-proteína de unión de los celulares limo moho Dictyostelium discoideum [6 ]. CORO1A realmente une a la actina [13], y se piensa que es importante para la movilidad celular y la actividad endocítica, ya que se acumula en los sitios de la corteza se desplazan las células y contribuye a la dinámica del sistema intracelular de actina [6].

Macrófagos y otras células inmunes se han desarrollado diversos mecanismos para detectar y combatir agentes patógenos. Entre estos mecanismos, como los receptores de peaje (TLRs) son los receptores de reconocimiento de patrones (PRRS) que el sentido común y distinguir los diversos componentes derivados de los agentes patógenos, es decir, el agente patógeno-patrones moleculares asociados (PAMPs) [1, 4]. TLR2 en combinación con TLR1 o TLR6 son los más importantes para el reconocimiento de las micobacterias [10, 18], y lipopeptides bacteriana, como lipoarabinomannan (LAM), son bien conocidas ligandos para TLR2. En particular, varios estudios han demostrado que es contratado TLR2 y localizados en la membrana fagosoma tras la exposición a sus ligandos, como el zymosan [17].

No se sabe si las observaciones en relación con la actividad TACO que el aumento de la supervivencia de M. bovis BCG son universales para otras micobacterias, especialmente in vivo. En este estudio investigamos la expresión y localización de CORO1A en macrófagos infectados con M. leprae tanto in vivo como in vitro.

II. Materiales y Métodos
Muestras de tejidos y de tinción

Archivadas fijado en formol e parafina embebido en secciones de tejido de 42 casos de lepra pacientes fueron sometidos a tinción inmunohistoquímica, tal como se describe [12, 15]. En pocas palabras, deparaffinized secciones fueron incubadas con conejo anti-TACO anticuerpos [7], que es específico para ambos ratones y humanos CORO1A, fue amablemente proporcionado por el doctor J. Pieters (Basilea Instituto de Inmunología de Basilea, Suiza), conejo anti-humano Toll-like receptor 2 (TLR2) anticuerpo (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) o con anti-lipoarabinomannan (LAM) de anticuerpos (LRC, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Japón), por 1 hora a temperatura ambiente. Láminas fueron lavadas con Dulbecco's tampón fosfato salino (DPBS) que contiene 0,01% Triton X-100. La peroxidasa o fosfatasa alcalina marcado streptavidina-biotina utilizando el método LSAB2 kit (Dako, Carpinteria, CA) y DAB (3,3-Diaminobencidina tetraclorhidrato) o BCIP / NBT (5'-bromo-4-cloro-3-indoxyl fosfato / nitro azul tetrazolio cloruro) se empleó según las indicaciones del fabricante de protocolo. Las secciones fueron teñidas utilizando carbol fucsina para visualizar ácido-rápido y micobacterias counterstained con hematoxilina. Para la Fite método de Ziehl-Neelsen tinción, el aceite de oliva / xileno (1:2 ratio) se utilizó para deparaffinize secciones. Archivadas fijado en formol e parafina de tejidos embebidos fueron utilizados de acuerdo con las directrices aprobadas por el Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (Tokio, Japón).

Macrófagos de cultivo celular y la infección por M. leprae

Murino macrófagos líneas celulares, RAW264.7, P388D1, y J774.1, se obtuvieron a partir de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ellos se mantuvieron en Dulbecco modificado Eagle's Medium (DMEM) complementado con un 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 50 mg / ml de penicilina y estreptomicina a 37 ° C en el 5% de CO 2. Macrófagos peritoneales residentes fueron cosechadas de Balb / c mice tal como está descrita anteriormente [9]. En resumen, las células peritoneales se recuperaron Hanks en 'equilibrada solución de sal (HBSS), lavado, suspendido en DMEM complementado con un 15% de SFB, y chapada en cubreobjetos de vidrio en 24 y placas de cultivo de tejidos. Después de 4 h de incubación, las células unadhered fueron retirados por lavado suave con HBSS. M. leprae se preparó de footpads de ratones desnudos, tal como se describe [9] y se añaden a la cultura en una multiplicidad de infección (MOI) de 20:1.

ARN y preparación del Norte blot

RNA de culto macrófagos se prepara usando RNeasy Mini Kits (QIAGEN Inc, Valencia, CA) y modificaciones menores del fabricante del protocolo, tal como se describe [14, 16]. En resumen, las células fueron lavadas con DPBS, resuspendido en 600 μ l de solución de Lisis, y pasa a través de un QIAshredder (QIAGEN). Después de 600 μ l de etanol al 70% se añadió, la mezcla fue purificado a través de un spin columna, se lava con 600 μ l de solución de lavado RW1, y lavados dos veces con 500 μ l de solución de lavado RPE. ARN se eluye con 30 μ l de RNasa libre de agua. Se tomaron muestras de RNA en electrophoresed desnaturalización geles de agarosa y capilar borrado en una membrana de nylon usando un Turboblotter (Schleicher y Schuell, Keene, NH). Después de UV entrecruzamiento, la hibridación se realizó de la siguiente manera. cDNA sondas fueron marcadas con 33 P-dCTP utilizando un BCA BEST Etiquetado Kit (Takara Bio, Otsu, Japón). Después de la Nytran membranas (Schleicher y Schuell) se prehybridized con 10 ml de solución de hibridación QuickHyb (Stratagene) por 1 hora a 68 ° C, 1 × 10 7 cpm radiomarcada sonda se añadió después de haber sido premezclado con 100 μ l sonicated ADN de esperma de salmón (Stratagene), climatizada a 94 ° C durante 5 minutos, y luego refrigerados en hielo. Después de la hibridación de 3 hr, las membranas se lavaron y se analizaron mediante un analizador de BAS1000 Bioimaging (Fujifilm, Tokio, Japón). Reprobing se realizó después de membranas incubando en el 50% formamida, 50 mM Tris-Cl (pH 8,0), y el 10% SDS de 1 a 2 horas a 65 ° C. Mouse CORO1A cDNA se obtuvo por RT-PCR usando primers 5'-ACCTCCTGCCGTGACAAGCG-3 'y 5'-TCCTGGAACAGGTCCGACTTTC-3'.

III. Resultados

Intracelular parasitación por micobacterias es el mejor ejemplo de lepra en la lepra. El rasgo más característico de la lepra, lepra es la lesión cutánea, que contiene una acumulación de histiocitos en espumoso ampliada phagosomes que contienen ácido-rápido bacilos (M. leprae) (Fig. 1 AyB). Con el fin de estudiar la localización subcelular de CORO1A en estos macrófagos, lesiones de pacientes con lepra, lepra se immunostained para CORO1A. Como se muestra en la Figura 1 C y D, CORO1A localizado en el vacuolas fagocíticas que contienen M. leprae. De nota, no parece ser una asociación directa entre los bacilos y CORO1A, que fueron separados de los lípidos acumulados en la fagocitosis vacuola (Fig. 1 C y D). Phagosomal localización de CORO1A fue confirmada por inmunoticción secciones seriadas, las lesiones de TLR2, que es del conocimiento de localizar a phagosomal membranas que contienen micobacterias, y que es responsable de la iniciación de la respuesta inmune innata [17, 18]. En las lesiones cutáneas de la lepra, lepra, CORO1A localizados a la misma lesión que histiocítico TLR2 también fue manchado como se indica en el bajo aumento (Fig. 1 E y F, respectivamente). En un aumento mayor, ambos fueron localizados a las vacuolas fagocíticas que contienen M. leprae (Fig. 1 G y H).

La lepra tuberculoide se caracteriza por una fuerte respuesta inmune celular contra M. leprae, acompañado por el aspecto epitelioide de células y células gigantes (Fig. 1]. En las biopsias de lesiones de la lepra tuberculoide, M. leprae con poca frecuencia se detectó, ya sea por manchas o Fite inmunoticción de LAM, un componente de la pared celular de micobacterias (tinción negativa se muestra en la Fig. 1 J y K, respectivamente). CORO1A expresión en los macrófagos del tejido se detecta sólo débilmente a la membrana plasmática y citoplasma en la lepra tuberculoide (Fig. 1 L).

Histiocitos espumoso a finales de lesiones de la lepra, lepra a veces tienen una apariencia xanthomatous, como se demuestra en la Figura 2 A, y ácido-rápido bacilos no se observaron debido a cambios degenerativos (Fig. 2 C). Sin embargo, era más bien CORO1A firmemente immunostained en la lesión (Fig. 2 E). Inmunoticción positivos de LAM, que persiste durante un largo período de tiempo dentro de los macrófagos infectados, confirmó la preexistencia de M. leprae en estos espumoso macrófagos (Fig. 2 G). En otra lesión en la misma sección de tejido (Fig. 2 B), ambos CORO1A tinción y coloración LAM fueron relativamente débiles (Fig. 2 F y H, respectivamente), a pesar de la existencia de numerosos ácido-rápido bacilos (Fig. 2 D). Estos resultados, junto con la observación de que no hay asociación directa entre los bacilos y CORO1A, tal y como se muestra en la Figura 1 G y H, sugieren que los productos de M. leprae se acumulan dentro del fagosoma, y que estos componentes, y no necesariamente la interacción directa de la phagosomal membrana con bacilos vivos, podría ser importante para la retención de CORO1A en la membrana phagosomal.

Para confirmar la localización de CORO1A in vitro, los macrófagos peritoneales murinos estaban infectados con M. leprae, y las células infectadas se fijaron con formalina, immunostained para CORO1A y, a continuación, manchado de ácido-rápido bacilos. CORO1A fue inicialmente distribuido en la membrana plasmática de los macrófagos (Fig. 3 A). Sin embargo, el 4 de hora después de la infección que relocalized a phagosomal membranas que contienen M. leprae (Fig. 3 B, C y D). De nota, algunos bacilos sumió se observaron en el que no hubo contratación de CORO1A a la phagosomal membrana (Fig. 3 C y D, flechas), que se ha informado anteriormente [11].

Además de los cambios de localización subcelular, la pauta de CORO1A inmunoticción sugiere posibles cambios en su expresión siguiente nivel M. leprae infección. Por tanto, nuestro estudio los cambios en los niveles de ARN CORO1A siguientes M. leprae infección, independiente utilizando tres líneas celulares de macrófagos. Blot del Norte reveló que los niveles de mRNA se redujeron 4 Horas después de M. leprae infección y, a continuación, se recuperó gradualmente por 48 hr a niveles que son similares o ligeramente aumentado en los niveles registrados antes de la infección (Fig. 4]. Esa tendencia se observó de manera similar en los tres diferentes líneas de células macrófagos prueba.

IV. Discusión

A pesar de que los macrófagos es una de las más importantes la protección de las células inmunitarias del cuerpo de la infección por micobacterias patógenas como M. la tuberculosis y M. leprae parasitize los macrófagos de eludir sus mecanismos de muerte intracelular. En este sentido, la lepra, lepra lesión es el más clásico ejemplo que demuestra parasitación intracelular de las micobacterias en el macrófago. Se ha demostrado en el modelo murino de infección por micobacteria que TACO, el ratón CORO1A ortholog, se acumula en phagosomes que contienen micobacterias e inhibe su fusión con lisosomas. Por lo tanto, CORO1A ha sido considerada como un elemento esencial de acogida proteína que permite la supervivencia intracelular de las micobacterias [7], aunque los mecanismos moleculares subyacentes a esa función de CORO1A aún se desconoce.

En este estudio hemos demostrado por primera vez que CORO1A localiza en las membranas que contienen phagosomal M. leprae en muestras de tejidos de enfermos de lepra, lepra. Debido M. leprae no puede ser cultivada in vitro, no es posible determinar directamente la contribución de M. a CORO1A leprae supervivencia. En el estudio de M. bovis BCG infección, sin embargo, es claramente de manifiesto que la existencia de CORO1A aumenta la supervivencia intracelular del bacilo [7]. Por lo tanto, observó la acumulación de CORO1A alrededor de vacuolas fagocíticas que figura M. leprae firmemente CORO1A indica que es un factor en la patogénesis de la lepra. Después de translocación a la fagocitosis vacuola, estable retención de CORO1A se produjo sólo cuando viable, pero no inactivados M. bovis BCG (muerto ya sea por calor o antibióticos) se sumió [7]. Se demostró que phagosomes macizos que contienen bacterias, en lugar de individuales o de bajo número de M. bovis BCG, son necesarios para CORO1A retención [11]. M. leprae infección tal y como se muestra en la Figura 4 en este estudio apoya esta observación. Por lo tanto, puede ser posible que los bacilos aislados, son tratados por otra vía fagocitosis. Otra posibilidad de que la falta de CORO1A acumulación en algunos phagosomes es la baja viabilidad de M. leprae preparado a partir de ratones desnudos, porque CORO1A no se mantiene en phagosomes que hundir bacilos muertos [7]. El uso de la congelación de sustitución de método en microscopía electrónica, Amako et al. Ultraestructurales realizados estudios de M. leprae recién preparada a partir de ratones nude footpads, e informó de que la mayoría de bacilos son degradadas [2].

A pesar de que la micobacteria factor que contribuye al anclaje de CORO1A todavía no se ha determinado, se ha observado en las cepas de Helicobacter pylori que la vacuolating cytotoxin, Vaca, desempeña un papel importante en la retención de CORO1A, así como en la interrupción de lisosomales fusión [19]. En leproma células, bacilos parecía estar flotando en lípidos lleno de phagosomes, y, por tanto, directa asociación entre M. leprae y CORO1A no era evidente. Por otra parte, CORO1A acumulación en las membranas phagosomal parecía ser más fuerte a fines de lesiones bacilos viables cuando no estaban presentes. Estos resultados sugieren que, en lugar de la existencia de bacilos vivos, algunos componentes acumulando en el fagosoma contribuye a la retención de CORO1A. También puede sugerir que para estos fines de lesiones el mecanismo bactericida fue efectivo a pesar de la CORO1A escudo phagosomal en la membrana.

Es interesante observar que ambas CORO1A localizar y TLR2 en la membrana que contiene phagosomal M. leprae. TLR2 se activa la respuesta inmune innata para proteger las células contra los agentes patógenos [18], mientras que CORO1A inhibe la fusión del lisosoma para el fagosoma, lo que permite micobacteriana parasitación [7]. El polimorfismo Arg677Trp de TLR2, que no está en condiciones de iniciar la cascada de señalización corriente abajo, se ha informado a estar asociados con la lepra, lepra [5], así como la tuberculosis [3]. Dentro de los macrófagos infectados por micobacterias-tanto asesinato y micobacterias tolerantes a los mecanismos de mediación por lo menos en parte por TLR2 y CORO1A, respectivamente, podrán ser activadas. El equilibrio entre esos mecanismos que compiten podría ser un factor para determinar si el patógeno es muerto o en lugar de acogida parasitizes macrófagos.

Los autores se agradecen a Dr J. Pieters (Basilea Instituto de Inmunología de Basilea, Suiza), para el conejo anti-anticuerpos TACO. También damos las gracias al doctor M. Matsuoka para proporcionar desnuda ratones infectados con M. leprae, y el doctor S. Toratani de macrófagos peritoneales. También damos las gracias a C. Sakamoto, K. Kawazu, S. Wattanopakayakit, PD Bang, y J. Rudeeaneksin para su asistencia técnica y valioso debate.

Este trabajo fue apoyado por una subvención de Investigación Científica en Áreas Prioritarias (C) del Ministerio de Educación, Cultura, Deporte, Ciencia y Tecnología del Japón (N º 13226132 a KS), y por una subvención-en - Ayudas para la Investigación sobre Enfermedades Infecciosas Emergentes y Reemergentes del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón (MM).