Acta Histochemica et Cytochemica, 2006; 39(5): 139-144 (más artículos en esta revista)

Corazón Myofibrillogenesis ocurre en algunas Chick posterior Blastoderm: Un modelo de cultura

Sociedad Japonesa de Histoquímica y Citoquímica
Hiroko Matsui [1], Masahide Sakabe [1], Hirokazu Sakata [1], KAZUKI Nakatani [1], Kazuo Ikeda [1], Mitsuru Fukui [2], Katsumi Ando [3], Toshiyuki Yamagishi [3], Yuji Nakajima [1]
[1] Departamento de Anatomía y Biología Celular
[2] Laboratorio de Estadística, Escuela Superior de Medicina, Osaka City University, 1-4-3 Asahimachi, Abenoku, Osaka 545-8585, Japón
[3] Departamento de Anatomía, Facultad de Medicina, Universidad de Medicina de Saitama, 38 Morohongo, Moroyama-cho, Irumagun, Saitama 350-0495, Japón

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Resumen

A principios cardiogenesis incluidos myofibrillogenesis es un evento crítico durante el desarrollo. Recientemente se acaba de ver que los posibles cardiomiocitos residen en la parte posterior lateral blastoderm en el embrión de pollo. En este sentido, culta la región posterior del pollo blastoderm en suero libre de mediano y observó el proceso de myofibrillogenesis de inmunohistoquímica. Después de 48 horas, explantes expresó proteínas sarcoméricas (sarcoméricas α-actinin, 61%; músculo liso α-actina, 95%; Z-line titin, 56%; sarcoméricas miosina, el 48%), sin embargo, todavía no muestran una madurez estrías. Después de 72 horas, más del 92% de explantes expresó iZi proteínas, que se incorporaron en el estrías en el 75% de explantes o más (sarcoméricas α-actinin, 75%; músculo liso α-actina, el 81%; Z titin-line, 83%). Sarcoméricas miosina se expresó en el 63% de explantes y se incorporan en una de las bandas en un 37%. El porcentaje de incidencia de expresión o estrías de iZi proteínas fue significativamente más alta que la de sarcoméricas miosina. Los resultados sugirieron que el naciente iZi componentes parecen ser generadas con independencia de A-en las bandas de culto posterior blastoderm, y que el proceso de myofibrillogenesis observado en nuestro modelo de cultura que se refleja fielmente en vivo. Nuestra cultura blastoderm modelo parece ser útil para investigar los mecanismos que regulan los principios de cardiogenesis.

I. Introducción

A principios de pollo cardiogenesis, prospectivo corazón células se encuentran en región posterior lateral de la epiblast, pero no en el centro de epiblast anterior [5, 14, 23]. Durante la gastrulación, las células del corazón prospectivo migrar en la mitad anterior del nodo primitivo, posteriormente abandonar el nodo primitivo y se acumulan en la región anterior lateral de la placa de mesodermo, llamado el mesodermo precardiac [11]. El anterior placa lateral mesodermo se divide en los dorsoventrally somáticas y viscerales el mesodermo. La izquierda y la derecha mesodermo visceral migrar línea media anterior del portal intestinal y fusible para formar el núcleo primitivo tubo. En esta etapa (finales de gástrula a Néurula, Hamburger y Hamilton [HH]-etapa 6-10) [13], myofibrillogenesis se produce rápidamente y el corazón comienza a golpear espontáneamente [15].

Los procesos de novo myofibrillogenesis son altamente conservados en vertebrados, incluido el músculo estriado naciente cardiomiocitos, y para que los investigadores han tratado de explicar el proceso que participan en la formación de la estructura sarcoméricas, que consiste en un sistema organizado de iZi y un componente de banda [26]. Varios modelos han sido propuestos para explicar cómo myofibrillogenesis se lleva a cabo durante la diferenciación del músculo cardíaco usando neonatal / fetal cardiomiocitos sistemas de cultivo, en cardiomiocitos aislados que pierden su madurez myofibrils y reorganizar myofibrils durante el cultivo. Se ha informado de que el primer paso supone un estrés de fibra-como la estructura como un andamio, y luego la iZi proteínas (el Z-disco componentes sarcoméricas α-actinin, α-actina y Z-line titin) de espesor y A-bandas (que consiste principalmente de miosina) se han reunido independientemente para luego convertirse en incorporarse myofibrils [16]. En el inicio de myofibrillogenesis, el estrés de fibra al igual que la estructura se compone de mini-sarcomeres que contienen filamentos de actina, α-actinin y no músculo miosina. Posteriormente, la distancia entre los densos materiales de la naciente myofibril aumenta, titin se incorpora, y no músculo miosina se sustituirá por el músculo-miosina específicos para completar la madurez myofibrils [19, 30]. Observaciones in vivo de myofibrillogenesis en embriones de pollo corazón puso de manifiesto que la myofibrillogenesis se produce de manera similar a la observada en los modelos de la cultura [8].

A pesar de los numerosos estudios, todavía hay incertidumbre acerca de la morfología y los mecanismos moleculares que son necesarias para la pronta cardiogenesis, tales como la formación de mesodermo corazón, corazón especificación y diferenciación terminal. Para establecer un sistema de la cultura para la investigación de los primeros cardiomyogenesis, cultivadas de pollo posterior blastoderm en suero libre de definirse a medio y observó el proceso de myofibrillogenesis de inmunohistoquímica.

II. Materiales y Métodos
Cultura procedimientos

Eyal-Giladi y Kochav (EK)-etapa X-XI blastoderms (tiempo de incubación 0 hr) [10] han sido recogidos en hielo-enfriado-buffer fosfato salino (PBS), y la posterior blastoderm incluida la epiblast y asociados hypoblast, pero no hoz, se aisló utilizando una aguja de tungsteno fuerte (rayada cuadrados en la Fig. 1]. El resultado explantes fueron explantados en la cámara de diapositivas (Nunc) y cultivadas en un suero libre de definirse a medio (75% DMEM, 25% medio de McCoy, complementado con 10 -7 M dexametasona y la penicilina-estreptomicina, Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) [18].

Microscopía de inmunofluorescencia indirecta

La inmunohistoquímica se realizó, tal como se describe en otro lugar [24]. Culturas fueron vaciados de cualquier medio, fijado con un 4% de paraformaldehído / PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, y enjuagar con PBS. Los especímenes fueron bloqueados durante 1 hora con 1% BSA (albúmina de suero bovino) que contiene 0,1% Tritón X-100, y luego incubadas con anticuerpos primarios mezcla a 4 ° C durante la noche. Fueron entonces enjuagarse con PBS e incubadas con FITC o RITC-anticuerpo secundario conjugado con mezcla de 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras se observaron bajo un microscopio láser confocal (Zeiss). Explantes que expresaron proteínas sarcoméricas o generados madura estrías fueron contados bajo un microscopio. Porcentaje de incidencia de las proteínas sarcoméricas-o estrías-positivas explantes se calculó. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el test exacto de Fisher y la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. Nivel de significación fue inferior al 5%.

Los anticuerpos

Los anticuerpos monoclonales anti-Z titin línea (anti-titin, clon 9D10, IgM, sobrenadante), anti-sarcoméricas miosina de cadena pesada (clon MF20, IgG2b, sobrenadante) [3] y anti-músculo esquelético retículo sarcoplásmico (clon 12 / 101, IgG1, sobrenadante) [12] se obtuvieron a partir de los Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma (Iowa City, IA, EE.UU.). Los anticuerpos monoclonales, anti-músculo liso α-actina (SMA, clon 1A4, IgG2a, 1:400) [28] y anti-sarcoméricas α-actinin (clon EA53, IgG1, 1:600), fueron adquiridos a Sigma (St . Louis, MO, EE.UU.). Anti-Nkx2.5 (cabra IgG, 1:100) fue adquirido de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, Ca, EE.UU.). Por doble inmunohistoquímica, hemos utilizado FITC-conjugado de cabra anti-ratón IgG2a, RITC-conjugado de cabra anti-ratón IgG2a, conjugado con FITC cabra anti-ratón IgG1, conjugado con FITC cabra anti-ratón IgG2b, RITC-conjugado de cabra anti-ratón IgM (Sur de la Biotecnología, Birmingham, AL, EE.UU.) y FITC-conjugado con burro cabra anti-IgG (Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.) como secundaria de anticuerpos. Secundaria anticuerpos que se utiliza diluido 1:100 y no una reacción cruzada con tejidos de embriones de pollo (datos no presentados).

III. Resultados

Futuro centro de formación posterior de blastoderm etapa EK-X-XI embriones (región rayada en la Fig. 1] fue cultivada en suero libre de medio definido, fijo y doblemente teñidas con anticuerpos contra diversas cardiomiocitos de proteínas específicas, como Nkx-2,5, músculo liso α-actina (SMA), sarcoméricas α-actinin, Z-line titin sarcoméricas y miosina. Se ha informado de que el SMA es un principio expresado en precardiac mesodermo en fase HH-6 (finales de gástrula) y luego contratado como primer corazón α-actina [6, 29]. Después de 24 Horas en la cultura, no se detectan manchas de estos corazón de proteínas específicas (datos no presentados). Después de 48 Horas en la cultura, el centro específico de factor de transcripción Nkx-2,5 era detectable en los núcleos de las células que expresaban sarcoméricas α-actinin (Fig. 2] [17]. En este momento, pequeña perla-al igual que los depósitos de sarcoméricas α-actinin fueron observadas (61% de explantes, n = 28) a lo largo de la SMA-positivas (95%, n = 19) filamentos, que se da por concluida a las células epiteliales de las fronteras ( Figs. 3 A, 5]. Sarcoméricas α-actinin SMA y también estuvieron presentes alrededor de la circunferencia a la célula-célula frontera. En este momento, no parece maduro sarcoméricas estructura de sarcoméricas α-actinin y SMA se observó (Fig. 5]. El dominio amino terminal de titin (Z-line titin) se expresó (56%, n = 18) y co-localizado con el talón-como depósito de sarcoméricas α-actinin (Figs. 3 B, 5]. Sarcoméricas miosina se distribuyó en una forma difusa (46%, n = 28) en las células dentro de los cuales-como bolas sarcoméricas α-actinin se observó (Figs. 3 C, 5]. Después de 72 Horas en la cultura, 92% o más de explantes expresó sarcoméricas α-actinin (92%, n = 64), SMA (100%, n = 37) y Z-line titin (94%, n = 36). Sarcoméricas miosina se expresó en el 63% de explantes (n = 49). En este momento, el 75% o más de explantes expuesto sarcoméricas tinción de sarcoméricas α-actinin (75%), SMA (81%) y Z-line titin (83%). Por el contrario, una banda asociada sarcoméricas miosina se expuso en el 37% de los explantes (Figs. 4, 5]. El análisis estadístico (prueba exacta de Fisher) se observó que hubo diferencias significativas en el porcentaje de incidencia de expresión o estrías de las cuatro proteínas sarcoméricas como sarcoméricas α-actinin, SMA, Z-line titin y miosina. Los resultados de cada uno de los pairwise comparación se indica en la Figura 5. No hubo diferencias significativas en la incidencia de expresión o estrías entre iZi proteínas, y la incidencia de expresión o estrías de iZi proteínas fue significativamente más alta que la de sarcoméricas miosina.

Se ha informado de que la parte posterior blastoderm contiene no sólo los posibles corazón, sino también las células del músculo esquelético [14]. Por lo tanto, comprobamos la expresión de un músculo esquelético marcador, 12/101, en el culto posterior blastoderm. Sin embargo, no hubo detectable inmunoreactividad a la anti-esquelético retículo sarcoplásmico anticuerpo (12/101 de anticuerpos, los datos no se muestra), lo que indica que maduras del músculo esquelético ha de desarrollar aún después de 72 hr en la cultura. Esto puede ser debido a madurar músculo esquelético no se desarrolla de ovo durante 72 h de incubación [1].

IV. Discusión

En el presente trabajo, se describe que cultivadas posterior blastoderm (epiblast células asociadas a las células subyacentes hypoblast) en el suero sanguíneo libre de definirse medio fue capaz de generar madura myofibrils con sarcomeres. En el inicio de myofibrillogenesis (después de 48 hr en la cultura), los filamentos de actina de SMA se asociaron con diminutas bolas de periódico-al igual que los depósitos de sarcoméricas α-actinin y Z-line titin; en este momento, la deposición de miosina sarcomérica parecía ser difusa . Después de 72 horas, aunque el 75% o más de explantes mostraron sarcoméricas tinción de sarcoméricas α-actinin, SMA y Z-line titin, sarcoméricas miosina se incorporó al sarcómero en sólo el 37% de explantes. Por lo tanto, en este modelo de cultura, myofibrillogenesis tuvo lugar después de 48 hr en la cultura y la madurez myofibrils con sarcomeres desarrollado por 72 hr. Nuestra observación de inmunohistoquímica para myofibrillogenesis apoyó el esquema que la naciente iZi componentes que consta de SMA, sarcoméricas α-actinin, y Z-line titin podría ser generada de forma independiente sarcoméricas miosina asociadas-A-bandas, lo que sería reclutado por el iZi estructura para generar madura myofibrils [16, 19, 30]. Por lo tanto, el proceso de desarrollo de la myofibrillogenesis observada en el culto posterior blastoderm imitado en que vivo [8], en cultivos de cardiomiocitos [16, 19] y cultivadas en placa lateral anterior mesodermo (mesodermo corazón) [7, 24, 25].

El primer desarrollo del corazón en fase de gástrula se ha investigado ampliamente la utilización de embriones aviar, ya que son fáciles de manejar en vivo e in vitro. Durante la gastrulación, las células del corazón presunto están comprometidos con el linaje cardíaca terminal y la diferenciación se produce en torno a la gástrula Néurula etapas (para los exámenes [4, 21]]. Este pliego de condiciones y la posterior diferenciación terminal procesos están regulados por endodermo derivados de la proteína morfogenética ósea (BMP) -2 / 4, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) -8 y antagonistas a la canónica vía Wnt-[2, 9, 20, 22, 24, 27]. En pregastrula embriones, la señalización que regula la formación del corazón-la formación de mesodermo, así como cardiomiocitos no está aún bien entendido. Explantation experimentos utilizando una cultura blastoderm aviar mostró que la parte posterior se desarrolla en epiblast corazón mesodermo, así como cardiomiocitos, si cultivadas con asociados hypoblast o el medio suplementado con activin [18, 23, 31]. Por lo tanto, los tejidos interacción entre la parte posterior epiblast y hypoblast se requiere para generar corazón mesodermo / cardiomiocitos [23, 31]. Sin embargo, los mecanismos moleculares que regulan la inducción del mesodermo corazón / cardiomiocitos de la parte posterior epiblast siguen siendo inciertas. Para investigar los mecanismos moleculares que regulan principios de cardiogenesis, suero nuestra cultura libre de modelo sería conveniente, como la histogénesis in vitro que refleja fielmente en vivo y la pérdida de la función y la ganancia de función experimentos son fáciles de realizar.

Este trabajo recibió el apoyo de subvenciones del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología del Japón (# 17590169 y 17-3456), el Japón Cardiovascular Research Foundation, la Fundación Ciencia Takeda, la Terumo Ciencias de la Vida Fundación, y la Fundación del Corazón Miyata. Algunos de los anticuerpos monoclonales utilizados fueron obtenidos a partir de los Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma (Universidad de Iowa, Iowa City, IA, EE.UU.).