Acta Histochemica et Cytochemica, 2006; 39(5): 125-138 (más artículos en esta revista)

Calcio-proteína de unión Calretinin inmunoreactividad en el Dog Superior Colliculus

Sociedad Japonesa de Histoquímica y Citoquímica
JEA-Young Lee [1], Jae-Sik Choi [1], Chang-Hyun Ahn [1], En-Suk Kim [2], Hong Ji-Ha [3], Chang-Jin Jeon [1]
[1] Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nacional Kyungpook
[2] Departamento de Óptica Oftálmica, Chodang Universidad
[3] Departamento de Ingeniería Genética de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional Kyungpook

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Resumen

Se estudiaron calretinin-inmunorreactiva (IR) las fibras y células en el canino superior colliculus (SC) y estudió la distribución y el efecto de la enucleación en la distribución de esta proteína. Localización de calretinin se observó immunocytochemically. Una densa plexo de la lucha contra la calretinin-IR fibras se encuentran en la parte superior de la capa superficial de color gris (SGL). Casi todos los etiquetados son las pequeñas fibras de diámetro con unas varices. El intermedias y profundas capas contiene muchas calretinin-IR neuronas. Etiquetados neuronas en la capa intermedia de color gris (IGL) formado agrupaciones en muchas secciones. Por el contrario, la etiqueta neuronas en la capa profunda de color gris (DGL) no constituyen en clusters. Calretinin-IR neuronas en el IGL y DGL variadas en morfología y vuelta incluido / ovalada, vertical fusiforme, stellate, horizontal y neuronas. Las neuronas con varices dendritas fueron etiquetados también en el IGL. La mayoría de los etiquetados son las neuronas pequeñas y medianas en tamaño. Monocular enucleación produjo una reducción casi total de calretinin-IR en las fibras SC contralateral a la enucleación. Sin embargo, muchos calretinin-IR células apareció en el contralateral superficial SC. Enucleación al parecer no tienen ningún efecto sobre la distribución de calretinin-IR neuronas en el contralateral intermedias y profundas capas de la SC. El calretinin-IR neuronas en el perro superficial SC fueron heterogéneos pequeño y mediano tamaño ronda entre ellas neuronas / ovalada, vertical fusiforme, stellate, piriforme, y en forma horizontal. Dos colores inmunofluorescencia reveló que las células no en el perro SC expresada calretinin y GABA. Muchos peroxidasa de rábano (HRP) marcado con células ganglionares de la retina se observaron después de las inyecciones en las capas superficiales. La gran mayoría del sistema de doble etiquetado células (HRP y calretinin) eran pequeñas células. Los resultados indican que los anticuerpos a calretinin etiquetas de las subpoblaciones de neuronas en el perro SC, que no expresan GABA. Los resultados también sugieren que la calretinin-IR afferents en las capas superficiales del perro SC proceden de clases pequeñas células ganglionares de la retina. La expresión de calretinin podrían ser modificados por la actividad celular selectiva de neuronas collicular superficial. Estos resultados son valiosos en delinear la arquitectura básica neuroquímicos del perro sistema visual.

I. Introducción

Calcio-proteínas de unión ya se han demostrado como para facilitar la buena marcadores para distinguir las subpoblaciones de neuronas [2, 4]. Estas proteínas también han sido implicados en muchos estudios debido a que sus cambios en la distribución en muchas enfermedades neurodegenerativas [12, 24, 43]. Entre los muchos calcio-proteínas de unión, tres de calcio-proteínas de unión en particular, calbindin D28K, calretinin, y parvalbumin, abundantemente se producen en diversos tipos de neuronas en el sistema nervioso central [2, 4, 11, 41]. Sin embargo, las funciones de estas proteínas no han sido establecidas. Es posible que simplemente el trabajo como el calcio buffers, o pueden trabajar activamente en calcio mediada por la transducción de señales [40, 43].

El mamífero superior colliculus (SC) es una región muy diferenciados de alternar las fibras y las células situadas en el techo del cerebro medio y es el centro de visuo-motor de la integración. Es una de siete capas estructura que puede dividirse en tres superficial (zonal, ZL; superficial de color gris, SGL y óptica capas, OC) y cuatro capas profundas (gris intermedio, IGL; intermedia de color blanco, IWL; profundidad de color gris, DGL; y capas de profundidad de color blanco, DWL) [10, 14]. Una de las principales características de la organización de la SC es la distribución topográfica de sus afferents y efferents. Muchos aferente de fibras eferentes y las células son separadas específicas en láminas o han inhalaciones y parches que se describió por primera vez por Graybiel [10, 14, 15, 17]. Calcio-proteínas de unión exposición segregación horizontal laminar en la SC. Por lo tanto, el calcio, proteína de unión calbindin D28K se encuentra en las células que se encuentran en tres capas de los mamíferos SC [3, 23, 29, 31, 44]. El parvalbumin-inmunorreactiva (IR) las neuronas se concentran en una densa en el nivel de profundidad y SGL superior OC [5, 32]. Calretinin forma un denso plexo de fibras inmunorreactivas en las capas superficiales de la SC [8, 13, 21, 23, 42, 46]. Sin embargo, hay diferencias significativas en la distribución de calretinin en el conejo SC [20].

Hemos informado anteriormente la distribución de calretinin en sistema visual de varias Comisiones Permanentes de mamíferos inferiores [13, 20, 21, 50]. Sin embargo, la aplicación directa de los datos obtenidos en animales inferiores a los seres humanos es limitado, ya que la fisiología de los animales inferiores es profundamente diferente de la de los seres humanos. El grado de patológicos y las características genéticas de los perros está muy cerca de los seres humanos [38]. Sin embargo, el calcio-proteína de unión calretinin inmunoreactividad no ha sido reportado en el perro SC. Por lo tanto, el objetivo principal del presente estudio era proporcionar los conocimientos de infraestructura de calretinin chemoarchitecture perro en la SC a través del análisis de la morfología, distribución, y el efecto de enucleación, como los perros son parte integrante del proceso de investigación [22, 38, 49] . Nuestra comprensión de cómo el cerebro humano en funciones de la salud y la enfermedad se beneficiarán de la comparación de su estructura con el cerebro del perro. Nuestro objetivo secundario fue investigar si hay alguna especie diferencias en la distribución de esta proteína, como varias especies se utilizan en anatómicas y fisiológicas de estudios collicular la neurotransmisión.

II. Materiales y Métodos
Animales

Doce perros coreano naturales (Tres Sapsarees coreano y nueve perros de raza mixta; 4-12 meses, 4-10 kg) fueron utilizados para estos experimentos. El Sapasrees se obtuvieron a partir de una colonia de cría mantenida por la Fundación para la Conservación de Sapsaree en Daegu, Corea y la sociedad mixta de perros de raza se obtuvieron de un proveedor local. Los animales fueron divididos en tres grupos. En primer lugar, intacto perros (n = 4, dos Sapsarees y dos sociedades mixtas de perros de raza) se utilizaron para determinar la distribución normal de inmunoreactividad para el calcio, proteína de unión calretinin. En segundo lugar, de manera unilateral anucleadas perros (n = 2; un Sapsaree y una sociedad mixta de raza de perro) se produjeron con el fin de examinar los efectos de la diferenciación de la retina. En tercer lugar, peroxidasa de rábano (HRP) se utilizó (n = 6; sociedad mixta de perros de raza) como un trazador retrógrado para identificar las neuronas en la retina proyecto que a SC. Enucleación se realizó bajo anestesia profunda con una mezcla de clorhidrato de ketamina (30-40 mg / kg) y xylazina (3-6 mg / kg) (complementado, según sea necesario para mantener la anestesia). Proparacaine HCl (200-300 μ l) fue aplicado a la córnea para suprimir los reflejos de parpadeo. Los ojos fueron retirados por la corte cuidadosamente extrínsecos músculos y del tejido que rodea el globo ocular, y finalmente la ruptura del nervio óptico justo detrás de la papila. La herida se llena de estéril gelform para prevenir el sangrado. Los animales se les permitió recuperarse de la anestesia bajo la calidez de un iluminado lámpara de 100 W. Inyección intramuscular de una acción prolongada antiphlogistic Voren suspensión (200-300 μ l / kg, Boehringer Ingelheim Vetmedica Ltd Corea, Seúl, Corea) se ha dado cada cuatro días. El enucleados los perros se les permitió sobrevivir durante 10 quinquies. El Instituto Nacional de Salud directrices para la utilización y el cuidado de los animales fueron seguidos por todos los procedimientos experimentales. Todos se hicieron esfuerzos para reducir al mínimo el sufrimiento de los animales, así como el número de animales utilizados.

Perfusión y procesamiento de tejidos

Los perros fueron anestesiados profundamente con una mezcla de clorhidrato de ketamina (30-40 mg / kg) y xylazina (3-6 mg / kg) antes de la perfusión. Todos los perros fueron perfundidos intracardially con paraformaldehído al 4% y 0.3-0.5% glutaraldehido en 0,1 M tampón fosfato de sodio (pH = 7,4) con 0,002% de cloruro de calcio añadido. Después de la exposición de la cavidad torácica, el 1% de nitrito de sodio (0,3 ml / kg) y 25000 unidades de heparina sódica (0,5 ml / kg) fueron inyectados directamente en el corazón para dilatar los vasos sanguíneos y reducir la coagulación. A raíz de una prerinse de con-buffer fosfato salino (PBS, pH = 7,2, aproximadamente 500 ml / kg) durante un periodo de 3-4 min, cada perro fue perfundido con el mismo fijador (aproximadamente 1000 ml / kg) por 1-2 Horas a través de una jeringa con aguja insertada a través del ventrículo izquierdo y aorta. La cabeza fue entonces removido y colocado en el fijador por 2-3 hr. El cerebro fue extraído del cráneo y 2-3 hr almacenados en el mismo fijador y lo abandonó en la noche a la mañana 0,1 M tampón fosfato (pH = 7,4) que contiene 8% de sacarosa y 0,002% CaCl 2. La SC se ha retirado, montado en un plato, y cortado en 50 μ m de espesor coronal secciones con un vibratome.

HRP inmunocitoquímica

Un anticuerpo policlonal contra calretinin (Chemicon, EE.UU.) y un anticuerpo monoclonal contra el GABA (Sigma, EE.UU.) han sido utilizados en el presente estudio. El SC secciones fueron procesados libres flotando en pequeños viales. Por inmunocitoquímica, las secciones fueron incubadas en el 1% borohidruro de sodio (NaBH 4) por 30 min. Posteriormente, estas secciones son para enjuagarse 3 × 10 min en 0,25 M Tris buffer, y luego incubadas en 0,25 M Tris buffer con el 4% de suero normal (suero normal de cabra para calretinin normal y suero de caballo GABA) durante 2 horas con 0,5% Triton X-100 añadió. Las secciones fueron incubadas en el antisuero primario en 0,25 M Tris buffer con un 4% normal en suero durante 48 h con 0,5% Triton X-100 añadió. El principal anticuerpo fue diluido 1:500-1000 (calretinin) o 1:100-200 (GABA). Después de 3 × 10 min enjuagues en 0,25 M Tris buffer, las secciones fueron incubadas en una dilución de 1:200 con biotina secundaria de IgG en 0,25 M Tris buffer con un 4% para el suero normal de 2 horas con 0,5% Triton X-100 añadió. Las secciones fueron para enjuagarse 3 × 10 min en 0,25 M Tris buffer y luego incubadas en una dilución de 1:50 avidina-biotina peroxidasa de rábano complejo (Vector de laboratorio, EE.UU.) en 0,25 M Tris buffer de 2 hr. Las secciones se enjuagarse de nuevo en 0,25 M Tris buffer de 3 × 10 min. Por último, la tinción fue visualizado por reaccionar con 3,3 '-Diaminobencidina tetraclorhidrato (DAB) y el peróxido de hidrógeno en 0,25 M Tris buffer de 3-10 min utilizando un equipo de reactivos DAB (Kirkegaard & Perry, EE.UU.). Todas las secciones eran luego enjuagar en 0,25 M Tris buffer antes de montar. Desprendimiento de retina en su conjunto se monta se procesaron más de vibratome secciones para lograr la plena introducción de anticuerpos mediante el mismo tipo de montaje en su conjunto las técnicas de inmuno [20]. Ellos fueron procesados 72 Horas en el principal anticuerpo y 24 Horas en la secundaria de anticuerpos y complejos ABC, respectivamente. Como control, algunas secciones fueron incubadas en la misma solución sin tener que añadir el anticuerpo primario. Estos tejidos de control no mostró inmunoreactividad calretinin. A raíz de la inmuno procedimientos, el tejido se montó en Superfrost Plus diapositivas (Fisher, EE.UU.) y se seca en la noche a la mañana a 37 ° C horno. A continuación, las secciones fueron montadas deshidratados, limpiado, y coverslipped. Algunos se monta toda la coverslipped en el glicerol, sin los procedimientos de deshidratación. Los tejidos fueron examinadas y fotografiadas con un microscopio Zeiss Axioplan, usando métodos convencionales o contraste diferencial de interferencia (DIC) óptica.

Fluorescencia inmunocitoquímica

Para generar simultáneamente dos etiquetas, las secciones fueron incubadas en el antisuero primario utilizando las medidas adecuadas se ha descrito anteriormente. Para la detección por inmunofluorescencia, la secundaria de anticuerpos fueron fluoresceína conjugado anti-conejo IgG (Vector de laboratorio) para detectar los anti-anticuerpos calretinin y Cy5-conjugado anti-ratón IgG (Jackson ImmunoResearch Lab.) Para detectar los anti-anticuerpos GABA. Secciones fueron etiquetados con coverslipped Vectashield medio de montaje (Vector de laboratorio). Las imágenes se obtuvieron y vistos con un Zeiss LSM510 de escaneo láser confocal microscopio.

La inyección de peroxidasa de rábano (HRP)

HRP (Sigma, Tipo IV) fue utilizado para los experimentos diseñados para etiqueta retinotectal neuronas de proyección. Inyecciones en las capas superficiales de la SC se realizaron en seis perros. Sustancial retrógrada etiquetado de las células ganglionares con HRP se obtuvo en dos animales en los que hemos tenido éxito inyectado superficial SC. A 5 μ l Hamilton microjeringa con una aguja calibre 30 montada sobre una especialmente diseñada dispositivo de inyección adjunta a la stereotaxic aparato fue utilizado para inyectar la solución HRP. Inyecciones constaba de 0.3-1.5 μ l de un 30% HRP en la solución de agua destilada. Los animales fueron entonces autorizados a recuperar y para sobrevivir durante 48 horas antes de la perfusión.

HRP histoquímica

Retrogradely transportados HRP fue identificado por un descritos anteriormente, el cobalto-níquel intensificación procedimiento [35]. En pocas palabras, los cortes de tejido se incubaron en una solución de 0,05% Diaminobencidina tetraclorhidrato con 0,005% de cloruro de níquel y cobalto 0,005% en acetato 0,1 M tampón fosfato durante 10 min, y además se incubaron en 0,05% DAB 0,01% con peroxidasa de hidrógeno (H 2 O 2) por 15-30 min. Las secciones fueron luego enjuagarse varias veces en PBS antes de ser reaccionó para inmunocitoquímica.

El análisis de los datos

Para determinar los tipos morfológicos de la calretinin-IR células, tomamos muestras secuenciales de cinco campos, cada uno de 310 μ m × 310 μ m en la zona, a través de la SGL, IGL, y DGL de la SC. Cada campo se situarán en aproximadamente intervalos iguales. Los grandes vasos sanguíneos fueron excluidos de la medición de campos en movimiento sobre el terreno ligeramente para evitar sesgar las medidas. El análisis se hizo con un 40 × Zeiss Plan-Apochromat objetivo. Tipos de células dentro del IGL y DGL fueron analizados a partir de los tres (uno rostral, una media, y un caudal SC) mejor etiquetado de las secciones cada una de las dos normales de los animales (un total de 30 campos de cada capa). Tipos de células dentro de la SGL fueron analizados a partir de los tres (uno rostral, una media, y un caudal SC) los artículos etiquetados mejor de cada uno de los dos animales enucleados (un total de 30 campos). Para obtener las mejores imágenes, se analizaron las células bajo contraste diferencial de interferencia (DIC) óptica. Sólo perfiles de células que contiene un núcleo y, por lo menos ligeramente visible un nucleolo se incluyeron para su análisis. El objetivo del presente estudio fue obtener una estimación morfológicas de cada tipo de células.

Para comparar el número de calretinin-IR células normales de la SC, y la ipsilateral y contralateral lados de la anucleadas perros, también contó la etiqueta células secuencial en cinco campos, cada uno de 500 μ m × 500 μ m en la zona, a través de la medial-lateral medida de la SC. Cada campo se centró en los SGL, IGL, y DGL. Tres cortes de tejido (una rostral, una media, y un caudal) de las cuatro normales y dos animales fueron enucleados medido. Hemos resumido el número de células obtenidas etiquetados para comparar la normal (un total de 60 campos en cada capa de cuatro normales SC), ipsilateral (un total de 30 campos de cada capa de dos perros anucleadas), y las partes contralateral (un total de los campos en cada capa de la anucleadas dos perros) a la enucleación. El número de calretinin-IR en las células ipsilateral y contralateral partes a la enucleación fue expresada como el porcentaje de las células etiquetados en el control normal. Las proporciones fueron evaluados estadísticamente por un estudiante de la prueba "t" entre lo normal y ipsilateral y contralateral partes a la enucleación.

III. Resultados
Distribución de la inmunoreactividad calretinin

Calretinin inmunoreactividad es muy selectiva distribuidos en las SC de todos los perros normales. Una densa plexo de calretinin-inmunorreactiva (IR) las fibras se encuentran en la parte superior de la SGL en toda la extensión rostrocaudal (Figs. 1, 3], su espesor es de aproximadamente 400-500 μ m en el nivel medio. Este nivel de fibras de la etiqueta se encuentra en todo el rostral caudal de medida del perro SC. Algunos calretinin-IR fibras se encuentran también en el ZL. Calretinin-IR fibras disminuido gradualmente en densidad en la parte inferior de la SGL y sólo muy escasamente distribuidas en la OC. Todos los calretinin-IR fibras en las capas superficiales son de diámetro pequeño con pocas varices (Figs. 2 A, 3]. No calretinin-IR grandes varices se encontraron fibras. La densa banda de calretinin-IR fibras en las capas superficiales que figuran algunos calretinin-IR células. Sin embargo, la mayoría de los calretinin-IR células en la banda fueron ligeramente etiquetados para calretinin (Fig. 3 C). Algunos fueron dispersados neuronas localizadas en la OC (Fig. 1]. En contraste con las capas superficiales, intermedias y profundas capas contiene muchas calretinin-IR neuronas y mostró un patrón de distribución diferentes. Se formaron dos patrones en la SC. El primer patrón, que es distintivo, se encontró en el IGL (Fig. 1]. En muchos sectores, calretinin-IR neuronas en el IGL formado grupos de neuronas etiquetados. Estas agrupaciones fueron de aproximadamente 300-400 μ m de diámetro. Figura 2 B (flechas) muestra cuatro calretinin-IR agrupaciones de neuronas en el IGL. El segundo patrón de calretinin-IR neuronas se encontró en la DGL. Sin embargo, el segundo patrón no era distintivo en comparación con el primer nivel, el etiquetado y las neuronas no cualquier forma racimos (Fig. 1]. Estas neuronas se distribuyeron en las capas. Algunas neuronas dispersas se observa también en otras capas. El calretinin-IR neuronas en el IGL y DGL puede verse en toda la extensión rostrocaudal de la SC.

Efectos de la enucleación monocular

Para determinar si la calretinin marcado fibras en las capas superficiales se originó a partir de la retina y para investigar la actividad que dependen de los cambios de expresión calretinin, se realizó enucleación del ojo. Figura 1 B (brillante de campo) y 3A (campo oscuro) muestran calretinin inmunoreactividad en el perro normal SC, mientras que la Fig. 1 C (brillante de campo) y 3B (de campo oscuro) muestran inmunoreactividad calretinin después de enucleación monocular. Una notable reducción de calretinin inmunoreactividad se produjo en las capas superficiales de la SC contralateral a la enucleación; calretinin-positivas fibras fueron casi completamente eliminados tras enucleación del ojo (Figs. 1 C, 3 B). Por el contrario, en las capas superficiales de la SC contralateral a la enucleación, muchos calretinin de células positivas fueron observadas (Figs. 1 C, 3 D). Enucleación al parecer no tienen ningún efecto sobre la distribución de calretinin-IR neuronas en el contralateral IGL y DGL de la SC. Aunque hemos visto ocasionalmente en la variabilidad inmunoreactividad en la ipsilateral y contralateral SC, no hubo diferencia en consonancia después de enucleación en la etiqueta las neuronas en las dos partes en calretinin-IR secciones.

Cuantitativamente, después de enucleación unilateral, hubo un aumento significativo del número de calretinin-IR células en el contralateral SGL experimental en comparación con el SGL normal (Fig. 4]. Calretinin-IR de las células anucleadas perros aumentado en número; 8,22% (p = 0,09) en el ipsilateral SGL, 126,38% (p <0.0001) en el contralateral SGL más numerosos que los de la normal SGL. A diferencia de la SGL, después de enucleación unilateral, no hubo cambios significativos en el número de calretinin-IR en las células ipsilateral y contralateral caras en comparación con el normal IGL y DGL (Tabla 1].

Morfología de calretinin-IR neuronas

En las capas superficiales de la SC contralateral a la enucleación, muchos calretinin de células positivas fueron observadas recientemente. Estas células son de diversas formas, el principal tipo neuronal en la SGL, marcadas con anticuerpos contra calretinin era oval o redonda con muchas células dendritas coursing en todas las direcciones. Figura 5 C muestra representativa multipolar redonda u oval células. Otros fueron vertical fusiforme, stellate, horizontal, piriforme y células. Figura 5 A muestra una célula fusiforme vertical que muestra una vertical de células fusiformes con un cuerpo principal, largo proceso ascendente hacia la superficie y Pial un largo proceso descendente. Figura 5 D muestra un tamaño medio stellate neurona. Stellate había polygonally células en forma de células con numerosos organismos dendritas coursing en todas las direcciones. Figura 5 E muestra una celda horizontal que muestra una horizontal orientado a los pequeños, cuerpo fusiforme celular y horizontal orientados a procesos. Las células piriforme (Fig. 5 B) había forma de pera de células y órganos creados en virtud de una gruesa, muñón proximal dendríticas superficialmente dirigida hacia la superficie Pial. Piriforme y horizontal tipos de células, sin embargo, rara vez se encuentran. Cuantitativamente, 57,60 ± 1,67% (media ± DE) (371 de 693 células) de la lucha contra la calretinin etiquetados neuronas se redondeados u ovales, 19,30 ± 1,26% (158 de 693 células) fueron vertical fusiforme, 19,10 ± 1,28% (138 de 693 células) se stellate, 2,04 ± 1,08% (15 de 693 células) son horizontales, y 1,80 ± 1,07% (11 de 693 células), las neuronas se piriforme (Fig. 9].

A pesar de que algunas células se localizan en las capas superficiales normales, la coloración pálida fue en la mayoría de los etiquetados calretinin neuronas (Fig. 6]. En la SC normal superficial, la morfología de las células etiquetada es similar a la de las capas superficiales de la SC contralateral a la enucleación. Figura 6 muestra representativa D multipolar redonda u oval células. Figura 6 muestra un vertical fusiforme celular, mientras que la Figura 6 muestra un B de tamaño mediano stellate neurona. Figura 6 y 6E C rara vez se muestran encontrado piriforme y células horizontales. Al igual que en la etiqueta las células de las capas superficiales de la SC contralateral a la enucleación, 51,30 ± 1,35% (media ± desviación estándar) (74 de 144 células) de la lucha contra la calretinin etiquetados neuronas se redondeados u ovales, 20,81 ± 0,52% (30 de 144 células) fueron vertical fusiforme, 18,73 ± 0,60% (27 de 144 células) se stellate, 5,00 ± 0,43% (7 de 144 células) son horizontales, y 4,16 ± 0,48% (6 de 144 células) se piriforme neuronas en el normal superficial SC (Fig. 9].

La morfología de calretinin-IR en las neuronas normales IGL y DGL fue similar a la de la calretinin-IR neuronas en la SGL. No hubo diferencias sistemáticas en la morfología de calretinin-IR neuronas en el IGL y DGL entre la normal, control y experimental lados de la SC. La gran mayoría de los anti-calretinin-IR neuronas se multipolar redonda u oval neuronas tanto en el IGL y DGL (Figs. 7, 8). Figuras 7A y 7B muestran típico vertical fusiforme neuronas en el IGL, mientras que la Fig. 7 y C 7F show típico multipolar redondeados u ovales neuronas. Stellate (Fig. 7 E) y horizontal (Fig. 7 G) neuronas También se encontraron. Sin embargo, piriforme células no se encuentran en el IGL. Otra característica notable de calretinin-IR neuronas en el IGL fue la presencia de varices dendritas. Figura 7 D (puntas de flecha) muestra una neurona stellate con varices dendritas. Cuantitativamente, 55,35 ± 1,29% (media ± DE) (212 de 383 células) de la lucha contra la calretinin etiquetados neuronas se redondeados u ovales, 21,67 ± 0,50% (83 de 383 células) fueron vertical fusiforme, 20,62 ± 0,48% (79 de 383 células) se stellate, y 2,34 ± 0,05% (9 de 383 células) fueron horizontal neuronas en el IGL (Fig. 9]. La figura 8 muestra representativa calretinin-IR neuronas en la DGL. Figuras 8 A y 8 B se desprenda vertical fusiforme neuronas en la DGL, mientras que la Fig. 8 C muestra una neurona multipolar ronda. Figuras 8 y D 8E mostrar multipolar stellate neuronas y horizontal, respectivamente. Cuantitativamente, 46,82 ± 0,71% (media ± DE) (118 de 252 células) de la lucha contra la calretinin etiquetados neuronas se redondeados u ovales, 25,39 ± 0,38% (64 de 252 células) fueron vertical fusiforme, 24,60 ± 0,37% (62 de 252 células) se stellate, y 3,17 ± 0,04% (8 de 252 células) fueron horizontal neuronas en el DGL (Fig. 9].

Co-localización de calretinin con GABA

Para determinar si la calretinin-IR células co-localizar con GABA, calretinin etiquetados con fluoresceína y con Cy5 GABA. Se verificaron las seis secciones de calretinin-IR neuronas a partir de dos animales enucleados y otras seis secciones de calretinin-IR neuronas a partir de dos animales normales. Se verificaron todos los calretinin-IR neurona dentro de la superficial, intermedio y profundas capas. Aunque con algunas neuronas GABA o calretinin fueron similares en tamaño, forma, y la forma de la distribución en los superficial, intermedio y profundas capas, las neuronas no eran etiquetados con tanto anti-calretinin y anti-anticuerpos GABA (Fig. 10].

HRP retrógrada rastreo experimentos

A fin de determinar la subclase de células ganglionares de la retina que la oferta calretinin-IR fibras para la SC, peroxidasa de rábano (HRP) se utilizó como trazador retrógrado para identificar las neuronas en la retina. Entre los seis casos, HRP inyecciones fueron colocados con éxito en la SC superficial en dos casos. Entre estos dos casos, muchos retrogradely etiquetados neuronas se observó claramente inferior en la retina las regiones 13-16 mm de distancia de la cabeza del nervio óptico en un caso. Un pequeño número de neuronas retrogradely marcado se observó en el otro caso. Desprendimiento de retina en su conjunto se monta retrogradely etiquetados que contienen las neuronas fueron tratados durante calretinin inmunocitoquímica. La figura 11 muestra el lugar de la inyección que se concentró en la capa superficial de la SC (Fig. 11 D) de un animal que produjo muchos retrogradely etiquetados con las células ganglionares de HRP y calretinin marcado células. Figura 11 Una muestra de tamaño medio-IR calretinin neurona (punta de flecha pequeña), una pequeña etiqueta HRP-neurona (punta de flecha grande), y un pequeño doble etiquetado neurona (flecha). Figura 11 B muestra pequeña calretinin-IR neuronas (puntas de flecha pequeña) y los pequeños HRP-etiquetados neuronas que también immunostained con calretinin (flecha). A este diferencial de alta potencia injerencia photomicrograph contraste, un gran células ganglionares sin calretinin fue visto (asterisco). Figura 11 C muestra un marcado con HRP grandes células ganglionares, junto con un gran células ganglionares de ninguno-IR para calretinin y un pequeño células ganglionares de infrarrojos para calretinin. Nosotros no pudo encontrar ningún doble etiquetado grandes (> 30 μ m), las neuronas en las zonas de la retina en su conjunto se monta en el presente estudio. La gran mayoría del sistema de doble etiquetado neuronas (HRP y calretinin) eran pequeños (<15 μ m).

IV. Discusión

El patrón de distribución de calretinin-IR fibras en las capas superficiales del perro SC es similar a la observada en estudios anteriores en humanos [23], mono [46], gato [13], ratas [1], un ratón [8] , SC y hámster [21]; el anticuerpo contra calretinin formó una densa plexo de fibras de la etiqueta en las capas superficiales de la SC. Sin embargo, calretinin no forman un plexo de fibras de la etiqueta en la SGL conejo de la SC. Por el contrario, muchos anti-calretinin marcado neuronas se localizan en las capas superficiales del conejo SC [20]. Estos resultados sugieren que existen algunas diferencias en las especies calretinin inmunoreactividad en las capas superficiales de mamíferos SC. Esta diversidad de especies sugiere que las diferentes necesidades funcionales responder mejor a los diferentes contextos del comportamiento visual y hace hincapié en la importancia de la investigación de la arquitectura neuroquímicos en diversos animales.

Los resultados indican IGL en las diferencias de distribución de la pauta de calretinin-IR neuronas que pueden reflejar diferencias funcionales específicas de aferente y eferentes conexiones de la SC a través de especies. Leuba y Saini (1996) encontraron una amplia banda de calretinin-IR neuronas en el IGL y DGL en humanos. La distribución de calretinin-IR células en las capas más profundas de mono SC tampoco forma alguna las agrupaciones [46]. En SC perro, las neuronas en el IGL forma racimos. Por lo tanto, importantes diferencias en la distribución calretinin existir entre humanos, monos, perros y SC. Una de las más distintivas características de la organización de la SC es su arquitectura compartimental. Muchos aferente y eferentes muestran los sistemas de grupos, parches, inhalaciones, o dominios dentro de la SC con el espacio, neurochemically, y anatómicamente separadas ciertas deficiencias sensoriales y neuronas motoras [10, 15, 16, 26]. Muy preciso modular de organización de grupos de células eferentes aferente y parches se ha observado también en gatos IGL, donde la celda que las agrupaciones de proyectos para la región cuneiforme se encontraron, precisamente, a la superposición con el terminal colinérgico parches [18, 19]. El calretinin-IR agrupaciones identificadas en el presente estudio sugieren fuertemente que promueven la segregación selectiva de la información de collicular afferents de las distintas clases de comportamiento motor.

Los resultados indican que varios tipos de calretinin-IR neuronas son coexistentes en el perro a lo largo del SC superficial, intermedio y profundas capas. En el presente estudio, los calretinin-IR neuronas en todas las capas del perro SC fueron heterogéneos pequeño y mediano tamaño ronda entre ellas neuronas / ovalada, vertical fusiforme, stellate, y en forma horizontal. Unas pocas células piriforme se encuentra también en las capas superficiales. Sin embargo, no se encontraron células piramidales en cualquier capas de la SC. En contraste con nuestros resultados, Leuba y Saini [23] encontró que calretinin-IR neuronas en la SC humanos eran pequeñas-a de gran tamaño incluidas las neuronas piramidales en forma de células órganos creados en virtud de una gruesa con dendrita proximal orientada hacia la superficie Pial. Monkey SC también contiene numerosos grandes calretinin-IR neuronas en el IGL [25, 46]. En el presente estudio, una única clase de calretinin-IR neuronas se encuentran en el perro IGL. Estas neuronas de células pequeñas ha órganos y distintivo varicosas dendritas. A pesar de que estos tipos de calretinin-IR neuronas no han sido descritas en otros mamíferos SC, por ejemplo, las neuronas también han sido reportados en calbindin-IR en las neuronas gato SC [32]. Varices si estos están relacionados con la vesícula que contiene dendritas sólo pueden ser respondidas por microscopía electrónica. Sin embargo, la densidad presináptica se ha descrito en el IGL del gato SC [36]. Los resultados combinados con los anteriores resultados indican que existen diferencias en calretinin-IR en las neuronas de mamíferos SC. Estas diferencias de forma entre las diferentes especies indican que la expresión de genes calretinin en la subclase de collicular neuronas es diferente y reflejar las diferencias en sus conexiones sinápticas.

Al igual que en resultados anteriores [1, 8, 13, 21, 33, 47] en el actual estudio de una marcada reducción en calretinin-fibras inmunorreactivas se produjo en las capas superficiales del perro SC contralateral a la enucleación. Muchos calretinin-IR neuronas apareció en la SC superficial después de enucleación. Un número de investigadores han sugerido que calretinin está estrechamente vinculada a la actividad que dependen de los cambios. Por ejemplo, la ablación coclear unilateral dado lugar a un aumento calretinin inmunoticción núcleo coclear dentro de las neuronas [6]. El nivel de expresión de calretinin en las neuronas del hipocampo se sintoniza a la excitación y la actividad inhibidora de equilibrio [27]. Mayor stiatal excitatorios de entrada ha demostrado que aumenta la expresión de calretinin estriatal en las neuronas [34]. El presente y los anteriores resultados sugieren que los cambios en la expresión de calretinin se producen en respuesta a los cambios en la actividad neuronal. Sin embargo, los datos actuales muestran que los patrones de distribución de los subtipos morfológicos de calretinin-IR en las neuronas superficiales SC fueron similares entre los normales y experimentales partes. Estos resultados sugieren que aumenta la enucleación expressional los niveles de mRNA que se expresa débilmente en el estado normal. Actividad que dependen de los cambios de calretinin ARNm se han comunicado [48]. Diferencialmente a las capas superficiales, no obstante, enucleación parecía tener ningún efecto sobre la calretinin-IR en las neuronas intermedias y profundas capas de perro SC. Los presentes resultados sugieren que la calretinin que contienen las neuronas en SC superficial puede ser más plástico que calretinin-IR en las neuronas intermedias y profundas capas después de enucleación.

SC de mamíferos se ha demostrado que contienen una alta concentración de neuronas GABAérgicas [30, 37]. Sin embargo, en el presente estudio de dos colores de inmunofluorescencia demostró que no hay superposición entre las células teñidas de que para calretinin y teñidos para GABA. Estos resultados sugieren que calretinin-IR neuronas no son interneuronas GABAérgicas en el perro SC. De este modo, los presentes resultados sugieren que algunas de las calretinin-IR neuronas en el perro SC son las neuronas de proyección. En contraste con la SC, una gran proporción de calretinin-IR neuronas se encontraron IR para GABA en la corteza visual [9, 28]. Los datos cuantitativos muestran que el grado de colocalización de calretinin con GABA difiere marcadamente visual en diferentes estructuras de indicar el único características químicas de calretinin.

En nuestra anterior HRP-estudio de seguimiento en cat SC, nos mostró que la gran mayoría de calretinin-IR fibras en las capas superficiales del gato SC proceden de pequeñas gamma-tipo de células que han W tipo physiologies [13]. Nuestros resultados actuales muestran que las grandes células ganglionares de la retina en la retina de perros son negativos en contra de anti-calretinin inmunoreactividad. El calretinin-IR en las fibras superficiales perro SC eran pequeños. HRP inyecciones en las capas superficiales del perro SC marcado tanto grandes como pequeñas células ganglionares de la retina. Sin embargo, ninguna de las grandes células ganglionares se HRP y calretinin doble etiquetado. Estos resultados sugieren fuertemente que calretinin-IR afferents en las capas superficiales del perro SC proceden de clases pequeñas células ganglionares de la retina.

A pesar de que la propiedades bioquímicas de esta proteína han sido bien caracterizadas, las propiedades funcionales de calretinin en el cerebro son todavía poco claras. Sugerido funciones de calretinin comprenden un papel en la neuroprotección contra la excitotoxicidad o un calcio-buffering función en las células que expresan esta proteína en el cerebro [12, 40, 43]. Un estudio reciente ha sugerido que en el calretinin células ganglionares de la retina juega un papel importante en el crecimiento del nervio óptico en el SC y en la regeneración del nervio óptico después de la lesión en peces cebra [7]. Es posible que los grupos de la calretinin-IR neuronas en el IGL recibir aportaciones específicamente relacionados con los movimientos oculares [45]. También hay pruebas de que algunas sacadas relacionados con células en la SC se organizan en grupos [39]. Por lo tanto, calretinin pueden desempeñar un papel fundamental en los movimientos oculares sacádicos. Las inhalaciones y muchos parches de multisensorial afferents y efferents motor, la segregación y agrupación de calretinin-IR neuronas, y la marcada heterogeneidad de las neuronas en la SC indican un papel para calretinin en la SC. Nuestras futuras investigaciones se tratará de determinar cuál es la función.

Damos las gracias al profesor Robert Flaherty, Instituto de Idiomas de la Universidad Nacional de Kyungpook, corrección de pruebas para el Inglés. Este trabajo fue apoyado por un Grant (R01-2003-000-10505-0) a partir del Programa de Investigación Básica de la Corea de Ciencias e Ingeniería de la Fundación, y en 2003 la Universidad Nacional de Kyungpook Equipo de investigación del Fondo.