Immunity & Ageing, 2006; 3: 10-10 (más artículos en esta revista)

El envejecimiento se asocia con una disminución en la sangre periférica CD56 brillante células NK

BioMed Central
Shivani M Chidrawar (shivanichidrawar@doctors.org.uk) [1], Naeem Khan (nkhan@bham.ac.uk) [2], Chan YL Tracey (chant@doctors.org.uk) [1], Laxman Nayak ( uslnayak@bham.ac.uk) [3], Paul Moss AH (p.moss @ bham.ac.uk) [2]
[1] Escuela de Medicina, Universidad de Birmingham, Edgbaston, Birmingham, B15 2TT, Reino Unido
[2] Instituto de Estudios sobre el Cáncer, Vicente Drive, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham, B15 2TT, Reino Unido
[3] Centro de Gerontología Aplicada, Selly Oak Hospital, Raddlebarn Road, Birmingham, B29 6JD, UK

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Resumen
Fondo

Natural killer (NK) las células son linfocitos citotóxicos que carecen de CD3 y expresar variable niveles de CD16, CD56 y CD57. En los últimos años, las células NK han sido clasificadas en dos grandes grupos basados en el nivel de expresión de CD56. Esta clasificación fenotípica se correlaciona con la actividad funcional como CD56 brillante células NK son las principales productoras de citoquinas subconjunto mientras que CD56 dim células NK presentan una mayor actividad citotóxica. Estudios anteriores han revelado una reducción en el total de número de células NK en asociación con el envejecimiento y este estudio trata de determinar la posible influencia del envejecimiento sobre el número de subconjuntos de células NK en sangre periférica.

Resultados

El número de NK (CD56 + CD3 -) dentro de las células de sangre periférica no se modificó con el aumento de la edad. El número de CD56 dim células NK también se mantuvo estable con el envejecimiento. En contraste, el número absoluto de CD56 brillante dentro de las células NK de sangre periférica se redujo en un 48% con el envejecimiento de una media de 15,6 / μ l en individuos con edades 20-40 años a 8,1 / μ l en edades comprendidas entre los 60 + años (p = 0,0004).

Conclusión

El número de CD56 brillante células NK en sangre periférica disminuye con la edad. Como esta población desempeña un papel central en la secreción de citocinas en la respuesta inmune innata esta disminución puede contribuir a la regulación inmune en personas de edad avanzada

Fondo

Natural killer (NK) las células son un grupo heterogéneo de linfocitos grandes granulares derivadas de la médula ósea que son precursores fenotípicamente distintos de T y los linfocitos B. Células NK han sido reconocidos a constituir hasta el 10% de linfocitos de sangre periférica (PBMC) y también se encuentran en los tejidos periféricos incluyendo la cavidad peritoneal, la placenta y el hígado [1, 2]. La activación de las células NK se rige por un equilibrio de las señales a través de activatory y receptores inhibitorios [3], aunque la activación en respuesta a downregulation de MHC de clase I moléculas en la célula objetivo es una potente influencia. Células NK representan la primera línea de defensa contra los infectados por el virus y células neoplásicas, e iniciar la lisis celular y la producción de citocinas por la falta de estimulación antigénica antes [1, 2, 4]. El papel potencial de las células NK en el control del cáncer ha sido sugerida por la observación de una correlación inversa entre las células NK y la incidencia de enfermedad maligna en los estudios de cohorte de seres humanos con un mayor apoyo derivados de estudios murinos [5 - 7]. La participación de células NK se ha informado en la respuesta inmune a los virus varios, incluido el VIH, hepatitis B y C, pero pueden tener especial importancia en los países de acogida de defensa contra el herpes viridae [7 - 9]. La relevancia de las células NK en la acogida de defensa contra los virus del herpes es el mejor ilustrado en el caso aislado de las células NK deficiencia resulta en una serie sistemática de infecciones virales por herpes [10].

El fenotipo de células NK se caracteriza por la falta de expresión del complejo CD3 junto con variable expresión de CD16, CD56 y CD57. CD56 es una integrina homotipica con propiedades de adhesión y en los últimos años los estudios han demostrado la existencia de dos subconjuntos de células NK basado en la intensidad de la expresión CD56. Estas CD56 y CD56 brillante dim subconjuntos se cree que difieren en sus propiedades de la vivienda de los tejidos debido a la diferencia de patrones de expresión de receptores de quimioquinas y moléculas de adhesión. CD56 brillante células NK falta o expresar los bajos niveles de CD16 y sólo representan el 10% de las células NK circulantes, pero son los dominantes subconjunto de células NK en los ganglios linfáticos [11]. En contraste, las grandes CD56 dim población de células NK tiene un fenotipo granular y exhibe más actividad citotóxica de CD56 brillante células NK. Además este subgrupo expresa niveles más altos de CD16 y es por lo tanto, más potente de los anticuerpos dirigidos por la citotoxicidad de células (ADCC). Por el contrario, CD56 brillante células NK son la principal fuente de immunoregulatory citocinas como la IL-10, IL-13 y GM-CSF tras el reconocimiento de antígenos con un mínimo de producción de estas moléculas se observó CD56 de las células NK dim [3]. Esta respuesta de citoquinas es probable que sea crítico en la activación de la respuesta inmune adaptativa de las células NK.

El envejecimiento se asocia con un aumento de la mortalidad y la morbilidad de las enfermedades infecciosas y el cáncer y esto es, al menos en parte relacionadas con el desarrollo de la inmunosenescencia. En informes anteriores se han demostrado alteraciones en el número de células NK y fenotipo en asociación con la edad. En este estudio hemos ampliado estas observaciones a enumerar las células NK en relación con el CD56 y CD56 brillante dim subconjuntos, y se han correlacionado estos resultados con la edad.

Resultados
Características de los pacientes

La población de estudio consistió de 115 personas que fueron divididos en edades comprendidas entre los 20-40 años (n = 25), 40-60 años (n = 23) y> 60 años (n = 67, edad media 79 años). El absoluto de linfocitos se determinó a través de un sistema automatizado Coulter completo de sangre y contrarrestar expresado en células / μ l de sangre. La población total de Nagorno-Karabaj se expresó como un número absoluto (μ l / sangre) y como porcentaje de la piscina linfoide. Expresión CD56 en las células NK se determinó mediante la tinción de las células con un anti-CD56 anticuerpo conjugado con ficoeritrina seguido por citometría de flujo. Células NK fueron separados en dos subgrupos basados en el nivel de expresión de CD56 y el número de células determina de manera similar (figura 1].

El efecto de la edad en número de células NK: las personas de edad avanzada tienen una tendencia hacia una mayor proporción de células NK en sangre periférica

El número de células NK se determinó para cada grupo de edad y se compararon en función del envejecimiento de la población. Una marcada variación en el número de células NK se observó entre los distintos donantes. Sin embargo, aunque hubo una tendencia hacia un pequeño aumento en media NK número de células con el envejecimiento, esto no alcanzó significación estadística (195 células / μ l para las personas de edad 20-40 años; 206 células / μ l para los donantes de edad> 60 años) ( figura 2]. El total de linfocitos disminuyó con la edad y el análisis de células NK como un porcentaje de linfocitos puesto de manifiesto un pequeño aumento con la edad (tabla 1]. Células NK representan el 9,3% de los linfocitos periféricos en piscina donantes de edad 20-40 años, lo que aumenta a 11,2% en donantes mayores de 60 años.

El efecto de la edad en CD56 brillante número de células NK: las personas de edad avanzada tienen un número significativamente más bajos de CD56 brillante células NK

El efecto de la edad se analizó con respecto al número de CD56 en sangre periférica de células NK brillante con 3 color análisis de citometría de flujo. Una disminución progresiva se observa con la edad avanzada; 15,6 células / μ l detectado en la cohorte de edad más jóvenes 20-40 años la caída de 8,1 células / μ l en donantes mayores de 60 años (p = 0,0004) (figura 3] (cuadro 2]. CD56 brillante células NK analizarse como un porcentaje de los linfocitos de sangre periférica también disminuye significativamente con la edad avanzada.

El efecto de la edad en CD56 dim número de células NK: número de células permanece constante con la edad

La influencia de la edad en sangre periférica CD56 dim células NK reveló números relativamente coherente en todas las edades. Una tendencia hacia un ligero aumento de CD56 dim células NK μ l / la sangre se encontró entre los 40-60 y 60 + años cohortes aunque esto no alcanzó significación estadística (figura 3]. A no significativo aumento de CD56 dim células NK en un porcentaje de la sangre periférica linfoide piscina también se observó a la edad avanzada (véase el cuadro 2, figura 4].

Discusión

La disminución en la función inmunológica con el aumento de la edad que se denomina inmunosenescencia y da lugar a problemas de las respuestas a las vacunas, una mayor incidencia de trastornos autoinmunes y el aumento de la morbilidad y la mortalidad de las enfermedades infecciosas [12 - 15]. Inmunosenescencia se ha atribuido a una serie de factores, entre ellos la involución tímica y la memoria de células T en la acumulación resultante de la contracción de células T repertorio. Más recientemente, el debate se ha centrado en el papel de la inmunidad innata celular con respecto al deterioro de la función inmunológica. Remarque et al. han informado de que las personas de edad avanzada con bajos NK números tienen un período de tres veces mayor riesgo de mortalidad en los primeros dos años de seguimiento en comparación con aquellos con alto células NK [16]. Funcionales estudios han medido la actividad de células NK contra el K562 línea celular tumoral y problemas de demostrar la citotoxicidad de células NK en donantes de edad avanzada [17]. Otra prueba se obtiene a partir de estudios sobre personas centenarias, considerado como un ejemplo modelo de un envejecimiento saludable, que se ha informado a tener bien conservado citotoxicidad de células NK [18]. Nuestros datos muestran que el número de células NK son relativamente estables a la edad avanzada, pero como el total de linfocitos de sangre periférica disminuye contar hay un pequeño aumento en la proporción de los ocupados compartimento linfoide de las células NK.

Nuestros resultados demuestran que el número de CD56 brillante células NK disminuye con la edad avanzada que pueden tener una repercusión importante en función de la célula NK en la cohorte de edad avanzada. Esta disminución fue evidente en todos los tres grupos de edad, indicando una disminución gradual con un envejecimiento saludable. El CD56 dim subconjunto de células NK se mantiene relativamente constante, pero ocupa una mayor porción de la sangre periférica linfoide piscina a la edad avanzada. Nuestros resultados están en consonancia con Krishnaraj (1997) informa también que una reducción significativa en la proporción de células CD56 brillante con relativa de los ahorradores de CD56 dim subconjunto [19]. Esto contrasta con Borrego et al. (1999) que informa de un aumento en la proporción en las células CD56 dim pero pocos cambios en CD56 brillante células NK [20]. Las diferencias en la metodología empleada en estos estudios es probable que cuenta para la variación de los resultados.

NK citotóxica de células asociadas función se piensa que es mediado principalmente a través de la CD56 dim subconjunto de células NK que el CD56 brillante células NK puede ser pensado principalmente como un subconjunto de citocinas que producen. La tenue de células CD56 es más citotóxico que el CD56 brillante subconjunto de células NK [21] y el aspecto morfológico de células CD56 dim muestra una mayor granularidad [1]. Un importante cuerpo de datos que indica la brillante subpoblación CD56 desempeña un papel fundamental en la pronta respuesta inmune innata. CD56 brillante células NK tienen una mayor capacidad proliferativa que CD56 dim células NK [22] y son también la principal fuente de células NK-incluidos los derivados de citoquinas TNF-α, IFN-γ, IL-10, IL-13, y GM-CSF [11]. NK cultivo celular con lipopolisacárido de macrófagos activados, proporcionando una fuente endógena monokine, dio lugar a una superior a 6 veces el IFN-y CD56 producción de las células NK brillante en comparación con CD56 dim células NK [11].

La importancia de las células NK en el cebado de la inmunidad adaptativa es cada vez más clara en los últimos años y CD56 brillante células NK desempeñan un papel importante en la activación de células dendríticas [23]. Un reciente estudio encontró que el lipopolisacárido cultivadas con células dendríticas inmaduras inducida por la proliferación de sangre periférica de células NK CD56 Restringido a brillantes subconjunto de células NK que también fue la principal fuente de IFN-γ asociados a la interacción de células dendríticas [24]. CD56 brillante células NK también interactuar con los monocitos en un recíproco moda promoviendo así la inflamación [25].

Expresión CD56 también determina la ubicación anatómica de los principales subconjuntos de células NK. CD56 brillante células NK son el principal subconjunto de células NK en tejido linfoide y lesiones inflamatorias y exhibir la expresión diferencial de una serie de receptores de quimioquinas y moléculas de adhesión incluidos CD62L, CCR7 y CXCR3 [24]. El CD56 brillante subconjunto de células NK expresa constitutivamente alta afinidad IL-2R y produce IFN-γ en respuesta a picomolar dosis de IL-2 de células T a través de las interacciones dentro de los órganos linfoides secundarios [11].

Estas observaciones sugieren que una reducción de CD56 brillante células NK pueden contribuir al deterioro en la inmunidad hacia el extranjero ha tropezado recientemente patógenos que se asocia con el envejecimiento. El papel de las células NK en el inicio de T adaptable y respuestas de células B [26] pueden ser especialmente afectada en las personas de edad avanzada debido al menor número de distribuir el CD56 brillante células NK.

Conclusión

Hemos demostrado que el número de CD56 brillante células NK en sangre periférica disminuye con la edad. Como esta población desempeña un papel fundamental en la respuesta de citoquinas del sistema inmune innato estos hallazgos sugieren que una disminución de CD56 brillante número de células NK pueden contribuir al desarrollo de la inmunosenescencia.

Métodos
Temas

67 donantes mayores de 60 años se puso en contacto a través de la «Mil de Mayores, Centro de Gerontología Aplicada, Selly Oak Hospital. Sangre periférica fue adquirido a través de venopunción en los siguientes tubos vacutainer (BD Vacutainer), heparina sódica, EDTA, activador y Clot (sílice revestidos, BD Haemoguard). El consentimiento informado se obtuvo de todos los donantes en virtud del Sur Birmingham comité de ética de protocolo. De sangre periférica de un nuevo 48 personas fueron adquiridas de la Servicio Nacional de Sangre, servicios de transfusión sanguínea, Birmingham. Estas muestras fueron anónimas, de tal manera que sólo el sexo y rango de edad entre 5-10 años fue suministrada. Estas muestras se mantuvieron en tubos de EDTA (BD Vacutainer) y recogidos en la misma fecha de la recogida de sangre periférica. Todas las muestras de sangre se presentaron a la Reina Elizabeth Hospital Hematología laboratorio para hemograma completo análisis en la misma fecha de recogida (en tubos de EDTA).

El aislamiento de células sanguíneas mononucleares periféricas

El aislamiento de células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) de heparinized muestras de sangre se logró a través de Ficoll-asistida (Lymphoprep, Eje Escudo Reino Unido) gradiente de densidad de centrifugación. Célula de lavado se llevó a cabo dos veces utilizando los medios de comunicación RMPI (RPMI 1640, GibcoBRL). Las células fueron posteriormente resuspendido en 1 ml de congelar los medios de comunicación (10% DMSO, el 90% de calor activado FCS). Alícuotas de las células han sido congelados en 1 ml cryotubes en concentraciones de alrededor de 1-10 × 10 6 células / ml. Cryotubes fueron colocados en un Nalgene Cryo congelación de contenedores y se almacena en forma inmediata a -80 ° C. El aislamiento y la congelación de la PMBC se llevó a cabo el mismo día de la recogida de sangre. Aislamiento de PBMC utiliza para el trabajo funcional sin embargo se resuspendido en medios de cultivo RPMI.

La tinción con anticuerpos monoclonales y análisis FACS

Congelado células fueron descongelados en waterbaths no más de 1 min y posteriormente lavados dos veces en MACS buffer. Las células fueron incubadas a 4 ° C durante 25 minutos con CD3-PC5 (cito-Stat Coulter Clon), CD56-PE (Dako Cytomation), CD16-FITC (Dako Cytomation). Las poblaciones de células se analizaron utilizando Win MDI 2,8. tras la recogida de datos utilizando un Coulter XL citómetro de flujo.

El análisis estadístico

Las estadísticas se calcularon utilizando el gráfico Pad Prism4 software. El Mann-Whitney U test fue empleado para encontrar entre los grupos diferencias. Dos de cola p valores estaban empleados, donde un resultado importante estuvo representada por p = 0,05 o menos.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autores de las contribuciones

SMC participó en el diseño, adquisición, el análisis y la interpretación de los datos y también redactó el manuscrito. NK participó en el diseño del estudio, la interpretación de los datos y la revisión del manuscrito. YLTC contribuido al diseño del estudio y la interpretación de los experimentos. LN estuvo involucrado en el reclutamiento de donantes de edad avanzada para el estudio. PAHM concibe el estudio, y participó en la interpretación de los datos y revisiones del manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Todos los voluntarios de las Mil grupo de ancianos en el Departamento de Gerontología Aplicada y el Cancer Research UK en Birmingham son muy apreciados por sus donaciones de sangre.