Apolipoproteína E disminuye quinasas y tau-tau fosfato en los niveles primarios de neuronas

La enfermedad de Alzheimer (EA) neuropathologically se define por la presencia de dos tipos de agregados de proteínas: las placas seniles extracelulares, que se componen de la A péptido β, y intraneuronal neurofibrillary ovillos (NFT), que están compuestos fosforilados de las formas de la proteína tau [1 -- 3]. Tau es un microtúbulos de proteínas asociadas con múltiples sitios de fosforilación [4]; tau hyperphosphorylation de AD en el cerebro puede ser promovida por varias quinasas, incluidos GSK 3 β, CDK5, y Mark [5]. Mucho AD relacionados con la investigación se centra en determinar los factores que afectan a estas lesiones neuropatológicos y el riesgo de AD. Un factor genético que se ha identificado es el genotipo APOE [6]. El alelo APOE e4 se asocia con un aumento de la deposición de β en el cerebro [7 - 9]; pruebas sobre si el genotipo APOE afecta también a la acumulación de ovillos neurofibrillary es más compleja [10].

La apoE proteína se asocia a las lipoproteínas de alta densidad en el SNC [11], y se incrementa después de varios tipos de daño cerebral [12, 13]. ApoE-lipoproteínas de obligar a los miembros de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) receptor de la familia [14], los receptores con el complejo ligando vinculante dominios que permiten la interacción con un gran número de ligandos. Estos receptores median la absorción de apoE-lipoproteínas que contienen, lo que sugiere que apoE receptores podría ser importante en la remoción de lípidos después de los daños [15]. Pero la estimulación de los receptores de estos ligandos también medie diversos mecanismos de señalización neuronal. Encuadernación de Reelin receptor de LDL a los miembros de la familia promueve la fosforilación de las proteínas citoplasmáticas con discapacidad (Dab1) [16], e induce la activación de PKB Src y quinasas [17, 18]. Estos procesos son necesarios para la correcta migración neuronal durante el desarrollo. Por otra parte, Reelin inhibe la fosforilación de GSK 3 β, pero no afecta a la actividad de CDK5 [19]. Hemos encontrado que apoE unión a estos receptores Limanda también promueve y estimula la fosforilación intracelular de activación de PKB y Src quinasa [20]; se desconoce si apoE también afecta a la activación de cinasas tau, y esta cuestión fue la base para el presente estudio. ApoE induce neurite resultado microtúbulos y la estabilidad [21, 22], y varios estudios han sugerido que apoE o fragmentos apoE puede acceder a la citoplásmica compartimiento de las células y directamente se unen a tau [23] o inducir NTF-como inclusiones [24]. Dado que afecta a apoE quinasas intracelulares a través de su unión a los receptores, se examinaron los efectos de la apoE señalización en la activación de cinasas tau y la fosforilación de tau in vitro, utilizando de larga duración apoE, apoE o un péptido derivado de los receptores de la región vinculante de apoE. Nuestros resultados en la enseñanza primaria muestran que las neuronas apoE tratamiento tau inhibe quinasas (por ejemplo, P35, P-GSK3 β, y CDK5) y tau fosforilación. Estos datos sugieren que podría alterar apoE fosforilación de tau y, por tanto, potencialmente afectar a la acumulación de NFT en la AD cerebro.

ApoE2 humana recombinante, E3 y E4 se compraron de Oxford de Investigación Biomédica. El péptido apoE (EP; secuencia LRKLRKRLLLRKLRKRLL) fue sintetizado por la Universidad Johns Hopkins de Medicina (biosíntesis y la secuencia instalación, Baltimore, MD). Este péptido, que contenía un tándem de repetir el dominio del receptor vinculante de apoE, tiene las mismas propiedades de señalización de larga duración como apoE [20]. Poly-D-lisina (P-7280) y el inhibidor de la fosfatasa cócteles (P-2850 y P-5726) fueron adquiridos de Sigma (St Louis, MO). CytoTox-ONE ™ Membrana homogénea Integridad de ensayo (G7891) fue adquirido de Promega (Madison, WI).

Los anticuerpos contra el fosfato GSK-3 β (pY216, diluido 1:1000) y el total de GSK-3 β se BD Transducción de los laboratorios. Mouse anticuerpos monoclonales contra la P35 (diluida 1:1000), CDK5 (1:1000) y β-actina (1:1000) fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología y BD Pharmingen. Para examinar la fosforilación de tau, los siguientes anticuerpos fueron utilizados: anticuerpo monoclonal de ratón 5E2 (Upstate Biotechnology, diluido 1:1000), que reconoce una fosforilación de tau epítopo independiente y se utiliza para medir el total de tau; anti Tau-1 (Chemicon Internacional , Diluido 1:1000), que reconoce un epítopo unphosphorylated tau; pS396 (Biosource International, diluido 1:1000), AT8 (Innogenetics, diluido 1:1000) y AT270 (Innogenetics, diluido 1:1000), que reconocen epitopos fosforilados tau .

Primaria de embriones de ratón de neuronas corticales culturas fueron elaborados a partir de embriones día 16 Suiza-Webster ratones tal como está descrita anteriormente [25]. Brevemente, los embriones de ratón E16 cerebral cortices fueron picados y trypsinized durante 10 min a 37 ° C. Después de trypsinization, 0,4 μ g / ml de inhibidor de tripsina, DNasa 0,025% y 12 mM MgSO ₄ se han añadido y se mezcla hasta que el tejido fue completamente homogeneizada. Las células fueron entonces transferidos a Neurobasal medio que contiene suplemento B27 sérica (Invitrogen), 1 mM glutamina, gentamicina y citosina-β-D-arabinofuranoside (Ara-C, 5 μ g / ml) (Sigma). Las neuronas fueron sembradas en 50 μ g / ml de poli-D-lisina y recubierto 12 placas de cultivo de tejidos en una densidad de 2 × 10 ⁶ por pozo. La toxicidad fue supervisado por la liberación LDH utilizando el CytoTox-ONE ™ de ensayo. Para medir los efectos de la apoE en proteínas tau, las células neuronales primarias fueron tratados con buffer o apoE péptido para 2 o 12 horas. Para la extracción de células en RIPA buffer, las neuronas se lavaron con helado de PBS que contenía 10 mM NaF, helado RIPA buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,2, 150 mM NaCl, 1% Tritón X-100, 1% deoxycholate , 5 mM EDTA, inhibidor de la proteasa y fosfatasa inhibidor de cócteles) se añadió, a continuación, las células fueron centrifugadas a 10000 rpm durante 5 min y el sobrenadante se recogió. Para la extracción de células en SDS de amortiguación, el precipitado después de centrifugación se incubó con EDS muestra de amortiguación (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 25% glicerol, 0,01% Azul de bromofenol) (Bio-Rad), incluyendo 30 para DNasa min a 37 ° C. Además, las células fueron extraídas directamente con EDS muestra de amortiguación entre ellos DNasa y se incubarán durante 30 minutos a 37 ° C. Fosforilación de tau tau total y los niveles fueron medidos en el extracto de amortiguación SDS, RIPA buffer extracto, o en el SDS de amortiguación siguiente extracto RIPA buffer de extracción.

Las proteínas de la célula extractos fueron separados del servicio en virtud de desnaturalización y la reducción de las condiciones de Tris-glicina electroforesis en gel de poliacrilamida. Separado proteínas se transfirieron a membranas PVDF a 170 mA por 2 horas y bloqueado con un 5% nonfat seca la leche o el 4% de BSA. Los blots fueron incubadas con anticuerpos a temperatura ambiente durante 1 hora. Peroxidasa de rábano conjugada con anticuerpo secundario fue visualizado por ECL sistema de detección y expuestos a la película. Las películas fueron digitalizadas mediante un densitómetro ScanMaker 9800XL (Microtek), y los niveles relativos de las bandas en una película se compararon mediante Jandel software SigmaStat.

Los experimentos se repitieron un mínimo de cuatro veces menos que se indique lo contrario. Todos los datos se analizaron mediante ANOVA con Graphpad Prism 4 de software, utilizando Tukey la prueba de comparación múltiple de post-hoc de análisis con significado determinado como P <0,05. Estadística descriptiva se calcularon con Statview 4,1 y se muestra como una media ± expresó SEM

Desde apoE alterado la activación de cinasas incluidas JNK, AKT y ERK1 / 2 en las neuronas primarias [20], hemos probado si apoE tratamientos alterado también la activación de varias quinasas potencialmente relacionadas con la fosforilación de tau. Se han tratado las neuronas con 2 uM apoE péptido por 2 horas, un tratamiento que el aumento de AKT y la activación de ERK y la disminución de la activación JNK [20]. Este tratamiento disminución de los niveles de P35, CDK5 y la forma de fosforilados GSK 3 β (Fig. 1, panel izquierdo), sin cambios significativos en los niveles del total de GSK 3 β o β-actina se observaron. No se observó producción de P25, la activa exfoliados fragmento de P35, bajo ninguna condición. La cuantificación de estos blots puesto de manifiesto importantes de tres a cuatro veces la disminución en el total de P35, el total de fosfato y CDK5 GSK 3-β (fig. 1B, panel izquierdo). También examinó si las concentraciones de apoE que normalmente se encuentran en LCR (aproximadamente 100 nm [26]] alterado los niveles de estas quinasas después de 12 horas. Esta dosis no afecta a AKT, ERK, JNK y activación in vitro [20]. Del mismo modo, apoE péptido a 100 nm durante 12 horas no se alteró los niveles de fosfato GSK-3 β, P35 y CDK5 (Fig. 1a, b, paneles de la derecha). Por lo tanto, esta apoE péptido induce reducciones en diversas quinasas tau, pero sólo en concentraciones por encima de los niveles endógenos apoE.

Hemos probado si purificado apoE isoformas tau también inhibe quinasas. La exposición de neuronas cultivadas a 2 μ M apoE2 o E4 disminución de los niveles de fosforilados GSK 3 β y P35 (Fig. 2A]. No hay cambios significativos en β-actina se observó después del tratamiento con apoE isoformas (Figura 2A]. Hemos cuantificado los cambios en fosfato GSK 3 β y P35; disminuciones en la activación de GSK 3 β (en un 80% y 36% para apoE2 y E4, respectivamente) fueron observados para los dos isoformas de apoE (Figura 2B]. ApoE2 y apoE4 también causó una disminución significativa en P35 (de 96% y 79%, respectivamente; Fig. 2B]. También examinó si apoE2 o apoE4 podría afectar a estas quinasas en concentraciones consistentes con los observados en LCR (100 nm). Se han tratado las neuronas con 100 nM apoE péptido de 12 horas, y encontró que estos tratamientos no cambiar los niveles de fosfato GSK-3 β (Fig. 2C, D]. Sin embargo, el tratamiento de células con 100 nM apoE2 disminuido ligeramente los niveles de P35, un 23% (Fig. 2C, D], aunque apoE4 no tiene efectos significativos. No hay cambios significativos en β-actina se observaron.

Hemos probado si apoE tratamientos que disminuyeron fosfato GSK-3 β, P35, CDK5 y también disminuyó phosphorylations tau. Se han tratado las neuronas durante dos horas con 2 uM apoE péptido, y obtuvieron las proteínas en las células RIPA buffer. Los niveles de unphosphorylated tau, medida por el Tau-1 anticuerpo, estaban significativamente aumentados por el péptido apoE (Fig. 3A]. Hemos borrado lisados con el anti-fosfato-tau anticuerpos AT8, que reconoce los residuos fosforilados de Ser202/Thr205 a la proteína tau. ApoE péptido tratamiento redujo significativamente los niveles de este fosforilados forma de tau (Fig. 3A]. Del mismo modo, anti-fosfato-tau anticuerpos AT270 y PS396, que reconocen la fosforilados de residuos Thr171 y Ser396 en la proteína tau, respectivamente, mostraron también redujo significativamente los niveles de péptido apoE células tratadas en comparación con las células tratadas con amortiguación por sí sola (datos no presentados, y la Figura 5]. La cuantificación de estos blots reveló que la apoE péptido induce un 115% de aumento en los niveles de unphosphorylated tau y un 70-90% de disminución en el fosfato de proteínas tau (Fig. 3E].

Sorprendentemente, encontramos que los niveles de tau total fueron también significativamente alterada por los tratamientos con apoE en este péptido corto (2 horas). Immunoblots con el anticuerpo 5E2 (tau que se reconoce, independientemente de su estado de fosforilación), ha demostrado que los niveles de tau en extractos de células se redujo en un 69% (Figura 3A]. Nos preocupa el hecho de que todos los tau especies fueron extraídas de manera eficiente en el RIPA buffer utilizado, habida cuenta de que tau está asociada a microtúbulos y, por tanto, podría seguir siendo asociados con los desechos de células después de la extracción. Por lo tanto, repitió los experimentos, la extracción de las células en RIPA buffer, y luego extraer las fracciones insoluble en el SDS de amortiguación (después del tratamiento con DNasa para disminuir la viscosidad de los extractos). En estas condiciones, no observar disminución significativa del total de tau PE después de tratamiento (Figura 3F], lo que sugiere que apoE afectados la proporción del total de tau solubilized RIPA, apoE y no disminuir el total de los niveles de tau. Como otra prueba de esta hipótesis, que también extrajeron las células directamente en la solución tampón que contiene más fuerte SDS. Se encontró que el nivel total de tau no se observó disminución, pero parece que aumentó después de apoE péptido tratamiento (Figura 3G]. También se encontró que el nivel de unphosphorylated tau (Tau-1) fue aún mayor y el nivel de fosfato-tau (AT8) se redujo aún (Figura 3G] en el SDS de tampón de extracción. De este modo, la apoE péptido tratamiento causado tanto un cambio en el estado de fosforilación de tau, así como un cambio en la distribución de la proteína tau que modifique en consecuencia su extracción en diferentes buffers.

Hemos probado si se produjeron cambios similares después del tratamiento con células de cada uno de los de larga duración apoE isoformas. Cada una de las tres isoformas de apoE causado una disminución en los niveles de fosforilados tau (Fig. 3 B, C, D]. No hay cambios significativos en β-actina se observaron. Curiosamente, la cuantificación de estos blots apoE4 reveló que había el menor efecto de las tres isoformas de tau estado de fosforilación: ligeramente mayores niveles de unphosphorylated tau (21%) y disminución de fosfato proteínas tau (35%).

También examinó si la dosis más baja de la apoE (100 nM) inhibe la fosforilación tau. Hemos encontrado que el tratamiento de células con 100 nM apoE2 (Fig 4A, panel izquierdo) o 100 nm apoE4 (Fig 4A, panel derecho) no se alteró los niveles de fosforilación de tau en comparación con el control (Fig 4A] después de 12 horas tratamientos. No hay cambios significativos en β-actina se observaron. La cuantificación de estos blots no reveló cambios significativos en AT270, AT8 y PS396 (fig. 4B]. Hemos probado si la dosis más baja de PE tenido un efecto tras el período más corto de tiempo utilizado en las Figuras 1-3 para la dosis más alta de EP. Hemos observado ningún cambio en los niveles de quinasas, fosfato GSK-3 β o CDK5 (Figura 4C]. También se observó ninguna diferencia en los niveles de fosfato-tau, medida por el AT8 o anticuerpos AT270 (Figura 4C]. De este modo, los efectos de la apoE en tau quinasas fosforilación de tau y sólo se produjo después de los tratamientos con altos niveles de apoE o apoE péptido.

Con el fin de comprobar si los cambios observados a la fosforilación de tau primaria neuronas se mediada por los miembros de la familia del receptor de LDL o algunas efecto directo de apoE, previamente tratados con células PAR, un inhibidor de estos receptores. RAP causa de una prolongada redistribución de los receptores de apoE dendríticas para compartimentos somáticos, potencialmente prevenir la señalización de los tratamientos posteriores con ligandos [25]. RAP tratamiento por sí solo no afecta los niveles de fosfato tau epítopos (Fig. 5A, B]. Tratamiento de las neuronas con la apoE péptido causado la disminución significativa de fosfato TAUS (Thr 171, Ser202/Thr205), pero estos descensos fueron inhibidas por pretratamiento de las células con el PAR (Fig. 5A, B, primera fila). El inhibidor de quinasa Src PP2 y la quinasa ERK inhibidor PD98059 no bloquear la disminución de la fosforilación de tau apoE péptido (Fig. 5A, segunda y tercera fila). No hay cambios significativos en β-actina se observaron. Estos datos sugieren que la disminución en la fosforilación de tau necesaria la unión de apoE péptido del receptor de LDL a los miembros de la familia, pero no implican ERK o cascadas de quinasa Src.

Hemos investigado cómo afecta a la señalización apoE tau actividad quinasa y la fosforilación de tau primaria neuronas. En primaria las neuronas, el tratamiento de células con 2 uM apoE (pero no 100 nm) inhibió la fosforilación de GSK 3 β, y la disminución de los niveles de P35 y CDK5 (Fig. 1]. ApoE también disminuyó los niveles de fosforilados tau y el aumento de los niveles de unphosphorylated tau (Fig. 3]. Estos tratamientos también pueden haber alterado la distribución de tau en las neuronas, dado que el aumento de los niveles de tau (pero disminuyeron los niveles de fosforilados tau) se recuperaron fácilmente solubilized en fracciones de células (Fig. 3]. Estos efectos son mediados por los miembros de la familia del receptor de LDL, ya que sus efectos fueron bloqueados por los inhibidores de PAR (Fig. 5].

Aunque apoE receptores fueron inicialmente pensado para funcionar a endocytose ligandos, varias otras funciones de carácter vinculante ligando ya se han descrito. ApoE receptores transduce señales importantes para la migración neuronal durante el desarrollo [27]. Ligando la interacción con los receptores de apoE resultado en cambios transitorios en Src, ERK y JNK fosforilación [20, 28]. ApoER2 la interacción con los receptores NMDA están moduladas por ligando vinculante [29]. En neuroglia, apoE receptores mediar efectos antiinflamatorios de apoE [30]. Por último, en varios tipos de células, ligando apoE vinculante para los receptores de la superficie aumenta la división de los receptores [31]. Ligandos para esta familia de receptores difieren en cierta medida en que sean libremente en condiciones de ser endocytosed (como apoE), o si se adjuntan a otras células o para la matriz extracelular (por ejemplo, reelin). Será interesante para determinar si hay diferencias en los efectos de señalización de ligandos en función de si su metabolismo depende de la endocitosis de los receptores de apoE.

Estos resultados complementan los estudios de ratones knock-out modelos. Brains de APOE knock-out ratones han aumentado los niveles de fosforilación de tau en comparación con el de tipo salvaje controles [32, 33]. Del mismo modo, los cerebros de los ratones Reeler, ApoER2-/-/VLDLr-/- ratones, y Limanda-1 knock-out ratones han hyperphosphorylated tau [34]. Por lo tanto, la interrupción crónica de la vía de señalización apoE conduce a un aumento de fosforilación de tau en el cerebro. Tratamiento agudo de neuronas con reelin causado disminución de GSK-3 β activación [16], y nos informe que el tratamiento con apoE causado también disminuyó GSK-3 β de activación así como la reducción de fosforilación de tau. Por lo tanto los efectos agudos de apoE y reelin son similares entre sí, y en consonancia con los efectos de la falta crónica de apoE y reelin in vivo.

El hecho de que afecta a la apoE fosforilación de los microtúbulos de proteína tau asociada es de apoyo de una función de apoE en la promoción de neurite resultado [25, 35, 36]. Los niveles de ApoE son inducidos después de varios tipos de daño cerebral [12, 13], presumiblemente como un mecanismo para la liquidación de las membranas dañadas [37]. Sin embargo, esta apoE también podría actuar como una señal para las neuronas para estabilizar nuevo neurites como un mecanismo para la regeneración después de los daños [38]. ApoE puede alterar la estabilidad de los microtúbulos de alterar y tau-tau fosfato niveles, lo que permite permanente a los cambios del citoesqueleto neuronal que es necesario acompañar neurite resultado.

En la AD cerebro, el genotipo APOE afecta a los niveles de A β deposición [7, 8], y apoE es un componente de la mayoría de placas [39, 40]. De hecho, debido a su fuerte afinidad por un β, apoE se ha denominado un chaperón patológicos [41]. La presencia de la apoE receptor vinculante dominio depósitos de amiloide en [40] sugiere que apoE en placas crónica podría ofrecer señales a través de los receptores de apoE a las neuronas en las cercanías de placas. Estas señales podrían incluir el aumento de la fosforilación de sustratos de cinasas ERK como Src y [20] o disminución de la fosforilación de sustratos de quinasas tales como JNK [20], GSK 3 β y CDK5 (Fig 1]. Desde quinasas en ambos grupos se han vinculado al aumento de fosforilación de tau (por ejemplo, ERK [42] y GSK-3 β [43]], apoE presencia en placas podría contribuir a la formación y la inhibición de fosfato-tau-positivas distróficos neurites encontrado alrededor de neuritic placas. Anteriormente se han encontrado diferentes puntos fuertes de los efectos de señalización para la apoE isoformas. ApoE2 tuvo el mayor efecto sobre la activación de ERK y JNK inhibición [20] y el apoE4 menos, un patrón similar se observó para las diferentes isoformas de apoE sobre los receptores de división [31]. En este estudio, apoE2 disminución de los niveles de fosfato GSK-3 β y CDK5 más de apoE4 (Figura 2]. Si los efectos agudos de apoE en las neuronas se aplica a más de exposición crónica, apoE2 en placas se espera que inhiben fosfato tau niveles de la mayoría, apoE4 y se espera que tengan el menor efecto. Varios estudios han indicado que los niveles más altos de fosfato en tau AD cerebro están asociados con apoE4 que con apoE3 o apoE2 [42], la correlación con la in vitro efectos de estas isoformas en GSK-3 β y CDK5 inhibición (y no con sus efectos sobre Activación de ERK).

Los modelos animales también han implicado la interrupción en apoE de citoesqueleto neuronal. Neuronal expresión de apoE4 se asocia con prominentes axonopathy [44] y el aumento de fosforilación de tau [42, 45]. Estos procesos pueden implicar intraneuronal proteólisis de apoE [45]. Expresión de APOE es gliales en la mayoría de condiciones, pero los estudios de la APOE promotor demostrar que en algunas ácido kainico tratamiento condición [46], APOE puede expresarse en las neuronas. Bajo algunas condiciones, apoE pueden estar presentes en el citoplasma neuronal [21], donde más efectos directos sobre tau y microtúbulos son posibles. ApoE directamente inhibe la GSK-3 β fosforilación de tau [47] apoE y altera el patrón de fosforilación de tau por GSK-3 β [43]. Estos efectos de la apoE que no dependen de la interacción con los receptores de apoE, como observamos aquí (Figura 5].

En este estudio, informe que apoE pueden disminuir los niveles de quinasas y tau-tau fosfato proteínas extracelulares a través de la interacción con los receptores de apoE. Estos efectos de apoE podría ser importante para la fuerte asociación del gen APOE con riesgo de AD.