Journal of Nanobiotechnology, 2006; 4: 13-13 (más artículos en esta revista)

Formas truncadas de proteínas virales VP2 fundido a reunirse en EGFP fluorescentes parvovirus-como las partículas

BioMed Central
Gilbert Leona (lgilbert7@comcast.net) [1], Jouni Toivola (jopato@cc.jyu.fi) [1], Outi Välilehto (outvali@cc.jyu.fi) [1], Taija Saloniemi (tsalon @ UTU. fi) [1], Claire Cunningham (claire.cunningham @ nuigalway.ie) [1], Daniel Blanco (dan@chalkie.org.uk) [1], Anna R Mäkelä (anrimake@cc.jyu.fi) [1 ], Eila Korhonen (eikorhon@bytl.jyu.fi) [1], Matti Vuento (vuento@bytl.jyu.fi) [1], Christian Oker-Blom (okerblom@cc.jyu.fi) [1]
[1] Departamento de Biología y Ciencias Ambientales y Nanociencia Center, PO Box 35, 40014 Universidad de Jyväskylä, Finlandia

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Resumen

Correlación espectroscopia de fluorescencia (FCS) supervisa los movimientos aleatorios de las moléculas fluorescentes en disolución, dando información sobre el número y el tamaño de, por ejemplo, nano-partículas. El parvovirus canino VP2 proteínas estructurales, así como N-terminal de supresión de mutantes VP2 (-14, -23, -40 y aminoácidos) se fusionaron para el C-terminal del aumento de proteína verde fluorescente (EGFP). Las proteínas se producen en células de insectos, purificado, y se analizaron por Western Blot, confocal y microscopía electrónica, así como FCS. La falta de forma truncada, EGFP-VP2, difundido con un radio hidrodinámico de 17 nm, mientras que los fluorescentes mutantes truncados de 14, 23 y 40 aminoácidos mostró hidrodinámico radios de 7, 20 y 14 nm, respectivamente. Estos resultados muestran que la falta de truncado EGFP-VP2 proteína de fusión y la EGFP-VP2 construye truncado por 23 y por tanto como 40 aminoácidos son capaces de formar virus-al igual que las partículas (VLPs). La VLP fluorescentes, la acogida VP2 truncado por 23 aminoácidos, mostraron un poco más grande hidrodinámico Radio en comparación con los no-truncada EGFP-VP2. En contraste, la construcción que contengan EGFP-VP2 truncado por 14 aminoácidos no fue capaz de reunir en VLP-se asemejan a las estructuras. Formación de estructuras cápside fue confirmada por confocal y microscopía electrónica. El número de fluorescentes proteína de fusión de moléculas presentes en los diferentes VLPs se determinó por FCS. En conclusión, FCS ofrece una novedosa estrategia para analizar el virus de reunión y ofrece valiosa información estructural para el desarrollo estratégico de parvovirus-like particles.

Fondo

Parvovirus canino (CPV) es un organismo autónomo, sin envoltura único hundidos virus ADN con un diámetro de 26 nm. El icosahedral T = 1 virion contiene 60 subunidades de proteínas compuesto de tres diferentes cadenas polipeptídicas designado VP1, VP2 y VP3 [1 - 7]. VP1 es idéntico al VP2, pero tiene 154 adicionales N-terminal de aminoácidos de residuos. La proteína VP3 es proteolytically exfoliados de VP2 de eliminación de alrededor de 12 a 15 aminoácidos de la N-terminal [1, 8]. La proteína VP2 constituye la mayor parte de la cápside VP1 superficie, mientras que sólo representa una pequeña porción de la cápside composición. Se ha demostrado que se puede VP2 en cápside-como las estructuras [9] y que la estructura del CPV capsids vacía la primera había 37 residuos no se resuelve estructuralmente [9]. Estas proteínas estructurales comparten una conservadas β-barril de dominio básico que contiene ocho hundidos, anti-β-paralelo barril motivo que consta de dos hojas-β en la norma y BIDG CHEF acuerdos comunes a muchas proteínas de cápside viral [10]. Este dominio representa un tercio del contenido de aminoácidos de cada polipéptido. Las otras dos terceras partes de la secuencia del polipéptido compuesto de cuatro grandes inserciones bucle que forma la superficie del virion.

Viral estructuras se han caracterizado principalmente por cristalografía de rayos X y microscopía electrónica. Única molécula de técnicas de detección han surgido para la caracterización de macromoléculas en movimiento persistente, no desnaturalización condiciones fisiológicas. Una de esas nuevas método es la espectroscopia de fluorescencia de correlación (FCS) [11 - 14]. FCS caracteriza a las interacciones moleculares y estructuras a través de los procesos dinámicos de moléculas en solución. La información estadística se extrae de la intensidad de fluorescencia promedio de las fluctuaciones de difusión de moléculas fluorescentes a través de un pequeño volumen de medición de menos de un femtoliter [15, 16].

En el presente estudio, 14, 23 y 40 N-terminal de aminoácidos supresiones de la proteína VP2 fueron fusionados con el C-terminal de EGFP. Los correspondientes proteínas se producen en baculovirus infectados Spodoptera frugiperda (S f 9) células de insectos, purificado y luego analizados por el FCS. Los resultados indicaron que la falta de fundido construye suprimido de 14, 23 y 40 aminoácidos, proteínas de fusión y de EGFP-VP2-23 y EGFP-VP2-40, así como la no-forma truncada de VP2 (EGFP-VP2), fueron capaces de formar virus-al igual que las partículas (VLPs), a pesar de la presencia de los voluminosos EGFP dominio. Curiosamente, los mutantes fluorescente (EGFP-VP2-14) suprimida por sólo 14 aminoácidos no fue capaz de formar estructuras similares.

Resultados
Expresión de la CPV VP2 construye en células de insectos

CPV VP2 y la N-terminal del mismo supresiones VP2-14, VP2-23, y VP2-40, así como la correspondiente EGFP fusiones EGFP-VP2, EGFP-VP2-14, EGFP-VP2-23, y EGFP-VP2-40 (Fig. 1] se produjeron en Sf 9 células infectadas con los respectivos baculoviruses Ac recombinante VP2, VP2 Ac-14, Ac VP2-23, Ac VP2-40, EGFP Ac-VP2, EGFP Ac-VP2-14, Ac-EGFP VP2-23, EGFP y Ac-VP2-40. Expresión de proteínas recombinantes todos de lisados celulares fue confirmada por inmunotransferencia utilizando anti-VP2 y anti-GFP anticuerpos y las proteínas de espera tamaños (flechas) se identificaron (Figs. 2A y 2B]. Particularmente en el caso de la fusión EGFP-construcciones, romper algunos productos también podrían ser identificados con ambos anticuerpos (Figs. 2A y 2B]. Para la purificación de proteínas recombinantes, la célula infectada lisados fueron expuestos a la sacarosa gradiente de centrifugación y las fracciones de proteínas recombinantes correspondientes a montarse VLPs cápside o estructuras de tipo [17] fueron analizados por inmunotransferencia utilizando anti-VP2 y anti-GFP anticuerpos ( Figs. 2C y 2D]. Todas las proteínas excepto la EGFP-VP2-14 fusión construir parecía reunir en VLPs o estructuras parecidas (Figs. 2C y 2D].

Virus-como la formación de partículas de formas truncadas de CPV VP2

VLP formación fue analizada por confocal y microscopía electrónica de estudios. La microscopía confocal indicó que VP2 colocalized con su socio de fusión EGFP, pero que la colocalización no era completa (Fig. 3]. El anticuerpo se utiliza aquí un ratón monoclonal anti-cápside de anticuerpos específicos para un epítopo presente sólo en capsids cápside y de contención (A4E3; especie de regalo del doctor Colin Parrish, la Universidad de Cornell, Ithaca, NY). De este modo, el imperfecto co-localización visto por microscopía confocal (Fig. 3] y el desglose de los productos en la transferencia Western-Blots (Fig. 2] es más probable debido a la proteólisis de la EGFP-proteína VP2 construye como se ha visto también en estudios previos [ 18, 19]. A partir de la negativa manchadas EM micrográficas de las proteínas VP2 es evidente, que VP2, VP2-14, VP2-23, VP2-40, así como la fusión construye EGFP-VP2, EGFP-VP2-23 y EGFP-VP2-40 se capaces de formar estructuras parecidas a VLPs (Fig. 4]. Todas las partículas parecen tener un diámetro de aproximadamente 26 nm, que muestra una típica VP2 o de tipo salvaje CPV estructura [18, 19]. Sin embargo, la EGFP-VP2-14 no parece construir a reunirse en estructuras similares (Fig. 4].

Caracterización de las proteínas recombinantes fluorescentes

Las proteínas recombinantes (EGFP-VP2, EGFP-VP2-14, EGFP-VP2-23, EGFP-VP2-40) fueron purificados por gradiente de sacarosa centrifugación antes de un examen más profundo. Un total de 37 fracciones fueron recogidos para cada gradiente y la fluorescencia relativa de cada fracción se representará gráficamente en relación con su fracción número (Fig. 5A]. La señal de fluorescencia visto en esta cifra indica que las fracciones en la parte superior de la pendiente (33-37) contienen una gran cantidad de sin montar proteínas de fusión y / o libre EGFP, mientras que las fracciones 13-20 mostró bandas fluorescentes visibles a simple vista para EGFP-VP2, EGFP-VP2-23 y EGFP-VP2-40 y se consideraban como picos. Una banda correspondiente fluorescentes y pico para EGFP-VP2-14 no se observó, lo que sugiere que esta construcción no forma fluorescente VLPs (fVLPs; Fig. 5A]. Dot-blot con anticuerpo monoclonal anti-cápside de anticuerpos (Fig. 5B] también mostraron patrones de pico en las fracciones 13-20 para EGFP-VP2, EGFP-VP2-23 y EGFP-VP2-40. Una vez más, no se consideraba señal de EGFP-VP2-14, lo que indica la falta de estructuras VLP para construir este. Esta característica de distribución viral recombinante de las proteínas separadas en un gradiente de sacarosa, y luego observada por fluorescencia relativa y dot blot (Fig. 5B], se ha informado anteriormente [20 - 23]. FCS autocorrelación análisis se realizó mediante un modelo de componentes. La difusión del tiempo, siendo el tiempo necesario para una partícula de viajar a través del piso 0,2 láser de volumen, fue cerca de 1 ms para la EGFP-VP2, EGFP-VP2-23 y EGFP-VP2-40 fusiones dando hidrodinámico radios de 14-20 nm (Fig. 6 y Tabla 1]. Por el EGFP-VP2-14 construir, la difusión tiempo fue de aproximadamente 0,3 ms corresponde a una radio hidrodinámico, de 7 nm (Fig. 6]. EGFP difundido con una velocidad calculada de Radio 2 nm (Tabla 1]. Para la comparación de los tiempos de difusión en todas las construcciones, las curvas de autocorrelación normalizada se muestra en la figura 6. Las muestras de todas las construcciones, además de EGFP-VP2-14, que figura VLPs con un tamaño similar a los nativos CPV. Las muestras de EGFP-VP2-14 figuran las partículas más pequeñas, demasiado pequeñas para ser VLPs.

El número de unidades por fluorescentes cápside se midió para cada construcción. Después de la incubación de construcciones EGFP-VP2, EGFP-VP2-23 y EGFP-VP2-40 en 6 M urea durante 15 minutos a 50 ° C, la hidrodinámica radios se redujeron a aproximadamente 10 nm (Tabla 1] debido al desmontaje de las VLPs . A 6 o 10 veces mayor en el número de partículas fluorescentes, se observó, lo que sugiere al menos un 10, 6 y 10 fracciones fluorescentes para EGFP-VP2, EGFP-VP2-23 y EGFP-VP2-4 VLPs, respectivamente (Cuadro 1]. Seguida por la exposición de EGFP-VP2-14 a 6 M urea a 50 ° C, el número de partículas fluorescentes aumentado por un factor de 2. Estas partículas mostró un coeficiente de difusión en consonancia con una de las proteínas globulares alrededor de 85 kDa, correspondiente a un solo EGFP-VP2-14 proteína de fusión (Tabla 1 y Fig. 2B].

Efecto de la proteólisis limitada en la estructura de proteínas fluorescentes

La fusión fluorescentes construcciones, EGFP-VP2, EGFP-VP2-23, EGFP-VP2-40 y la EGFP-VP2-14 se caracterizaron por FCS antes y después el tratamiento con tripsina. La difusión veces antes de la tripsina de tratamiento (Fig. 7A-C] correspondió así al tamaño típico de VLPs (Fig. 6, Tabla 1]. Se ha demostrado anteriormente que la tripsina puede ser utilizado para cleaving lejos la N-terminal de la proteína VP2 [24 - 26]. En presencia de 8,3 × 10 -13 M tripsina (5 min), la difusión veces se reduce a la gama de 0,1 ms. La difusión de veces puestos en libertad partículas son las mismas en comparación con la difusión de tiempo libre EGFP, 0,1 ms (Fig. 6]. Se ha demostrado que EGFP fue completamente liberado de la superficie de la VLP fluorescentes para EGFP-VP2, EGFP-VP2-23 y EGFP-VP2-40 (Figs. 7A-C]. El coeficiente de difusión para EGFP (Tabla 1] está de acuerdo con los reportados previamente [19, 27, 28]. Además, la difusión veces son claramente inferiores a la difusión momento de la fluorescente EGFP-VP2-14 proteína (0,3 ms; Fig. 6, Tabla 1], lo que sugiere que la EGFP-VP2-14 proteínas son más grandes que EGFP libre. En conjunto, estos resultados sugieren que EGFP fue expuesto en la superficie de los fluorescentes y VLPs que EGFP fue puesto en libertad por proteólisis en la presencia de 8,3 × 10 -13 M tripsina (Fig. 7].

Discusión

Virus-como partículas, VLPs, multímeros son estructuras que son morfológicamente y estructuralmente muy similares a sus homólogos virales. Debido a su seguridad, estos tipos de reactivos o partículas han sido explotados por ejemplo, para la detección de anticuerpos, como las vacunas y antígenos y últimamente también como vectores de genes [23, 29 - 32]. Diversas manipulaciones de parvoviral proteínas estructurales con el fin de comprender por ejemplo, estructura o función a las relaciones molecular / celular niveles se han llevado a cabo. Estos incluyen las supresiones de [33] y epítopo inserciones en los bucles de la virion [34], N-terminal de fusión de los antígenos extraños a VP1 [35, 36], N-terminal de inserción y fusión [17, 19, 37] o tachaduras de VP2 [33, 38], y C-terminal de fusiones a VP2 [34, 37, 39].

En este sentido, N-terminal de supresiones de la proteína VP2 CPV fundido a EGFP es decir, EGFP-VP2-14, EGFP-VP2-23 y EGFP-VP2-40 fueron producidos en células de insectos utilizando el vector de expresión baculovirus sistema (Figs. 1, 2, 3] con el fin de estudiar cápside asamblea con FCS. Los resultados indicaron que todas las construcciones fueron capaces de formar cápside de contención (Figs. 3, 4, 5, 6, 7, 8, Tabla 1], con tamaños muy similares a las de tipo salvaje CPV [22, 33, 40], salvo para la EGFP-VP2-14 construir. Esto fue confirmado por microscopía electrónica (Fig. 4].

Los datos obtenidos de los estudios de microscopía electrónica (Fig. 4] y las mediciones FCS (Figs. 6, 7) correspondió bien con VLPs globulares se asemejan a pequeños esféricos viriones en el rango de 25-50 nm de diámetro. Al comparar todas las construcciones, un pequeño, pero reproducible desviación en el tamaño y el número de las proteínas de fusión fluorescentes presentes en el fluorescente VLPs fue detectado por FCS (Tabla 1]. Cuando EGFP-VP2 VLPs fueron analizados, la radio hidrodinámico fue de aproximadamente 17 nm y la cantidad aproximada de fluorescentes por fracciones de partículas fue de 10. La hidrodinámica de Radio EGFP solo fue de 2 nm (Tabla 1]. Supresión de los primeros 14 aminoácidos de la N-terminal de VP2 (EGFP-VP2-14) se debieron a un cambio drástico de la hidrodinámica de Radio 17 nm a 7 nm con la presencia de sólo 2 fluorescentes fracciones sugiriendo que EGFP-VP2 - 14 carece de la capacidad de montaje adecuado. Esto es interesante, ya que las otras dos supresiones, es decir, EGFP-VP2-23 y EGFP-VP2-40, son similares en tamaño en comparación con la EGFP-VP2 partículas que contienen la codificación completa VP2 secuencia (Tabla 1]. El EGFP-VP2-23 construir, sin embargo, fue ligeramente más grande que EGFP-VP2, con una hidrodinámica radio de 20 nm con alrededor de la mitad (seis) la cantidad de partículas fluorescentes presentes en la cápside. Sin embargo, la hidrodinámica de Radio EGFP-VP2-40 fue algo menor (14 nm) que el de la EGFP-VP2 (17 nm) (Tabla 1]. Además, EGFP-VP2-40 fue similar en tamaño a los nativos CPV [2, 4, 41].

Anteriores trabajos de Hurtado y compañeros de trabajo sugirió que el N-terminal de supresiones de más de 14 aminoácidos impide cápside formación, lo que indica que los residuos más allá de este punto son esenciales para la formación de cápside [33]. Además de su supresión, una inserción de dos aminoácidos (L y K; leucina y lisina básicos, respectivamente) antes de la proteína truncada VP2 se añadió. Estos dos aminoácidos inserciones podría haber tenido una influencia sobre la estructura de la proteína viral con el fin de permitir la formación de cápside. En este estudio, las supresiones de 14 aminoácidos de la N-terminal de la región VP2 proteínas sin ningún tipo de inserciones de aminoácidos, pero con una fusión de EGFP parecía no forma VLPs. Sin embargo, la fusión de EGFP truncado a las formas de VP2 (-23 y -40) se forma VLPs. Además, VP2-14, VP2-23 y VP2-40 N-terminal de supresiones podría facilitar todos los cápside asamblea. Del mismo modo, se ha demostrado que la mayor parte de la N-terminal de parvovirus humano B19 VP2, hasta 25 aminoácidos, entre ellos el polyglycine región, podrían eliminarse sin afectar a la libre cápside asamblea, pero truncations más allá de 30 aminoácidos son incompatibles, ya sea para la libre reunión o asamblea co-VP2 normales [38]. Estos datos apoyan la afirmación de que los aminoácidos de los residuos 14 (A14) para el residuo 23 (S23), de VP2 son importantes para la formación de VLP, pero que truncations de la proteína VP2 CPV puede tolerar incluso supresiones de hasta 40 aminoácidos.

Por otra parte, en nuestro estudio un promedio de 10 fluorescentes proteína de fusión de unidades en el EGFP-VP2 y EGFP-VP2-40 VLPs, y 6 en la EGFP-VP2-23 VLPs muestra similitudes con los estudios se informó anteriormente para el número de copias de la proteína VP1 nativos dentro de CPV capsids [33]. Molecular modelos construidos en este trabajo y estructurales existentes datos apoyan la hipótesis de que sólo un polipéptido puedan surgir de cada cinco veces el eje de la cápside dar un máximo de 12 EGFP-VP2 proteína de fusión por subunidades cápside (Fig. 8]. Debido al hecho de que los primeros 37 aminoácidos de CPV VP2 no son estructuralmente resueltas, es difícil especular sobre la razón por la supresión de los primeros 14 residuos de VP2 resultados en una estructura incapaz de forma VLPs cuando fundido a EGFP. Sin embargo, es razonable sugerir que esta zona del péptido (14, A-alanina) es importante en CPV VLP asamblea. Fusiones en el N-terminal de VP2 pueden desempeñar un papel esencial para este tipo quimérico VLPs ser capaz de mostrar proteínas extrañas de su icosahedral 5 veces eje. Esto se ha observado antes, cuando sólo dos aminoácidos se atribuye a una suprimido CPV VP2 polipéptido de 14 aminoácidos [33]. Junto esto sugiere la posibilidad de sustitución de los primeros 40 aminoácidos que se utilizarán para el diseño de nuevos vectores para mostrar diversos fines, por ejemplo para la selección de objetivos específicos para tipos de células, sin interferir con el régimen natural de montaje o cápside morfología.

Meyer-Almes y compañeros de trabajo hace muy poco han demostrado que la enzima muy baja concentración de moléculas objetivo en FCS puede ser utilizado [42]. El FCS resultados presentados aquí (Fig. 7] muestran que solo fluorescente VLPs se observó en concentraciones de 2 × 10 -9 M. En presencia de tripsina a una concentración de tan sólo 8,3 × 10 -13 M y después de una incubación de 5 min tiempo, la EGFP fracciones quedaron totalmente liberados presentada con un coeficiente de difusión idéntica a la de EGFP. De este modo, los resultados en términos de la cantidad de fluorescentes fVLP por fracciones obtenidas después de la enzima de tratamiento fueron similares o idénticos a los obtenidos tras el tratamiento con urea a 50 ° C (datos no presentados). En contraste, un informe anterior sobre quimérico CPV VLPs se ha llevado a cabo con la misma proporción molar de la proteasa y las VLPs, 1:1 [24]. En conjunto, los datos muestran que FCS debería ser atractivo en términos más generales, cuando los mecanismos moleculares de montaje de los diferentes VLPs se encuentran bajo estudio, por ejemplo, cuando la ingeniería viral estable vehículos para la entrega de proteínas.

Conclusión

En conjunto, los datos presentados aquí indican que es posible estudiar el montaje de una serie de truncado y fundido CPV proteínas VP2 y también para detectar desviaciones en la capacidad de estas proteínas a reunirse en VLPs utilizando FCS. Los fluorescentes no VP2-14, VP2-23, VP2-40 proteínas, además de toda la longitud VP2-se construye todos capaces de formar VLPs. Además, las proteínas fluorescentes de EGFPVP2-23, EGFPVP2-40 y EGFP-VP2 también pudieron reunirse en VLPs. Curiosamente, la VP2-40 permite construir una mejor adaptación de la fusión del polipéptido que se muestra más en la superficie de la cápside-como estructura. Hubo algunos proteólisis, como el número medio de moléculas fluorescentes fusión por partículas fue de 10, el máximo teórico de 12. Los 14 aminoácidos supresión de VP2 fundido a EGFP causado un cambio drástico en las propiedades, que fue detectado por FCS. En conclusión, los resultados muestran que FCS ofrece una plataforma novedosa para el estudio de montaje de las proteínas virales y, por tanto, es una valiosa tecnología que pueden utilizarse para el desarrollo estratégico de VLPs.

Métodos
Plásmido construcciones

Las secuencias de ADN de genes VP2 truncado VP2-14, VP2-23, y VP2-40 fueron amplificados por PCR utilizando pVP2FastBac [19] como una plantilla con 5 a partir de secuencias de ADN correspondientes a 14, 23, y 40 aminoácidos, respectivamente , Aguas abajo de la carretera N-terminal de VP2. El sentido de oligonucleótidos para VP2-14, VP2-23, y VP2-40 fueron 5'-GGT GGA TCC ATG GTC AGA AAT GAA AGA GC-3 ', 5'-GCT GGA TCC ATG AAC GGG GGG TC-3' y 5'-GTG GGA TCC ATG TCT GGT ACG ACT TTC AAT AAT C-3 ', respectivamente. El sentimiento anti-ADN de imprimación para VP2-14, VP2-23, y VP2-40 fue 5'-GGC CGA GAA TTC TTA ATA TTT TAA AGG TCT TGC-3 '. Los productos PCR de los genes truncados VP2 fueron digeridos con Bam HI y Eco RI y clonado en pFastBacI (Gibco BRL, Grand Island, NY). Los plásmidos resultantes fueron nombrados pVP2-14FastBac, pVP2-23FastBac, y pVP2-40FastBac. La secuencia de codificación de EGFP fue amplificado tal como está descrita anteriormente [19], digerido con Bam HI y BGL II, y luego clonado en el sitio Bam HI de pVP2-14FastBac, pVP2-23FastBac, y pVP2-40FastBac. Por EGFP, el primer sentimiento fue de oligonucleótidos 5'-GTC TCC GGA ATG GTG AGC AAG GGC G-3 'y la anti-sentido oligonucleótido cebador 5'-TAA AGA TCT CAG GTA CTT CTC GTC CA-3'. Los plásmidos resultantes fueron designados pEGFP-VP2-14FastBac, pEGFP-VP2-23FastBac y pEGFP-VP2-40FastBac.

Recombinante baculoviruses

Dos juegos de baculoviruses llamado recombinante VP2 Ac-14, Ac VP2-23, VP2 y Ac-40, así como Ac EGFP-VP2-14, Ac EGFP-VP2-23, EGFP y Ac-VP2-40 se generaron utilizando el Bac - Bac sistema (Gibco BRL) [43, 44]. Generación de la recombinante baculoviruses Ac EGFP-VP2 y Ac VP2 se ha descrito anteriormente [19, 45].

Producción y purificación de proteínas recombinantes

Producción y purificación de EGFP-VP2, EGFP-VP2-14, EGFP-VP2-23, y EGFP-VP2-40 proteínas recombinantes se realizó esencialmente tal como está descrita anteriormente [19]. En resumen, 8 × 10 7 de S f 9 celdas (Gibco BRL) en un volumen de 40 ml HyQ SFX medio (HyClone Inc, Logan, UT) estaban infectados con el virus recombinante, EGFP Ac-VP2, EGFP Ac-VP2 -14, EGFP Ac-VP2-23 y Ac EGFP-VP2-40 a una multiplicidad de infección (MOI), de 10. A las 72 h después de la infección (pi), 500 μ l de las muestras fueron analizadas por SDS-PAGE, immunoblotting y microscopía confocal (véase más adelante). Las células fueron recopilados por la baja velocidad de centrifugado (1 000 × g, 10 min, 4 ° C), resuspendido en hielo durante 15 min a 4 ml de helada TENT buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl , PH 7,5) que contiene 0,2% Tritón X-100, 2 mM PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo), 10 μ g / ml de aprotinina, 10 μ g / ml leupeptina y 10 μ g / ml pepstatin (Sigma-Aldrich, St Louis, MI). Después de la aclaración (10 000 × g, 20 min, 4 ° C), 1 ml de muestras de los sobrenadantes se cargaron en 10 - 40% de sacarosa en tiendas de gradientes de amortiguación preparada con un gradiente Master ™ (BioComp Instruments, Inc Canadá) y 37 ml ultracentrifugación tubos (Beckman Instruments, San Diego, CA). Las muestras fueron ultracentrifuged (27 000 × g, h 12, 4 ° C) y opalescente o bandas fluorescentes se detectaron visualmente visual o bajo la luz ultravioleta y extrajeron. Las bandas fueron diluidas en PBS, ultracentrifuged (200 000 × g, 1 h, 4 ° C), y "pellets" resultante resuspendido en 500 μ l helada TENT buffer. Por otra parte, los gradientes se fraccionado en partes alícuotas de 1 ml con una bomba peristáltica seguido por la detección de proteínas recombinantes en cada fracción de dot blot usando anti-cápside de anticuerpos CPV (A4E3) o las mediciones de fluorescencia (485 nm de excitación, emisión de 535 nm, 1 s tiempo de detección, Wallac VICTOR 2 D Fluorometer, Perkin Elmer Life Sciences Inc, MA).

FCS configuración

A confocal de fluorescencia correlación espectroscopio, ConfoCorII (Carl Zeiss, Jena, Alemania) se utilizó para llevar a cabo experimentos de la FCS. Concentración se realizó en LabTek ® II (Nalge Nunc International, Naperville, IL) 8 cámara de cultivo celular borosilicato placas de 200 nm por encima de la superficie de vidrio revestida, y la fluorescencia se obtuvieron a través de una Zeiss C-Apochromat 40 × 1,2 NA objetivo de inmersión en agua. Una banda de emisión de pasar el filtro (530-600 nm) a través del mismo objetivo se utilizó para filtrar los fotones emitidos de los fotones de excitación.

FCS análisis de química o enzimáticamente tratados proteínas recombinantes

Anteproyecto FCS autocorrelación mediciones de 10 × 20 s se llevaron a cabo mediante la dilución de las fracciones de la gradiente de sacarosa a 1:200 en PBS FCS muestra la cámara. Un componente de un modelo para el análisis de autocorrelación fue empleado para las mediciones del tamaño de las partículas. Las fracciones que contiene partículas de difusión con un tamaño correspondiente a los nativos VP2 VLPs, que tengan el mejor se adapte a la autocorrelación de curvas, se seleccionaron para su posterior análisis. Por EGFP-VP2-14, no sacarosa gradiente fracciones contenidas VLPs detectables por inmunotransferencia (Fig. 5] o partículas que figuran con el tamaño de VLPs cuando detectados por FCS. En lugar de ello, las fracciones con el más alto índice de contar en FCS, 30-35, se combinaron para un análisis más detallado. Para las mediciones de partículas de serie, que contienen fracciones 17-20 fluorescentes VLPs fueron elegidos y además se incubarán durante 15 minutos a 50 ° C en presencia de 6 M Urea seguido por análisis de FCS. Además, las muestras correspondientes (capsids) se diluye a concentraciones nM 2 seguido por el tratamiento con 8,3 × 10 -13 M tripsina (5 min) y luego analizados por el FCS. Los promedios y las desviaciones estándar para la difusión veces fueron medidos y calculados. Difusión veces se utilizaron para calcular el coeficiente de difusión D para la muestra, utilizando el coeficiente de difusión de la hora de rodamina 6G (Rh6G) con un tinte coeficiente de difusión 2,8 × 10 -6 cm 2 s -1, y el tiempo de difusión de la muestra [46]. FCS análisis se llevó a cabo en 15 × 40 s 6 mediciones repetidas veces para cada muestra. Todas las muestras fueron almacenadas en hielo antes de las mediciones, equilibrado y 10 minutos a temperatura ambiente (20 ° C) antes de FCS análisis. Hidrodinámica propiedades de las partículas se calcularon utilizando la Stokes-Einstein ecuación D = kT / 6 π r η, donde D es el coeficiente de difusión, r es el radio hidrodinámico, η es la viscosidad del solvente, T es la temperatura y k es la constante de Boltzman.

SDS-PAGE y immunoblotting

Las muestras [47] se separaron el 12% losa geles y trasladado a las hojas de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell BioScience, Inc, Keene, NH) para el análisis de inmunoblot. Las proteínas se identificaron con conejo policlonal anti-VP2 anticuerpos (Cornell # 2 de anticuerpos, tipo regalo del doctor Colin Parrish), un mouse monoclonal anti-CPV cápside anticuerpos A4E3 (dot-blot), o con conejo policlonal anti-GFP anticuerpos (Promega , Madison, WI). Las proteínas se visualizaron con la AP-conjugado de cabra anti-IgG de conejo (Promega) y con NBT (nitro azul tetrazolium) y BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolylphosphate; Sigma-Aldrich). Peso molecular de marcadores fueron BioRad.

Immunolabeling de S f 9 células

Las células infectadas de insectos fueron recolectados por centrifugación a baja velocidad (800 × g, 1 min, RT), lavados dos veces con PBS (pH 7.4) con anterioridad a la fijación en 50 μ l de 4% PFA-PBS (20 min, RT) y, a continuación, pildoradas ( × 10 000 g, 1 min, RT). Antes de inmunoticción, las células fueron enjuagarse dos veces con 50 μ l de glicina 0,15% en PBS con una centrifugación (10 000 × g, 1 min, RT) entre cada lavado. Fija las células se permeabilized (1% BSA, 0,1% Tritón X-100 y 0,01% azida sódica en PBS) durante 20 minutos a RT y pildoradas (10 000 × g, 1 min, RT). Un ratón monoclonal anti-cápside de anticuerpos, A4E3 (especie de regalo del doctor Colin Parrish) se utilizó para identificar VP2. Después de la incubación con el anti-cápside de anticuerpos, las células fueron lavadas 3 veces en 50 μ l de PBS y las proteínas virales probaron con un conjugado fluorescente anticuerpo secundario (de cabra AlexaFluor ® 633 anti-ratón de anticuerpos, sondas moleculares, Eugene, Oregón). Después de coloración fluorescente, las células fueron lavadas dos veces con 50 μ l de PBS y pildoradas (10 000 × g, 1 min, RT). Por último, las células fueron incorporados en 2-7 μ l de MOWIOL-DABCO (30 mg / ml, Sigma-Aldrich) y se refieren a la izquierda se desliza por 2-24 h a 4 ° C antes del examen en virtud de un escaneo láser confocal de fluorescencia microscopio (Axiovert 100 M, LSM510, Carl Zeiss, Jena, Alemania), con excitación y de emisión apropiados para la configuración de los tintes utilizados de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Microscopía electrónica

Las muestras para microscopía electrónica (EGFP-VP2, EGFP-VP2-14, EGFP-VP2-23, EGFP-VP2-40, VP2, VP2-14, VP2-23, y VP2-40) fueron elaborados a partir de las muestras obtenidas de sacarosa gradiente de purificación. Resuspendido muestras (6 μ l) se aplicaron al carbono revestido de cobre y redes de izquierda a ponerse de pie por 1-2 min a TA. Tras el exceso de líquido se borró de distancia, las grandes redes se tiñen negativamente con 6 μ l 2% de potasio phosphotungstate, pH 6. El exceso de líquido es más alejados y las grandes redes se dejará secar a RT. Las muestras fueron examinadas en 60 kV en virtud de un JEOL JEM-1200 EX microscopio electrónico de transmisión (Jeol Ltd Tokio, Japón).

Modelización molecular

Un modelo molecular de EGFP-VP2-40 fue construido sobre la base de las estructuras cristalinas de EGFP (AP 1EMF) y CPV VP2 (AP 4DPV) con una en torno a 14 subunidades de VP2 (AP 1C8D), para formar a 15-mer alrededor de un 5 eje veces, a través de la cual el N-terminal de VP2-40 sobresale, llevando el dominio EGFP. Los modelos fueron construidos en Insight II (Accelrys) y los gráficos fueron prestados utilizando PyMOL 0.98 (Delano, W.2. PyMOL El sistema de gráficos moleculares de 2002).

Autores de las contribuciones

LG encargada de redactar y ultimar el manuscrito. LG planificado y realizado el baculovirus construcciones genéticas y la generación de la recombinante baculoviruses. LG también se encarga de la producción, purificación y análisis de las proteínas recombinantes, así como, de electrones y microscopía confocal de datos. JT ayudó con la purificación y análisis de las proteínas recombinantes, llevado a cabo todos los experimentos FCS y ayudó con la redacción del manuscrito. OV ayudado en el desempeño de los experimentos de microscopía electrónica, mientras que TS y CC asistida en la clonación y la generación de la recombinante baculoviruses. AM contribuido en la construcción de la segunda serie de baculoviruses y EK ayudó con la producción y purificación de proteínas recombinantes. DW diseñado los modelos estructurales de la cápside recombinante estructuras y colaboró en la interpretación de los resultados. MV participó en la FCS la recopilación de datos, contribuyeron a la interpretación de los resultados y finalizar el manuscrito. CO-B, siempre y orientación en relación con el diseño experimental, así como en la preparación y la finalización de este manuscrito.

Agradecimientos

Queremos dar las gracias a Colin Parrish para la CPV anticuerpos específicos, Paavo Niutanen valiosa para la asistencia fotográfica, así como a Pirjo Käpylä por su excelente asistencia técnica. También damos las gracias a Sanna Kirjavainen para ayudar con FCS y Klaus Weisshart valiosa para los debates. Este estudio fue apoyado por la K. Albin Johansson Foundation, la Fundación Ida Montin, el finlandés Fundación de Investigación de Enfermedades Virales, la Instrumentarium Science Foundation, Fundación de Investigación de Orion Corporation, y la Academia de Finlandia (contrato # 710216).